酶工程简介
酶工程（enzyme engineering）是在1971年第一届国际酶工程会议上才得到命名的一项新技术。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。
根据研究和解决问题的手段不同将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。
第一章 酶学概论（Enzyme）
新陈代谢是生命活动的基础，是生命活动最重要的特征。而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶催化
下进行的。生命的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关，可以说，没有酶的参与，生命活动一
刻也不能进行。
第一节 酶的一般概念
一、酶的概念及化学本质
（一）?? 酶的概念：酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂。
（二）?? 酶的化学本质：
绝大多数酶是蛋白质,少数是核酸RNA，后者称为核酶。
本章主要讨论以蛋白质为本质的酶。
二、酶的组成与分类
（一）?? 根据酶的组成成分，酶可分为：单成分酶（单纯酶）、多成分酶（复合酶）
单纯酶(simple enzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。
复合酶(conjugated enzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：
全酶
酶 蛋 白
辅助因子
(结合蛋白质)
(蛋白质部分)
(非蛋白质部分)
酶的辅助因子可以是金属离子，也可以是小分子有机化合物。常见酶含有的金属离子有K+、Na+、Mg2+、Cu2+、(或Cu+)、Zn2+和Fe2+(或Fe3+)等。它们或者是酶活性的组成部分；或者是连接底物和酶分子的桥梁；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。小分子有机化合物是一些稳定的小分子物质，其主要作用是在反应中传递电子、质子或一些基团，常可按其与酶蛋白结合的紧密程度不同分成辅酶和辅基两大类。辅酶(coenzyme)与酶蛋白结合疏松，可以用透析或超滤方法除去；辅基(prosthetic group)与酶蛋白结合紧密，不易用透析或超滤方法除去，辅酶和辅基的差别仅仅是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，而无严格的界限。
大多数维生素(特别是B族维生素)是组成许多酶的辅酶或辅基的成分。它们的化学结构式见下章维生素。体内酶的种类很多，而辅酶(基)的种类却较少，通常一种酶蛋白只能与一种辅酶结合，成为一种特异的酶，但一种辅酶往往能与不同的酶蛋白结合构成许多种特异性酶。酶蛋白在酶促反应中主要起识别底物的作用，酶促反应的特异性、高效率以及酶对一些理化因素的不稳定性均决定于酶蛋白部分。常见的辅酶，如下表所示：
辅酶形式
主要作用
所含B族维生素
硫胺素焦磷酸酯(TPP)
α-酮酸氧化脱羧、酮基转换作用
硫胺素(B1)
6,8-二硫辛酸
α-酮酸氧化脱羧
硫辛酸
辅酶A(CoA)
酰基转换作用
泛酸
黄素单核苷酸(FMN)
黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)
氢原子转移
氢原子转移
核黄素(B2)
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)
氢原子转移
氢原子转移
尼克酰胺(PP)
磷酸吡哆醛
氨基酸代谢
吡哆素(B6)
生物素
羧化作用
生物素(H)
四氢叶酸
"一碳基团"转移
叶酸
5-甲基钴铵素
5-脱氧腺苷钴铵素
甲基转移
钴胺素(B12)
(二)根据酶的结构特点及分子组成形式分为：
1.单体酶 ：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶属于此类。
2.寡聚酶：由几条或几十条多肽链组成，每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。如己糖激酶、乳酸脱氢酶，均含四个亚基， 谷氨酸脱氢酶含六个亚基。
3.多酶复合体：若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应，如丙酮酸氧化脱羧酶复合体，含三个酶六个辅助因子；脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。
(三)根据酶的存在状态分为：胞内酶、胞外酶
1.胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。
2.胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。
三.酶催化作用的特性
（一）酶与普通催化剂的共性：
1.只能催化热力学上允许进行的反应，对于可逆反应，酶只能缩短反应达到平衡的时间，但不改变平衡常数；
2.酶也是通过降低化学反应的活化能来加快反应速度；
3.酶在反应中用量很少，反应前后数量、性质不变。
（二）酶催化作用的特性：指酶不同于一般的催化剂的性质。
1、高度专一性：
酶的专一性：也称为酶的特异性(specificity)，它是指酶对所作用底物(substrate)的选择性。根据酶对底物的选择方式不同，酶的专一性分为：
（1）、绝对专一性(absolute specificity)：指一种酶只选择一种底物作用，如脲酶。
（2）、相对专一性(relative specificity)：指一种酶选择一类底物作用。根据酶选择的对象不同又分为：
键专一性(bond specificity)：指酶对所作用键的选择性，如脂肪酶。
基团专一性（族专一性,group speicificity）：指酶对所作用的键及键一侧的基团的选择性，如α-D-葡萄糖苷酶，胰蛋白酶。
（3）、光学专一性(optical specificity )：指酶对所作用底物立体构型的选择性，如L-氨基酸氧化酶。
（4）、几何专一性(geometrical specificity )：指酶对所作用底物顺反异构的选择性，如顺乌头酸酶。
2、高效性：酶比一般的普通催化剂效率高106-1013倍。
3、反应条件温和
4、易变性
5、酶的活力（activity）受多种因素的调节与控制
四、酶的命名与分类
（一）酶的命名：通常采用习惯命名法，主要根据以下几个原则：
1、根据酶作用的底物来命名：如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等；
2、根据酶催化反应的性质来命名：如脱氢酶、脱羧酶、水解酶等；
3、根据酶的来源、作用条件等来命名：如细菌淀粉酶、碱性磷酸酯酶、胃蛋白酶等。
从上述可知，酶的习惯命名法不够系统，不够准确，难免会出现一酶多名或一名多酶的现象。为此1961年国际酶学委员会（Enzyme Commission，EC）提出了系统命名法，系统命名法规定，酶的名称包括两部分：底物名称和反应类型，如果反应中有多个底物，每个底物均需列出（水解反应中的水可省略），底物名称之间用“：”隔开。若底物有构型，也需标出，如L—丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶。
(二)、酶的系统分类方法：根据酶所催化反应的性质，由酶学委员会规定，将酶分为六大类：
1.???? 氧化还原酶类 催化底物的氧化还原反应，如脱氢酶、氧化酶等。
2.???? 转移酶类 催化底物之间基团的转移反应，如氨基转移酶、激酶、甲基转移酶、羧基转移酶等。
3.???? 水解酶类 催化底物的水解反应，如蛋白酶、肽酶、脂肪酶、淀粉酶等。
4.???? 裂合酶类 催化底物裂解或缩合反应，如脱水酶、脱氨酶、脱羧酶、醛缩酶等。
5.???? 异构酶类 催化同分异构体的底物之间相互转换，如磷酸甘油酸变位酶、磷酸己糖异构酶。
6.???? 合成酶类 也称连接酶类，催化两种或两种以上化合物合成一种化合物的反应。反应需吸收能量，通常与ATP的分解相偶连，ATP分解产生能量用于合成反应。
（三）酶的系统编号：
根据上述酶的系统分类方法，国际酶学委员会还对每个酶做了统一编号，一个酶只有一个编号，因此不会混淆。酶的系统编号由“EC”加四个阿拉伯数字组成，每个数字之间以“.”隔开。“EC”是国际酶学委员会的缩写，这四个数字的含义分别是：第一个数字代表大类，第二个数字代表亚类，第三个数字是亚亚类，第四个数字是酶在亚亚类中的序号。如：EC1.1.1.27（乳酸：NAD+氧化还原酶）。
第二节 酶的结构与功能的关系
一、 酶的活性中心与必需基团
（一）酶的活性中心
酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质量较小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用。与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心(active center)。酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。酶的活力中心通常包括两部分：与底物结合的部位称为结合中心，结合中心决定酶的专一性；促进底物发生化学变化的部位称为催化中心，它决定酶所催化反应的性质以及催化的效率。有些酶的结合中心与催化中心是同一部分。
酶活性中心示意图
（二）酶的必需基团(essential group)
酶的分子中存在着许多功能基团，例如，-NH2、-COOH、-SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。必需基团可分为四种：
1.???? 接触残基（ contact residue）：直接与底物接触的基团，它们参与底物的化学转变，是活性中心的主要必需基团。这些基团中有的与底物结合称为结合基团(binding group)，有的催化底物发生化学变化称为催化基团(catalytic group)。活性中心中有的必需基团可同时具有这两方面的功能。还有些必需基团虽然不参加酶的活性中心的组成，但为维持酶活性中心应有的空间构象所必需，这些基团是酶的活性中心以外的必需基团。
2.???? 辅助残基(auxiliary residue):这种残基既不直接与底物结合，也不催化底物的化学反应，但对接触残基的功能有促进作用。它可促进结合基团对底物的结合，促进催化基团对底物的催化反应。它也是活性中心不可缺少的组成部分。
3.???? 结构残基（structure residue）：这是活性中心以外的必需基团，它们与酶的活性不发生直接关系，但它们可稳定酶的分子构象，特别是稳定酶活性中心的构象，因而对酶的活性也是不可缺少的基团，只是起间接作用而已。
4.???? 非贡献残基（noncontribution residue）：酶分子中除上述基团外的其它基团，它们对酶的活性“没有贡献”，也称为非必需基团。这些基团对酶活性的发挥不起作用，它们可以被其他氨基酸残基取代，甚至可以去掉都不会影响酶的催化活力。但这些基团并不是真正意义上的“非必需”基团，它们可能在系统发育的物种专一性方面、免疫方面或者在体内的运输转移、分泌、防止蛋白酶降解的方面起一定作用。如果没有这些基团，酶的寿命、酶在细胞中的分布等方面受到限制。这些基团的存在也可能是该酶迄今未发现的新的活力类型的活力中心。
（三）.酶活性中心证明方法
1.切除法
对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有
活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。
2.化学修饰法
选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结
合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、
咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性
的修饰剂不多。
判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基
团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。
缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的
正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂
对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基
团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。
根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为：
（1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可
与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。
此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标
准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二：底物或竞争性抑制剂保护下可
防止修饰剂的抑制作用。
（2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。
如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而
使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，
只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。
3.亲和标记法：
根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作
为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与
酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：
N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对
甲苯磺酰—苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）。
4.X—射线衍射法：
把一纯酶的X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。
(四)酶的活性中心的一级结构
应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。
对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相似性。见下表所示：
酶
氨基酸顺序
胰蛋白酶（牛）
胰凝乳蛋白酶（牛）
弹性蛋白酶（猪）
凝血酶（牛）
蛋白酶（S.griseus）
—天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬-
-丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮-
-丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮-
-天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙
-苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫
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从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心在种系进化上有严格的保守性。
二、酶的活性与高级结构的关系
酶的活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的保证，高级结构破坏，酶失去活性。
三、酶原激活
有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称为酶原(zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。酶原激活实际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。
胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。
某些酶原的激活过程
酶原
激活条件
活化的酶
水解掉的肽段
胃蛋白酶原
胃蛋白酶
六肽
胰蛋白酶原
胰蛋白酶
六 肽
糜蛋白酶原A
α-糜蛋白酶
两个二肽
羧肽酶原A
羧肽酶A
几个碎片
弹性蛋白酶原
弹性蛋白酶
几个碎片
例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第6位赖氨酸与第7位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。
除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类，也都以酶原的形式存在。
胰蛋白酶原激活示意图
糜蛋白酶原的激活过程 胃蛋白酶原的激活过程
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胃蛋白酶原的激活过程
酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶
在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。
酶催化机理
酶的催化机理是解释酶催化特性的理论，如：酶为什么能催化化学反应、酶是如何催化化学反应的、酶为什么有专一性、酶为什么有高效性等。
一、酶为什么能催化化学反应
一个化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须具备一定能量即分子处于活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应就越快。因此，设法增加活化分子数量，是加快化学反应的唯一途径。增加反应体系的活化分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，如通过加热、加压、光照等，另一途径是降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能，下图1所示
图1 非催化过程和催化过程自由能的变化
二、酶如何降低化学反应的活化能 中间产物学说
中间产物学说认为：酶在催化化学反应时，酶与底物首先形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了反应速度。
S + E → ES → P + E
底物 酶 中间产物 产物
中间产物学说已经得到一些可靠的实验依据。如，用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物酶参加反应时，单纯的酶的吸收光谱与加入了第一个底物H2O2后确实产生了变化。
三、酶的高效性的解释
1、底物与酶的邻近效应和定向效应
2、底物分子的形变和扭曲
3、共价催化
4、酸碱催化
5、活性部位的微环境的影响
四、 酶的专一性的解释
（一）锁与钥匙学说：如图所示
锁与钥匙学说示意图
（二）诱导契合理论 如下图所示
（三）结构性质互补假说
该学说认为酶同底物结合的专一性，与底物结构和酶的活性中心的空间结构相关，二者的结构是互补的。如果底物是解离的，则酶的活性中心的空间结构必然带相反的电荷才能很好结合。而且底物同酶活性中心的极性也必然相同。
第四节 酶促反应动力学
酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。
一、 底物浓度对反应速度的影响
底物浓度对酶反应速度的影响是在酶的浓度一定的条件下测定的，底物浓度对反应速度影响呈现矩形双曲线(rectangular hyperbola)。
底物浓度对反应初速度的影响
在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。
(一)米氏方程
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Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，Km是米氏常数，VO是在某一底物浓度时相应的反应速度。当底物浓度很低时，[S]《Km,则V≌Vmax[S]/Km，反应速度与底物浓度呈正比。当底物浓度很高时，[S]》Km，此时V≌Vmax，反应速度达最大速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。
(二)米氏常数的意义
1.物理意义：Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
2. Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。
3.Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M之间。
(三)Km在实际应用中的重要意义
1.鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。
2.判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物，就有几个Km值，其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解（Km=28mol/L），也可催化棉子糖水解（Km=350mol/L）,两者相比，蔗糖为该酶的天然底物。
3.计算一定速度下的底物浓度：如某一反应要求的反应速度达到最大反应速度的99%，则[S]=99 Km
4.了解酶的底物在体内具有的浓度水平：一般地，体内酶的天然底物的[S]体内≈Km，如果[S]体内《Km，那么VO《Vmax,细胞中的酶处于“浪费“状态，反之，[S]体内》Km，那么VO≈Vmax，底物浓度失去生理意义，也不符合实际状态。
5.判断反应方向或趋势：催化正逆反应的酶，其正逆两向的反应的Km不同，如果正逆反应的底物浓度相当，则反应趋向于Km小对应底物的反应方向。
(四)Km求法：
双倒数作图(doublereciprocal plot or LineweaverBurk plot)
将米氏方程两边取倒数，可转化为下列形式：
1／VO=Km／Vmax·1／[S]+1／Vmax
从下图可知，1/V0对1/[S]的作图得一直线，其斜率是Km/ Vmax,，在纵轴上的截距为1/Vmax,横轴上的截距为-1/Km。此作图除用来求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面还有重要价值。
双倒数作图法
二、酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时，速度与酶的浓度呈正比。
酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V0=k3[ES]，故反应速度增加。
三、温度对酶促反应速度的影响
酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应的Q10为2-3，而酶促反应的Q10为1-2。
在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温度（optimum temperature Tm）,.一般动物组织中的酶其最适温度为35-40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30-60℃，少数酶可达60℃以上，如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。
温度对酶促反应速度的影响机理：
1.温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应速度增加。
2.温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。
最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的，它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。
四、pH对酶促反应速度的影响
大多数酶的活性受pH影响显著，在某一pH下表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。酶表现最大活力的pH称为酶的最适pH(optimumpH pHm)。典型的酶速度—pH曲线是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度—pH曲线并非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度—pH曲线。胃蛋白酶的速度-温度曲线如下图。
胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线
pH对酶促反应速度的影响机理：
1.pH影响酶和底物的解离:酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。
2.pH影响酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象，或引起酶的变性失活。
动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。
一些酶的最适pH
酶
最适pH
酶
最适pH
酶
最适pH
胃蛋白酶
1.8
过氧化氢酶
7.6
延胡索酸酶
7.8
胰蛋白酶
7.7
精氨酸酶
9.8
核糖核酸酶
7.8
最适pH不是酶的特征性常数，它受底物浓度、缓冲液的种类和浓度以及酶的纯度等因素的影响。
五.激活剂对酶反应速度的影响
能使酶活性提高的物质，都称为激活剂(activator)，其中大部分是离子或简单的有机化合物。如Mg++是多种激酶和合成酶的激活剂，动物唾液中的α-淀粉酶则受Cl-的激活。
通常，酶对激活剂有一定的选择性，且有一定的浓度要求，一种酶的激活剂对另一种酶来说可能是抑制剂，当激活剂的浓度超过一定的范围时，它就成为抑制剂。
六.抑制剂对反应速度的影响
凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等，不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。
（一）不可逆性抑制作用(irreversible inhibition)
不可逆性抑制作用的抑制剂，通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性，按其作用特点，又有专一性及非专一性之分。
1.非专一性不可逆抑制
抑制剂与酶分子中一类或几类基团作用，不论是必需基团与否，皆可共价结合，由于其中必需基团也被抑制剂结合，从而导致酶的抑制失活。某些重金属(Pb++、Cu++、Hg++)及对氯汞苯甲酸等，能与酶分子的巯基进行不可逆适合，许多以巯基作为必需基团的酶(通称巯基酶)，会因此而遭受抑制，属于此种类型。用二巯基丙醇(british antilewisite,BAL)或二巯基丁二酸钠等含巯基的化合物可使酶复活。
2.专一性不可逆抑制
此属抑制剂专一地作用于酶的活性中心或其必需基团，进行共价结合，从而抑制酶的活性。有机磷杀虫剂能专一作用于胆碱酯酶活性中心的丝氨酸残基，使其磷酰化而不可逆抑制酶的活性。当胆碱酯酶被有机磷杀虫剂抑制后，乙酰胆碱不能及时分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状。解磷定等药物可与有机磷杀虫剂结合，使酶和有机磷杀虫剂分离而复活。
(二)可逆性抑制(reversible inhibition)
抑制剂与酶以非共价键结合，在用透析等物理方法除去抑制剂后，酶的活性能恢复，即抑制剂与酶的结合是可逆的。这类抑制剂大致可分为以下二类。
1.竞争性抑制(competitive inhibition)
(1)含义和反应式
抑制剂I和底物S对游离酶E的结合有竞争作用，互相排斥，已结合底物的ES复合体，不能再结合I。同样已结合抑制剂的EI复合体，不能再结合S。
（2）特点：
A.抑制剂I在化学结构上与底物S个相似，能与底物S竞争酶E分子活性中心的结合基团，因此，抑制作用大小取决于抑制剂与底物的浓度比，加大底物浓度，可使抑制作用减弱甚至消除。
例如，丙二酸、苹果酸及草酰乙酸皆和琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。
B.竞争性抑制剂双倒数曲线，如下图所示：
竞争性抑制
有竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于纵坐标I/Vmax处，但横坐标的截距，因竞争性抑制存在变小，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的最大速度Vmax，而使Km值变大。
很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。
磺胺药物的抑菌作用
2.非竞争性抑制(non-competitive inhibition)
(1)含义和反应式
抑制剂I和底物S与酶E的结合完全互不相关，既不排斥，也不促进结合，抑制剂I可以和酶E结合生成EI，也可以和ES复合物结合生成ESI。底物S和酶E结合成ES后，仍可与I结合生成ESI，但一旦形成ESI复合物，再不能释放形成产物P。
（2）特点：
A.I和S在结构上一般无相似之处，I常与酶分子上结合基团以外的化学基团结合，这种结合并不影响底物和酶的结合，增加底物浓度并不能减少I对酶的抑制程度。
B.非竞争性抑制剂的双倒数曲线：有非竞争性抑制剂存在的曲线与无抑制剂的曲线相交于横坐标- 1/Km处，但纵坐标的截距，因竞争性抑制存在变大，说明该抑制作用，并不影响酶促反应的Km值，而使Vmax值变小，如下图所示：
非竞争性抑制
3.反竞争性抑制
（1）含义和反应式
反竞争性抑制剂必须在酶结合了底物之后才能与酶与底物的中间产物结合，该抑制剂与单独的酶不结合。
（2）特点：反竞争性抑制剂存在下，Km、Vmax都变小。
第五节 酶的分离提纯及活力测定
一.酶的分离提纯
(一)酶在细胞中的分布：
胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。
胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。
(二)分离材料：
动植物原料或微生物的发酵液。微生物发酵液是用于分离酶的最常用材料，因为微生物种类多，繁殖快，培养时间短，含酶丰富。由微生物发酵产生的酶或其它生物组织中的酶因含有大量的其它物质，所以必须经过分离、提纯、结晶等阶段才可做实际应用。
对于某种酶的具体制备方案，应通过了解酶的来源、性质及纯度需要来确定，无固定的方案。
（三）原则：
在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。
（四）分离提纯：
1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。
胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。
胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。
2.酶的纯化：
纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。
（1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：
A．盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。
B．有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。
（2）酶的纯化方法：
有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
3.酶的结晶：
纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。
4.酶的保存：一般在-20℃以下低温保存。
二.酶活力的测定
定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。
酶活力的测定：实际上是酶定量测定的方法，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。
（一）酶活力的概念：指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。
（二）酶的活力单位：1961年国际生化协会酶学委员会统一规定，酶的国际单位（IU）规定为：在最适反应条件（温度25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量（或1分钟内转化底物生成1微摩尔产物的酶量）称为1标准单位。
测定条件：最佳的反应条件，如最适的Tm（或25℃）、pHm、[S] 》[E]、初速度下。
1972年国际生化协会又推荐一种新单位，即Katal(Kat)单位。规定：在最适温度下，每秒钟能催化1摩尔底物转化为称为所需要的酶量定义为1 Kat。1 Kat=60×106 IU.
(三)酶的比活力：每单位酶蛋白所含的活力单位数。对固体酶：用活力单位/毫克酶蛋白、或活力单位/毫克酶蛋白氮来表示，对液体酶：用活力单位/毫升酶液来表示。很明显，比活力越大，酶的活力越大。
（四）、酶活力的测定方法
1、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质或产物有紫外吸收的能力可采用此法。
2、测压法：产物中有气体，测气压增加量。
3、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。
4、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂反应生成荧光产物可用此法。
5、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。
除了以上方法外，还可根据产物的性质采用其它方法。
第六节 酶活性的调节
一、变构酶与变构调节
（一）概念
变构酶又称为别构酶，指酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地共价结合后，引起酶的构象的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作用称为变构调节(allosteric regulation)，具有变构调节的酶称变构酶(allosteric enzyme)，凡能使酶分子发生别构作用的物质称为变构剂(effector)。变构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在同一亚基的两个不同部位。
（二）、变构酶作用特点
1、一般变构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现正协同效应(positivecooperative effect)，或出现负协同效应（negative cooperative effect）。
2、正协同效应的变构酶其速度—底物浓度曲线呈S形，即底物浓度较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度后，酶活性显著加强，最终达到最大值Vmax。如大肠杆菌的天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase）对底物天冬氨酸的结合表现为正协同效应。
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3、负协同效应的变构酶其速度—底物浓度曲线为类似双曲线，底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但底物浓度明显增加时，其反应速度无明显变化。如3-磷酸甘油醛脱氢酶对NAD+的结合为负协同效应，其意义在于无论细胞内酶的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行以满足细胞的基本需要。
4、变构酶除活性中心外，存在着能与变构剂作用的亚基或部位，称调节亚基(或部位)，变构剂与调节亚基以非共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构剂称变构激活剂(allosteric activitor)，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减弱的变构剂称变构抑制剂(allosteric inhibitor)，能使S形曲线右移。例如，ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADP、AMP为其变构激活剂。
5、由于变构酶动力学不符合米－曼氏酶的动力学，所以当反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示，而代之以K0.5S表示。
正协同效应的变构酶底物活性曲线
⊙不加变构剂 加变构激活剂 加变构抑制剂
（三）、生理意义
1、在正协同效应的变构酶的S形曲线中段，底物浓度稍有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。
2、变构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。
例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可通过变构激活剂AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。
二、共价调节酶
1、概念：
也称共价修饰酶，指一类可在其它酶的作用下其结构通过共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalent modification regulation)，这类酶称为共价修饰酶(prosessing enzyme)。
一些酶的巯基发生可逆的氧化还原修饰，一些酶以共价键与磷酸、腺苷等基团的可逆结合，都会引起酶结构的变化而呈现不同的活性。酶的共价修饰是体内代谢调节的另一重要的方式。
2、特点：
共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式，两种形式之间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸化酶b激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化.
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目前已发现有几百种酶被翻译后都需要进行共价修饰，其中一部分处于分支途径，对其代谢流量起调节作用的关键酶，属于这种酶促共价修饰系统。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。
第七节 重要的酶
一、同工酶
同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH），具有多种分子组成形式：LDH5（M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2（MH3）、LDH1（H4）。
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LDH同工酶有组织特异性，LDH1在心肌含量高，而LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相对含量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态，临床上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的依据。
同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、和医学中均占有重要地位。
二、固定酶
用物理、化学等方法将水溶性的酶固定到特定的载体上使之成为水不溶性的酶称之为固定酶或固相酶。
三、核酶
具有催化活性的酶性RNA称为核酶。
1981-1982年Thomas R.Cech实验室在研究四膜虫(Tetrahymena thermophiea)的rRNA前体加工成熟时发现第一个有催化活力的天然rRNA，起名“ribozyme”（核酶）。随后，S.Altman 和N.R.Pace以及 T.R.Cech几个实验室又陆续发现了真正RNA催化剂。其中L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个典型的例子。L19是四膜虫rRNA前体自我剪接释放的内含子，在自身两次环化、开环反应中丢失了19个核苷酸形成的，故名L19RNA。L19RNA有催化寡聚核苷酸底物进行切割和连接反应，具有核糖核酸酶和RNA聚合酶的活性。它具有使底物分子加速反应且反应终了本身不被消耗仍具有催化活性的一般催化剂具有的特性。它对底物还具有专一性，作用C5比U5水解时快得多，对A5和G5无催化活性；此外，它还符合一般酶的米氏动力学规律,并被dC5竞争性抑制。综上所述，L19是一个真正的酶。
核酶的发现意义重大，它不仅打破了酶是蛋白质的传统观念，而且还大大促进了有关生物起源，生物进化等问题的进一步探讨。
酶的生产和分离纯化
?所有的生物体在一定的条件下都能产生多种多样的酶。酶在生物体内产生的过程，称为酶的生物合成。
?经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括微生物、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要的酶的过程，称为酶的发酵生产。
?酶的发酵生产是现在酶生产的主要方法。
?酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，以获得符合研究或使用要求的酶的过程。其主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶等。
酶的生物合成
?酶是生命活动的产物，又是生命活动必不可缺的条件之一。酶的生物合成主要是 RNA和蛋白质的生物合成过程。
RNA 的生物合成———转录
（一）RNA合成的起始
1. 原核生物启动子：约55bp,分为起始点（start site）、结合部位、识别部位。
????起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤---G,A。 ????结合部位：约6bp组成,是高度保守区,共有序列为5'-TATAAT-3' ,位于起始点上游-10。 因Tm低,DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所。 ???识别部位：约6bp组成,在-35处,为高度保守区,序列5'-TTGACA-3', s因子识别此部位。
2. 真核生物启动子（以RNA polⅡ为例）如图所示
????于-25处含AT富集区, 共有序列TATAA（TATA box） -70处含共有序列CAAT ,还含许多其它box ,例如 GC box,E-box等。 含增强子(enhancer)和静息子(silencer) ????RNA polⅠ和 RNA polⅢ与聚合酶Ⅱ所识别的启动子差异较大。
（二）? 链的延长
?转录泡：是由DNA双链,RNA聚合酶与新合成的转录本RNA局部形成的结构,它贯穿于延长过程的始终。 ???? 过程：在起始阶段形成第一个磷酸二酯键后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移动，核苷酸之间以3',5'磷酸二酯键相连，合成方向5'→3'，合成的RNA自3'末端逐步延长。合成出的RNA与DNA形成杂交分子,约12bp，因结合不紧很易脱离。
（三）? RNA合成的终止：合成移到终止信号时,酶不滑动,聚合停止,转录完成。 特点：ρ因子参与的终止：r因子与RNA产物中富含C的部位结合,并诱使RNA聚合酶构象改变停止滑动; ρ因子的解螺旋酶活性,利于RNA产物的释放。 ????其它终止方式：GC区形成的发卡结构阻碍RNA聚合酶的行进，聚U区使配对不稳定,以利于 RNA产物的释放。
蛋白质的生物合成——翻译
?以 mRNA 为模板，以各种氨基酸为底物，在核糖核蛋白体上通过各种 tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程，称为翻译。翻译是将 mRNA 分子上的碱基排列次序转变为多肽链上氨基酸排列次序的过程。
?不同的生物，其蛋白质的生物合成过程虽然有些差别，但是基本过程均包括氨基酸活化、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合成的终止及新生肽链的加工等。
（一）、蛋白质合成的起始
１、核糖体激活
起始因子（ＩＦ）激活由３０Ｓ，５０Ｓ亚基组成的无活性核糖体（７０Ｓ）。
２、起始复合物的形成 ３０Ｓ－ＩＦ３复合物，mＲＮＡ和起始氨基酰tＲＮＡ结合成起始复合物。此步需消耗ＧＴＰ。
3、５０Ｓ亚基与起始复合物的结合 起始复合物与５０Ｓ亚基结合，则起始因子ＩＦ从
３０Ｓ亚基中释放出来，作用与下一个核糖体的起始作用。
（二）、肽链延伸
包括结合，转肽，移位三个步骤。
（三）、肽链合成终止
在接肽过程中，当核糖体沿mＲＮＡ移动到终止密码子ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ时，肽链合成便自动终止。
酶生物合成的调节
根据机体内酶的合成对环境影响的反应不同，可分为两大类：一类是构成酶或组成酶；另一类酶，它的合成量受环境营养条件及细胞内有关因子的影响，有的随环境条件变化酶的合成量增加，称为诱导酶，相反，酶合成随环境条件改变而降低，称为阻遏酶。
概述
酶的诱导和阻遏是在调节基因产物阻遏蛋白的作用下，通过操纵基因控制结构基因或基因组的转录而发生的。由于经济的原则，细菌通常并不合成那些在代谢上无用的酶，因此一些分解代谢的酶类只在有关的底物或底物类似物存在时才被诱导合成；而一些合成代谢的酶类在产物或产物类似物足够量存在时，其合成被阻遏。在酶诱导时，阻遏蛋白与诱导物相结合，因而失去封闭操纵基因的能力。在酶阻遏时，原来无活性的阻遏蛋白与辅阻遏物，即各种生物合成途径的终产物（或产物类似物）相结合而被活化，从而封闭了操纵基因。
（二）诱导机制
在正常条件下，大肠杆菌细胞内的β—半乳糖苷酶的量极少，但在培养基中加入乳糖后这种酶的量就大大增加。
（三）阻遏机制
酶的阻遏与酶的诱导现象非常相似，可以用一个统一的理论来解释。在合成代谢中，产物的积累可反作用于酶的合成，即阻遏。
1.?? 终产物阻遏调节
在合成代谢中，某些合成产物 可作为辅阻遏物与调节基因产生的阻遏蛋白结合，这种结合使基因关闭，酶的合成反应也因此减慢而停止。这种由于终产物的积累而抑制酶的合成常常被称为反馈阻遏
2.?? 自身阻遏调节
组氨酸的生物合成是通过10步反应完成的，催化这10步反应的酶由9个结构基因决定，这9个结构基因和一个操纵基因构成组氨酸操纵子。
3.? 降解物阻遏
大肠杆菌在只含乳糖而不含葡萄糖的培养基上生长，必须经过一段生长停顿的时间，在这段时间内逐渐诱导形成能使乳糖进入细胞的透性酶以及分解乳糖的β—半乳糖苷酶。
酶的发酵生产
?酶的发酵生产的前提之一，是根据产酶的需要，选育到性能优良的产酶细胞。
?优良的产酶细胞应具备下列条件：（1）酶的产量高；（2）容易培养和管理；（3）产酶性能稳定；（4）利于酶产品的分离纯化；（5）安全可靠。
?目前工业上应用的酶都采用微生物细胞发酵生产。
酶生产常用微生物菌种的分离筛选
（一）常用的产酶微生物
现在大多数酶都采用微生物细胞进行发酵生产。微生物具有种类多，繁殖快，容易培养代谢能力强等特点，有不少性能优良的产酶菌株已在菌的发酵生产中广泛应用。现把常用的产酶微生物简介如下：
1. 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)
枯单芽抱杆菌是应用最广泛的产酶微生物之一。枯草杆菌是芽胞杆菌属细菌。细胞成杆状，大小为0.7~0.8 x2~3μm，单个，无荚膜，周生鞭毛，运动，革兰氏染色阳性。曲落粗糙，不透明，污白色或微带黄色。
此菌用途很广，可用于生产α—淀粉酶、蛋白酶、β—葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌BF7658是国内用于生产α—淀粉酶的主要菌株；枯草杆菌AS1.398可用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的α—淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。
2.大肠杆菌(Escherichia coli)
大肠杆菌细胞呈杆状，大小为0.5×1.0~3.0μm，革兰氏染色阴性，无芽胞，菌落从白色到黄白色，光滑闲光，扩展。
大肠杆菌可生产多种多样的酶，一般都属于胞内酶，需经过细胞破碎才能分离得到。例如，谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或生产γ—氨基丁酸；天门冬氨酸酶，催化廷胡素酸加氨生成L—天门冬氨酸；苄青霉素酰化酶，生产新的半合成青霉素或头孢霉素；β—半乳糖苷酶，用于分解乳糖；限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶，在基因工程方面应用。
3. 黑曲霉(Aspergillus niger)
黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丛黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生胞子球形，平滑或粗糙。
黑曲霉可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。如，糖化酶、α—淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核搪核酸酶、脂肪酶、纤维素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。
4.米曲霉(Aspergillus oryzae)
米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生袍子头呈放射形，顶裹囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑少数有刺，分生孢子梗长2mm左右，粗糙。
米曲霉可用于生产糖化酶和蛋白酶，这在我国传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。此外，米曲霉还用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶P1、果胶酶等。
5. 青霉(Penicillium)
青霉属半知菌纲。营养菌丝无色，淡色，有横隔，分生孢子枝亦有横隔，顶端形成扫帚状的分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形，椭圆形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。
青霉菌分布广泛，种类很多。其中产黄青霉(Penicillium chrysogenum)用于生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用于青霉素V)、果胶酶、纤维素酶Cx等；桔青霉(Penicillium citrinum)用于生产5’—磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核竣曲Sl、核酸酶P1等．
6. 木霉(Trichoderma)
木霉属于半知菌纲。生长时菌落呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程度的绿色。菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它们聚集成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形或椭圆形，透明或亮黄绿色。
木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉产生的纤维素酶中包含有Cl酶、Cx酶和纤维二糖酶等。此外，木霉中含有较强的l 7α羟化酶，常用于甾体转化。
7.根霉(Rhizopus)
根霉生长时，由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内生孢子囊孢子，孢子呈球形、卵形或不规则形状。
根霉用于生产糖化酶、α—淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的ll—α羟化酶，是用于甾体转化的重要菌株。
8. 毛霉(Mucor)
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，苗丝体上直接生山孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9. 链霉菌(Streptomyces)
链霉菌是一种放线菌。形成分校的菌丝体。有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝体不断裂，只有气生茵丝体形成孢子链。
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白面、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可用于甾体转化。
10. 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
啤洒酵母是在工业上广泛应用的酵母，细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽汁琼脂培养基上菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子囊含有l~4个圆形光亮的子囊孢子。
啤酒酵母主要用于酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。在酶的生产方面，用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等的生产。
11. 假丝酵母(Candida)
假丝酵母的细胞圆形、卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，可生成厚垣孢子、无节孢子、子囊孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上菌落呈乳白色或奶油色。
假丝酵母是单细胞蛋白的主要生产菌。在酶工程方面可用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶。假丝酵母具有烷类代谢的酶系，可用于石油发酵；具有较强的17羟基化酶，可用于甾体转化制造睾丸素等。
菌种的分离筛选与遗传育种
?菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。
?优良菌种不仅能提高酶制剂产量、发酵原料的利用效率，而且还与增加品种，缩短生产周期，改进发酵和提炼工艺等密切相关。
?自然界是生产菌种的主要来源；但直接分离得到的往往不能立即用于生产，还需经过一系列的遗传育种步骤。
?优良菌种的性状也不是固定不变的，因此在使用过程中要建立科学的管理制度和保藏方法，防止菌种的污染和退化。
从自然界分离筛选
（1）含菌样品的采集；
（2）富集培养；
（3）菌种纯化：稀释法和划线法。
菌种变异
（1）用物理或化学方法诱变
（2）用基因操作技术提高菌种的产酶能力
酶的发酵工艺条件及控制
酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。为此，除了选择性能优良的产酶细胞以外，还必须满足细胞生长、繁殖和发酵产酶的各种工艺条件，并要根据发酵过程的变化进行优化控制。
活化与扩大培养
性能优良的产酶细胞选育出来以后，必须尽可能保持其生长和产酶特性不变异，不死亡，不被杂菌污染等。
保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力，这就叫做细胞活化。
（二）培养基的配制
?培养基是指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。
?培养基有多种多样，千差万别。但培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因素等几方面。
1．碳源
碳源是指能够向细胞提供碳素化合物物的营养物质。通常碳源同时也是提供能量的能源。
在选择碳源时，必须考虑原科的供求和价格问题。
目前，在酶发酵生产中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如：糊精、麦芽糖、葡萄糖等。
2．氮源
氮是组成细胞蛋白质和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要功组成元素。
凡能够向细胞提供氮元素的营养物质称为氮源。
氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物。无机氮源是含氮的各种无机化合构。
此外，碳和氮两者的比例对酶的产量有显著的影响。所谓碳氮比(C／N)一般是指培养基中碳元素(C)的总量与氮元素(N)总量之比。可通过测定或计算培养基中碳和氮的含量而求出。有时也采用培养基中碳源总量和氮源总量之比来表示碳氮比。
–使用时要注意两种比值是不同的。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位和渗透压起调节作用。
根据细胞对无机元素需要量的大小，可分为主要元素(大量元素)和微量元素两大类。
?主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。
?微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但需要量很少，过量反而会引起不良效果，必须严加控制。
4．生长因素
生长因素是指细胞生长繁殖所必不可缺的微量有机化合物，
主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，以及动植物生长激素等。
pH值的调节
?培养基的pH值与细胞的生长繁殖以及发酵产酶都有密切关系，故必须进行必要的调节控制。
?不同细胞生长繁殖的最适pH值有所不同。一般细菌和放线菌的生长最适pH值为中性或微碱性（pH 6.5~8.0)；霉菌和酵母的生长最适pH值为偏酸性(pH 4.0~6.0)；植物细胞生长的最适pH值为 5~6。
?细胞发酵产酶的最适pH值通常接近于该酶反应的最适pH值。
所以在细胞培养和发酵过程中，必须对培养基的pH值进行适当的控制和调节。pH值的调节可以通过改变培养基的组分或其比例来实现。必要时可使用缓冲溶液，或添加适宜的酸、碱溶液，以调节控制培养基中pH值的变化。
（四）温度的调节控制
?温度是影响细胞生长繁殖和发酵产酶的重要因素之一。
不同的细胞有各自不同的最适生长温度。
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而月往往低于最适生长温度，这是由于在较低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过得中，由于细胞的新陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温度降低，两者综合，决定了培养基的温度．
–温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
（五）溶解氧的调节控制
?细胞的生长繁殖以及酶的生物合成过程需要大量的能量。为了满足细胞生长和发酵产酶的需要，培养基中的能源物质(一般是碳源提供)必须经有氧降解才能产生大量的ATP。为此，必须供给充足的氧气。
在培养基中生长和发酵产酶的细胞，一般只能利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。
由于氧是难溶于水的气体，培养基中含有的溶解氧并不多，很快就会被细胞利用完。为此，必须在发酵过程中连续不断地供给无菌空气，使培养基中的溶解氧保持在一定水平，以满足细胞生长和产酶的需要。
?调节溶氧速率的方法，主要有下列几种：
(1)调节通气量
(2)调节氧的分压：
(3)调节气液接触时间：
(4)调节气液接触面积
(5) 调节培养液粘度
（六）提高酶产量的措施
在酶的发酵生产过程中，为了提高酶产量，除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条件并根据需要和变化情况及时加以调节控制以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面活性剂或其他产酶促进剂等。
1. 添加诱导物
对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
诱导物一般可分为3类：
? (1)酶的作用底物
? (2)酶的反应产物
? (3)酶的底物类似物
2. 控制阻遏物浓度
如前所述，有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。为了提高酶产量，必须设法解除阻遏作用。
阻遏作用有产物阻退和分解代谢物阻遏两种。阻遏物可以是酶催化反应产物，代谢途径的末端产物以及分解代谢物(葡萄糖等容易利用的碳源)。
控制阻遏物浓度是解除阻遏、提高梅产量的有效措施。
3．添加表面活性剂
表面活性剂可分为离子型和非离子型两大类。离子型表面活性剂又有阳离子型．阴离子型和两性离子型之别。
由于离子型表面活性剂有些对细胞有毒害作用，特别是季胺型离子表面活性剂(如“新洁而灭”等)是消毒剂。不能用于酶的发酵生产。
4．添加产酶促进剂
产酶促进剂是指可以促进产酶、但作用机理并未阐明清楚的物质。添加产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。
动、植物细胞发酵产酶
?利用植物细胞和动物细胞发酵生产各种天然产物，是生物工程研究和开发的新领域。
?动物细胞和植物细胞均可以在人工控制条件的生物反应器中，如同微生物细胞那样，发酵生产而获得各种所需的产物。
?微生物、植物、动物细胞之间有不同的特性。
植物细胞发酵产酶
1. 发酵的特点
–植物细胞发酵技术首先从植物组织中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得高产、稳定的植物细胞。然后，用植物细胞在人工控制条件的植物细胞反应器中，如同微生物细胞那样，进行发酵而获得各种所需的产物。
?植物细胞发酵生产天然产物与从植物中提取分离这些物质相比较，具有如下特点：
1．提高产率
使用高产稳定的植物细胞进行发酵，可明显提高天然产物的产率。
2．缩短周期
3．易于管理，减轻劳动强度
4．提高产品质量
2.植物细胞发酵产酶的工艺条件控制
（1）植物细胞生长和发酵所使用的培养基
（2）温度和pH值
（3）通风与搅拌
（4）前体的添加
（5）刺激剂的应用
动物细胞发酵
?动物细胞可以产生各种有较高价值的物质。特别是激素、疫苗、单克隆抗体和酶等各种动物功能蛋白质，通过动物细胞培养和发酵得到的动物功能蛋白主要有如下几种：
1.疫苗：脊髓灰质炎(小儿麻痹症)疫苗，牲畜口蹄疫疫苗，风疹疫苗，麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，黄热病疫苗，狂犬病疫苗，肝炎疫苗等。
2.激素：催乳激素，生长激素，前列腺素，促性腺激素，淋巴细胞活素，白细胞间质素，干扰素，胰岛素等。
3.酶：胶原酶，血纤维蛋白溶酶原活性剂等。
4.单克隆抗体：通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生产各种单克隆抗体。
?动物细胞培养方法可分成两大类。
一类是来自血液、淋巴组织的细胞、肿癌细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养。
另一类是存在于动物复杂的器官中的细胞，与其周围的细胞互相依存，即有所谓“定位依存’关系，这一类细胞不宜采用悬浮培养，而必须依附在固体或半固体的表面才能生长和进行正常的新陈代谢。定位依存关系的细胞一般采用固定化细胞培养方式。
动物细胞的固定化宜采用吸附法或包理法。
酶的分离纯化
?酶的分离纯化是酶工程的主要内容，也是酶学研究过程中必不可少的环节。
?酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，以获得符合研究或使用要求的酶的过程。其主要内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶等。
细胞破碎
?酶的种类繁多，已知的约 4000种，它们存在于不同生物体的不同部位。
?除了动物和植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞之中。为了获得细胞内的酶，就得收集细胞并进行细胞或组织破碎。
?对于不同的生物体，或同一生物体的不同组织的细胞，由于结构不同，所采用的细胞破碎方法和条件亦有所不同，必须根据具体情况进行适当的选择，以达到预期的效果。
?细胞破碎的方法很多，可以分为机械破碎法、微量破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。
机械破碎法
?通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法，称为机械破碎法。
?常用的破碎机械有：
（1）组织捣碎机
（2）细胞研磨器
（3）匀浆器
物理破碎法
?通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。
?常用的物理破碎法方法有：
（1）温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞由于热胀冷缩的作用而破碎。
（2）压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。
（3）超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的 10~20kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎。
化学破碎法
?通过各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。
–常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。
–有机溶剂处理
–表面活性剂处理
酶学破碎法
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的目的。
–利用细胞本身的酶系的作用，在一定的 pH 值和温度条件下保温一段时间，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。自溶法效果的好坏取决于温度、pH 值、离子强度等自溶条件的选择与控制。
–根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌酶，作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键，而使其细胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加!-葡聚糖酶，使其细胞壁的β -1，3-葡聚糖水解；霉菌可用几丁质酶机械细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合使用，对植物细胞壁有良好的破碎效果。
酶的提取
?酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。
?酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控制好温度、pH 值等提取条件。
?根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
酶提取的主要方法
1.盐溶液提取大多数蛋白类酶（P-酶）都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度增加，这称为盐溶现象，所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取。例如，固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草杆菌碱性磷酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用清水提取的效果较好。
核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与蛋白质等杂质分离，而得到酶 RNA。
2.酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白酶可用 0.12mol/L 的硫酸溶液提取。3.碱溶液提取
有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌L-天冬酰胺酶可用 pH11~12的碱溶液碱性提取。
4.有机溶剂提取
有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的 P-酶，可以采用与水可混溶的丁醇等有机溶剂提取。
例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。
在 R-酶的提取中，经常采用苯酚水溶液。一般是在细胞破碎、制成匀浆后，加入等体积的 90% 苯酚水溶液，振荡一段时间，结果 DNA 和蛋白质沉淀于苯酚层，而 RNA 溶解于水中。
酶提取过程的注意事项
?在酶提取过程中，为了防止酶变性失活，温度不宜高，尤其是采用有机溶剂提取时，温度应该控制在 0~10℃ 。有些酶对温度的耐受性较高，可在室温或更高一些的温度条件下提取。为了提高酶的溶解度，提取时 pH 值应该避开酶的等电点。此外，还可加入某些保护剂，以提高酶的稳定性。
酶的分离纯化
?分离纯化提取活性的酶或蛋白质必须保持天然活性状态；
?分离纯化的一般步骤：材料的选择→原料的预处理→蛋白质的抽提→从抽提液中沉淀蛋白质→纯化→蛋白质的结晶；
?分离纯化的方法主要根据蛋白质分子的大小、溶解度、带电荷不同等性质。
根据分子大小不同的分离方法
1. 离心?离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
?离心机多种多样，按照离心机的最大转速的不同可以分为常速（低速）、高速和超速等 3种。
–常速离心机的最大转速在 8000r/min以内，相对离心力（RCF）在 1× 104g 以内，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。
–高速离心机的最大转速为 1×104~ 2.5×104r/min，相对离心力达到 1×104g ~ 1× 105g，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。超速离心机的最大转速达 2.5× 104 ~ 8× 104r/min，相对离心力可以高达 5× 105g。
–超速离心可以采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。超速离心可用于酶分子的分离纯化。在离心过程中，应该根据需要，选择好离心力（或离心速度）和离心时间，并且控制好温度和 pH 值等条件。
?离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心等。
–差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。差速离心主要用于分离那些大小和密度差异较大的颗粒，操作简单、方便，但分离效果较差。
–密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带离心方法。
–当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上飘浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置（等密度点）形成区带，即为等密度梯度离心。
过滤与膜分离
（1）过滤
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术。
过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等，其中以各种高分子膜为过滤介质的过滤技术称为膜分离技术。微滤、超滤、反渗透、透析及电渗析等都属于膜过滤技术。
根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等 4大类。
（2）膜分离技术
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
膜分离所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐珞以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜或羊皮纸等。在膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。
根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同，膜分离技术可以分为 加压膜分离、电场膜分离和扩散膜分离3大类。
电场膜分离是在半透膜的两侧分别装上正、负电极。在电场作用下，小分子的带电物质或离子向着与其本身所带电荷相反的电极移动，透过半透膜而达到分离的目的。电渗析和离子交换膜电渗析即属于此类。
（1）电渗析。用两块半透膜将透析槽分隔成 3 个室，在中心室通入待分离的混合溶液，在两侧室中装入水或缓冲液并分别装上正、负电极。接通直流电源后，中心室溶液中的阳离子向负极移动，透过半透膜到达阴极槽，而阴离子则向正极移动，透过半透膜移向阳极槽，从而达到分离。实际应用时，可由上述相同的多个透析槽联在一起组成一个透析系统。
（2）离子交换膜电渗析。离子交换膜电渗析的装置与一般电渗析相同。只是以离子交换膜代替一般的半透膜。离子交换膜的选择透过性比一般半透膜强。一方面它具有一般半透膜截留大于孔径颗粒的作用；另一方面，由于离子交换膜上带有某种基团，根据同性电荷相斥、异性电荷相吸的原理，只让带异性电荷的颗粒透过，而把带同性电荷的物质截留。
3.凝胶过滤
–凝胶过滤又称分子筛层析或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的相对分子质量不同而进行分离的层析技术。
–凝胶的种类很多，常用于凝胶层析的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。各种凝胶均有系列产品，不同的型号表明凝胶的孔径不同，可根据需要选择使用。
利用溶解度差别的分离方法
?沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的方法。
?沉淀分离是酶的分离纯化过程中经常采用的方法。
?沉淀分离的方法有多种，诸如盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。
1. 等电点沉淀和pH控制
当蛋白质处于等电点pH值，蛋白质的净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有斥力而趋向于凝聚而沉淀。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的理可以把蛋白质混合物分离开来。
2.盐析沉淀法
盐析沉淀法简称盐析法，是在酶的分离纯化中应用最早且至今仍在广泛使用的方法，主要用于蛋白类酶的分离纯化。
蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。
–经过盐析得到的酶沉淀，含有大量盐分，一般可以采用透析、超滤或层析等方法进行脱盐。
3.有机溶剂沉淀法
?利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。
?在室温条件下，有机溶剂可以引起蛋白质的变性，如果将有机溶剂冷却到零下40-60度，然后在不断的搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高，可以防止蛋白质的变性，将蛋白质分离开来。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮和聚乙二醇等。
4.复合沉淀法
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当的方法，使酶从复合物中析出，这种分离纯化方法称为复合沉淀法。
常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。
5.选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这种分离方法称为选择性变性沉淀法。
例如，对于热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。
此外，还可以根据酶的特性，通过改变 pH 值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。
根据分子带电性不同的分离方法——电泳
?带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
?不同的物质由于其带电性质及其颗粒大小和形状不同，在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，故此可使它们分离。物质颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类。带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒则向阳极移动。净电荷为零的颗粒在电场中不移动。
?颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液 pH 值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
1. 电泳分离的影响因素
（1）电场强度。电场强度是指每厘米距离的电压降，又称为电位梯度或电势梯度。电场强度对颗粒的泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。根据电场强度的大小可将电泳分为高压电泳和常压电泳。
（2）溶液的 pH 值。溶液的 pH 值决定了溶液中颗粒分子的解离程度，也就是决定了颗粒分子所带净电荷的多少。溶液的 pH 值离开其等电点越远，颗粒所带净电荷越多，泳动速度越快；反之，颗粒的泳动速度则越慢。
（3）溶液的离子强度。溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度越慢。
（4）电渗。在电场中，溶液对于固体支持物的相对移动称为电渗。例如，在纸电泳中，由于滤纸纤维素上带有一定量的负电荷，使与滤纸相接触的水分子感应而带有一些正电荷，水分子便会向负极移动并带动溶液中的颗粒一起向负极移动。若颗粒本身向负极移动，则其表观泳动速度将比其本来的泳动速度快；若颗粒本身向正极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的泳动速度。净电荷为零的颗粒，也会随水向负极移动。
–此外，缓冲液的粘度和温度等也对颗粒的泳动速度有一定的影响。
2. 电泳的类型
?在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶相对分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。其方法多种多样。按其使用的支持体不同，可分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳和等电点聚焦电泳等。
纸电泳是以滤纸为支持体的电泳技术。
薄层电泳是将支持体与缓冲液调制成适当厚度的薄层而进行电泳的技术。
薄膜电泳是以醋酸纤维等高分子物质制成的薄膜为支持体的电泳技术。
凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。
?凝胶电泳的支持体主要有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。常用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
?聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶形状和电泳装置的不同，可以分为垂直管型盘状凝胶电泳和垂直板型片状凝胶电泳。两者的操作原理和方式基本相同，不同的是前者在玻璃管内制成圆柱状的凝胶，后者则在两块玻璃板之间制成平板状凝胶。
?聚丙烯酰胺凝胶电泳按其凝胶组成系统的不同，可以分为连续凝胶电泳、不连续凝胶电泳、浓度梯度凝胶电泳和 SDS凝胶电泳等 4种。
等电点聚焦电泳又称为等电点聚焦或电聚焦，是 20 世纪 60 年代后期发展起来的电泳技术，在酶的等电点测定和酶的分离中广泛使用。
在电泳系统中，加进两性电解质载体。当接通直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的 pH 梯度。当酶或其他两性电解质进入这个体系时，不同的两性电解质即移动到（聚焦于）与其等电点相当的 pH 值位置上，从而使不同等电点的物质得以分离。这种电泳技术称为等电点聚焦电泳。
层析分离
?层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一个相是固定的称为固定相；另一个相是流动的，称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。
?酶可以采用不同的层析方法进行分离纯化，常用的有吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等。
1.吸附层析
?吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早且至今仍广泛使用的技术。
任何两个相之间都可以形成一个界面，其中一个相的物质或溶质在两相界面上的密集现象称为吸附。凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂，能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。
吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中进行柱层析。层析时，欲分离样品液自柱顶加入，上柱完毕后，再加入洗脱剂解吸洗脱。
2.分配层析
分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同而分离的方法。
常见的纸上层析和一些薄层层析属于分配层析。在分配层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂（称为固定相），另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动（称为流动相），当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分配。由于不同的溶质有不同的分配系数，移动速度不同，从而达到分离。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后，溶质的分配系数是一常数。
3.离子交换层析
离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。
离子交换剂进行酶的层析分离过程包括装柱、上柱、洗脱、收集和交换剂再生等步骤。
4.凝胶层析
凝胶层析又称凝胶过滤、分子筛层析或分子排阻层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的相对分子质量不同而进行分离的层析技术。
凝胶的种类很多，常用于凝胶层析的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。各种凝胶均有系列产品，不同的型号表明凝胶的孔径不同，可根据需要选择使用。
5.亲和层析
亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体，酶 RNA 与互补的 RNA 分子或片段，RNA 与互补的 DNA 分子或片段等之间都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基（ligand）。配基必须偶联于不溶性母体（matrix）上。母体又称为载体或担体。在亲和层析中，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或纤维素等作为母体。
当小分子物质（金属离子等无机辅助因子、有机辅助因子等）作为配基时，由于空间位阻作用，难以与配对的大分子亲和吻合，需要在母体与配基之间引入适当长度的连接臂（spacearm）。
萃取分离
?萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。
?萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相，有时也可采用其他流体。
?按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、液膜萃取、双水相萃取和超临界萃取等。
酶的结晶
?结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。结晶时，溶质分子按照一定的规律排列在一起，形成特定形状的晶体颗粒。
?酶的结晶是酶分离纯化的一种手段，也是酶的一种制品形式。在酶学研究中，酶结晶为酶的结构、功能、催化机制等方面的研究提供了适宜的样品，同时为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。
?酶结晶的方法多种多样，主要有盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶等。
1.盐析结晶
–在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢增加酶液中盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低，而使酶析出结晶，此种方法称为盐析结晶。
?盐析结晶采用的中性盐一般是硫酸铵，也可采用硫酸钠等其他中性盐。
2.有机溶剂结晶
–在适宜的温度和 pH 值等条件下，慢慢加入一定量的有机溶剂到酶液中，使酶的溶解度慢慢降低，达到稍为过饱和状态而析出结晶，此种方法称为有机溶剂结晶。
?常用于酶结晶的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇甲基戊二醇、二甲亚砜等。
3.透析平衡结晶
–将经过纯化的浓缩酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液或一定 pH 值的缓冲液或有机溶剂进行透析，经过一段时间，酶液中酶的浓度渐渐达到过饱和状态而析出结晶，此种方法称为透析平衡结晶。透析平衡结晶是常用的结晶方法之一，可用于大量样品的结晶，也可用于微量样品的结晶。
4.等电点结晶
–通过慢慢改变浓缩酶液的 pH 值，使之逐步达到酶的等电点，使酶的溶解度降低，达到过饱和状态而析出结晶，此种方法称为等电点结晶。
浓缩与干燥
?浓缩是从低浓度酶溶液中除去部分的水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程。
?干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水较少的固体的过程。干燥的方法很多。常用的有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。
第三章 化学酶工程
化学酶工程也可称为初级酶工程（primary enzyme engineering），是指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及人工模拟酶的研究和应用。
1. 天然酶
2. 化学修饰酶
通过对酶分子的化学修饰可以改善酶的性能，以适用于医药的应用及研究工作的要求。
3. 固定化酶（immobilized enzyme）
通过物理、化学的方法将水溶性酶处理，使之成为不溶于水的、但仍具有酶活性的状态。
4. 人工模拟酶
第一节 酶分子的化学修饰
?通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的过程称为酶分子修饰。
?酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶分子的结构决定了酶的性质和功能。正是酶分子的完整空间结构赋予酶分子以生物催化功能，使酶具有催化效率高、专一性强和作用条件温和等特点。但是在另一方面，也是酶的分子结构使酶具有稳定性较差、活性不够高和可能具有抗原性等弱点。
?当酶分子的结构发生改变时，将会引起酶的性质和功能的改变。
一、化学修饰的原理
影响蛋白质化学修饰反应进程的因素主要有两个：一是蛋白质功能的反应性；二是修饰剂的反应性。
（一）影响酶蛋白功能反应性的因素
? 天然蛋白质分子的多数非极性侧链（疏水侧链）位于非常致密的分子基体的中心，而多数极性带电侧链（亲水侧链）位于基体的表面。
? 蛋白质分子表面在外形上并不规则，极性也很不相同。
? 蛋白质功能基所处的环境强烈地影响着它的物理和化学性质。
? 蛋白质分子的表面特点也影响化学试剂的接近。
1. 微区的极性
决定基团解离状态的关键因素之一。从整体来看，局部极性的改变对色氨酸、甲硫氨酸和胱氨酸反应性影响最小；对氨基和组氨酸反应性的影响较大；对酪氨酸和羧基的反应性影响最大。
2. 氢键效应
天然蛋白质或它的离子通过氢键来维持其稳定性，也是使pKa发生改变的一个因素。
3. 静电效应
同一种氨基酸在不同的蛋白质中或同一蛋白质的不同部位，可电离氨基酸侧链的pKa不同，可能是由于带电基团相互影响所致；而且使侧链基团反应性受到影响。蛋白质中个别功能基所处微区不同，反应性也不同。
4. 位阻效应
处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂反应，但如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这是就出现位阻效应。
另外，电荷转移、共价键形成、金属螯合转自由度等因素也能改变蛋白质功能基的反应性。
（二）酶蛋白功能基的超反应性
1. 超反应的概念超反应性是指蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速的反应。多数蛋白质的功能基与简单氨基酸中的同样基团相比，反应性要差；但每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。酶的催化活性基团通常对修饰剂是有反应性的，但酶的超反应基团不一定是酶活性部位上的基团，可能与酶的功能或构象没有明显联系。2. 影响超反应的因素（1）改变蛋白质功能基的pKa；
（2）蛋白质功能基具有较大的亲核性；
（3）通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向；
（4）试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性；
（5）试剂的结合等。
超反应可能是由上述一个因素或几个因素的综合作用而产生。
（三）修饰剂反应性的决定因素
1. 选择吸附
化学修饰前，修饰剂是根据各自的特点，选择性地吸附在低极性区或高极性区。
2. 静电相互作用
带电的修饰剂能被选择性地吸引到蛋白质表面带相反电荷的部位，静电相互作用可使修饰剂向多功能部位中的一个残基定位或向双功能基的一侧定位。
3. 位阻因素
蛋白质表面的位阻因素或者底物、辅因子、抑制剂所产生的位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。
4. 催化因素
修饰部位附近的其他功能基，如果起一般的酸碱催化作用，也能影响修饰反应。不同的修饰剂，其反映速度和反应部位有明显差异。
5. 局部环境的极性
许多有机反应的速度与溶剂的极性有关，而有些反应则与极性无关。溶剂反应是很复杂的，但可以概括出几条规律。
二、化学修饰的方法
（一）金属离子置换修饰
?把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子修饰。
?通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐明酶的催化作用机制，并有可能提高酶活力，增加酶的稳定性。
?有些酶中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有重要作用。例如，α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+）、谷氨酸脱氢酶中的锌离子（Zn2+）、过氧化氢酶中的铁离子（Fe2+）等。
?金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子，如 Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。
（二）大分子结合修饰
?若采用的修饰剂是水溶性大分子，则称为大分子结合修饰。通过分子结合修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，降低或消除酶蛋白的抗原性等。
水溶性分子与酶蛋白的侧链基团通过共价键结合后，可使酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力提高。例如，每分子核糖核酸酶与 6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的 2.25 倍；每分子胰凝乳蛋白酶与 11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的 5.1倍等。
通过修饰可以增加酶的稳定性。酶的稳定性可以用酶的半衰期表示。酶的半衰期是指酶的活力降低到原来活力的一半时所经过的时间。酶的半衰期长，则说明酶的稳定性好；半衰期短，则稳定性差。例如，超氧化物歧化酶（ SOD）在人体血浆中的半衰期仅为6min，经过分子结合修饰，其半衰期可以明显延长。
通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性。酶大多数是从微生物、植物或动物中获得的，对人体来说是一种外源蛋白质。当酶蛋白非经口（注射等）进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生抗体。产生的抗体可与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去其催化功能。抗体与抗原的特异结合是由它们之间特定的分子结构所引起的。通过酶分子修饰，使酶蛋白的结构发生改变，可以大大降低或消除酶的抗原性，从而保持酶的催化功能。例如，精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原性显著降低；L-天冬酰胺酶经聚乙二醇结合修饰后，抗原性完全消除。
（三）肽链有限水解修饰
?酶分子的主链包括肽链和核苷酸链，主链被切断后，可能出现下列 3种情况。
①若主链的断裂引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其催化功能。这种修饰主要用于探测酶活性中心的位置。
②若主链断裂后，仍然可以维持酶活性中心的空间构象，则酶的催化功能可以保持不变或损失不多，但是其抗原性等特性将发生改变。有些酶蛋白具有抗原性，除了酶分子的结构特点以外，还由于酶是生物大分子。酶蛋白的抗原性与其分子大小有关，大分子的外源蛋白往往有较强的抗原性，而小分子的蛋白质或肽段的抗原性较低或无抗原性。若采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其相对分子质量减少，就可以在基本保持酶活力的同时使酶的抗原性降低或消失，这种修饰方法又称为肽链有限水解修饰。例如，木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其肽链的三分之二，该酶的活力基本保持，其抗原性却大大降低；又如，酵母的烯醇化酶经肽链有限水解，除去由 150个氨基酸残基组成的肽段后，酶活力仍然可以保持，抗原性却显著降低。
③若主链的断裂有利于酶活性中心的形成，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。例如，胰蛋白酶原用胰蛋白酶进行修饰，除去一个六肽，从而显示胰蛋白酶的催化功能；天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基末端切除 10多个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高 4~5倍；线性间隔序列 L IVS 的 5′-末端切除 19 个核苷酸残基后，形成多功能核酸类酶 L-19 IVS。
（四）酶蛋白的侧链基团修饰
?采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
?酶蛋白的侧链基团修饰可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响，在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。如果某基团修饰后不引起酶活力的变化，则可以认为此基团是非必需基团；如果某基团修饰后使酶活力显著降低或丧失，则此基团很可能是酶催化的必需基团。
?酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。
?1.氨基修饰
采用某些化合物使酶蛋白侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。
凡能够使蛋白质侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂，主要有：亚硝酸、二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。这些氨基修饰剂作用于蛋白质侧链上的氨基，可以产生脱氨基作用或与氨基共价结合将氨基屏蔽起来。例如，用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基产生脱氨基作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期延长 2倍；用 O-甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中的赖氨酸残基上的氨基与它结合，将氨基屏蔽起来，修饰后，酶活力基本不变，但稳定性显著提高，而且很容易形成结晶。
?2.羧基修饰
采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变的方法称为羧基修饰。
可与蛋白质侧链上的羧基反应的化合物称为羧基修饰剂，如乙醇-盐酸试剂、碳化二亚胺、异恶唑盐等。
?3.精氨酸胍基修饰
蛋白质分子中精氨酸残基的侧链含有胍基。
采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构象的方法称为胍基修饰。
用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。
?4.巯基修饰
蛋白质分子中半胱氨酸残基的侧链含有巯基。巯基在许多酶中是活性中心的催化基团，巯基还可以与另一巯基形成二硫键，所以巯基对稳定酶的结构和发挥催化功能有重要作用。
使酶蛋白侧链上的巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。
常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。
?5.组氨酸咪唑基的修饰
组氨酸残基位于许多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPG）和碘代乙酸。
?6.色氨酸吲哚基的修饰
色氨酸残基一般位于酶分子内部，而且比巯基和氨基等一些亲核基团的反应性差，一般用N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）来修饰吲哚基，并通过280nm处光吸收的减少跟踪反应。
?7.酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰
酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳香环上的取代修饰。
使酚基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的修饰方法称为酚基修饰。酚基修饰的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。例如，枯草杆菌蛋白酶的第104位酪氨酸残基上的酚基经四硝基甲烷（ TNM ）硝化修饰后，生成硝基酚残基，由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的结合力显著增加；葡萄糖异构酶经过琥珀酰化修饰后，其最适 pH 值下降 0.5单位，并增加酶的稳定性。
?8.分子内交联修饰
采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。
（五）氨基酸置换修饰
酶蛋白的基本组成单位是氨基酸，将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
酶分子经过组成单位置换修饰后，可以提高酶活力，增加酶的稳定性或改变酶的催化专一性。
?（1）通过修饰可以提高酶活力。
?（2）通过修饰可以增加酶的稳定性。
?（3）通过修饰可以使酶的专一性发生改变。
（六）酶的亲和修饰
酶的位点专一性修饰是根据酶和底物的亲和性，修饰剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用，这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。一般它们都具有与底物项类似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性，能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记，因此这类专一性化学修饰也称为亲和标记或专一性的不可逆抑制。
1. 亲和标记
用于亲和标记的亲和试剂作为底物类似物应符合如下条件：
（1）在使酶不可逆失活以前，亲和试剂要与酶形成可逆复合物；
（2）亲和试剂的修饰程度是有限的；
（3）没有反应性的竞争性配体的存在应减弱亲和试剂的反应速度；
（4）亲和试剂体积不能太大，否则会产生空间障碍；
（5）修饰产物应当稳定，便于表征和定量。
亲和试剂可以专一性地标记于酶的活性部位上，使酶不可逆失活，因此也称为专一性的不可逆抑制剂。这种抑制分为Ks型不可逆抑制和Kcat型不可逆抑制两类。
（1）Ks型不可逆抑制剂
根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团。因此也可以和酶的活性部位发生特异性结合，并且能够对活性部位侧链基团进行修饰，导致酶不可逆失活。这类修饰的特点是：底物、竞争性抑制剂或配体应对修饰有保护作用；修饰反应是定量定点进行的。
（2）Kcat型不可逆抑制剂Kcat型抑制剂转移性很高，因为这类抑制剂是根据酶催化过程设计的，它具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶催化下活化后，不可逆地抑制酶的活性部位。所以Kcat型抑制剂也称为“自杀性抑制剂”。自杀性抑制剂可以用来作为治疗某些疾病的有效药物。
2. 外生亲和试剂与光亲和试剂
亲和试剂一般可分为内生亲和试剂和外生亲和试剂，前者是指试剂本身的某些部分通过化学方法转化为所需要的反应基团，而对试剂的结构没有大的扰动；后者是把反应性基团加入到试剂中去，如将卤代烷基衍生物连到腺嘌呤上，氟磺酰苯酰基连到腺嘌呤核苷酸上。
光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂，它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。这种试剂先与酶活性部位在暗条件下发生特异结合，然后被光照激活后，产生一个非常活泼的功能基团与它们附近几乎所有基团反应，形成一个共价的标记物。
（七）酶分子的物理修饰
?通过各种方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为酶分子的物理修饰。
?通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH 值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。
?酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。
?酶分子的空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建新的空间构象。例如，首先用盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象被破坏，通过透析除去变性剂后，再在不同的温度条件下，使酶重新构建新的空间构象。结果表明，在 20℃ 的条件下重新构建的胰蛋白酶与天然胰蛋白酶的稳定性基本相同，而在 50℃ 的条件下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高 5倍。
固定化酶与固定化细胞
?酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质，广泛应用于酿造、食品、医药等领域。
?酶是一种蛋白质，稳定性差，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不稳定，即使在酶反应最适条件下，也往往会很快失活，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降，反应后又不能回收，而且只能采用分批法生产手段等，对于现代工业来说还不是一种理想的催化剂。
?如果能设计一种方法，将酶束缚与特殊的相，使它在整体相（或整体流体）分割开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。这种固定化的酶可以向一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学反应催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。
?随着固定化技术的发展，作为固定化的对象不仅有酶，也可以有微生物或细胞器，这些固定化物可统称为固定化生物催化剂。
一、酶的固定化
固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，人们通过有目的地将酶包裹于聚合物基质或连接于载体分子而限制酶的移动；也可采用酶的交联，通过蛋白质交联或无活性材料的加入，从而产生了无数用不同材料的固定方法。
1953年德国Grubhofer & Schleith采用聚氨基苯议席树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。
1969年日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现酶应用史上的一大变革。
1971年在国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名陈为Immobilized Enzyme。
1973年日本首次在工业上成功地应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
1979年固定化毛地黄细胞和长春花细胞的研究成功，推动了固定化植物细胞和动物细胞的研究，为动植物来源的天然产物的工业化开辟了新的途径。
（一）固定化酶的定义
1. 固定化酶：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
2. 固定化酶与游离酶相比，具有下列优点：
（1）极易将固定化酶与底物、产物分开；
（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；
（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；
（4）酶反应过程能够加以严格控制；
（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
（6）较游离酶更适合于多酶反应；
（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；
（8）酶的使用效率提高，成本降低。
（二）固定化酶的制备原则
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶蛋白的活性中心是酶的催化功能所必需的，酶蛋白的空间构象与酶活力密切相关。因此，在酶的固定化过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不发生变化，也就是酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，而且要尽量避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件。由于酶蛋白的高级结构是凭借氢键、疏水键和离子键等弱键维持，所以固定化是要采取尽量温和的条件，尽可能保护好酶蛋白的活性基团。
2. 固定化应该有利于生产自动化、连续化。
3. 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。
4. 酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。
5. 固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。
6. 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
（三）酶的固定化方法
酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，如表3-2。
1. 非共价结合法
（1）结晶法：就是使酶结晶从而实现固定化的方法。
（2）分散法：就是通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。
（3）物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。此类载体很多，无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白等。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少等优点。
表3-2 酶的固定化方法
（4）离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法，该方法操作简单、处理条件温和、酶的高级结构和活性中心的氨基酸不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。用于此法的载体有阴离子交换及如DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等，阳离子交换剂如CM-纤维素、Dowex-50等。
2. 化学结合法
（1）共价结合法：这是酶与载体以共价键结合的固定化方法，是载体结合法中报道最多的方法。共分两类：一是将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶连反应；另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶连上去。可与载体共价结合的酶功能基团有(-氨基或(-氨基，(、(或(位的羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。该法的优点是酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。所用载体分为三类：天然有机载体（如多糖、蛋白质、细胞）、无机物（玻璃、陶瓷等）和合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）。
（2）交联法：就是用双功能或多功能试剂使酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。参与交联反应的酶蛋白的功能基团有N末端的(-氨基、赖氨酸的(-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基等。作为交联剂的有形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N,N(-乙烯双马来亚胺等。
3. 包埋法
包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。
（1）网格法：将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中，载体材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物以及淀粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉莱胶等天然高分子化合物。
（2）微囊法：将或微生物包埋在高分子半透膜中，通常形成直径为几微米到几百微米的球状题，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。制备微囊型固定化酶的方法有：
a.界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。
b.界面聚合法：利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。
c.二级乳化法：酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含着多滴酶液。此法制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。
表3-3 固定化酶方法的优缺点比较
（四）固定化酶的性质
由于固定化也是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的限制扩散效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。
1. 固定化后酶活力在多数条件下比天然酶小，其专一性也能发生改变。
2. 固定化后酶的稳定性在大多数情况都有所增加。
3. 固定化后酶的热稳定性提高，最适温度也随之提高。
4. 酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。
5. 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。
（五）固定化酶的应用
1. 固定化酶在工业生产中的应用
（1）氨基酰化酶
（2）葡萄糖异构酶
（3）天门冬氨酸酶
（4）青霉素酰化酶
（5）延胡索酸酶
（6）(-半乳糖苷酶
（7）天门冬氨酸- (-脱羧酶
2. 固定化酶在酶传感器方面的应用二、细胞的固定化
固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。
固定化细胞的研究和应用始于20世纪70年代，且后来居上，发展迅速，实际应用超过了固定化酶。与固定化酶相比较，固定化细胞的优越性表现在：
（1）固定化细胞保持了胞内酶系的原始状态与天然环境，因而更稳定；
（2）固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统，而且无需辅酶再生；
（3）固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期，可提高生产能力；
（4）发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续使用；
（5）发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化，提高产品质量等。（一）固定化细胞分类、形态特征和生理状态
1. 分类
固定化细胞按其细胞类型有固定化微生物细胞、植物和动物细胞三大类；按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。表3-4 固定化细胞的分类2. 形态特征
固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、球状、条状、薄膜状或不规则状（与吸附物形状相同）等，目前大多数制备成颗粒状珠体。
3. 生理状态
被固定在载体内的细胞在形态学上一般没有明显的变化。通过光学显微镜、电子显微镜观测表明细胞的形态与自然细胞没有明显差别。但是，扫描电镜观察到固定化酵母细胞膜有内陷现象。
固定化生长细胞，又称为固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。
（二）固定化细胞的制备
固定化酶和固定化细胞都是以酶的应用为目的，其制备方法和应用方法也基本相同。上述的固定化酶方法大部分适合于微生物细胞的固定化，既适用于固定化死细胞（休止细胞），也适用于固定化活细胞。
固定化完整细胞的方法虽有很多种，但没有一种理想的通用方法，每种方法都有其优缺点。对于特定的应用，必须寻找价格低廉、简便的方法，高的活力保留和操作稳定性，后两条是评价固定化微生物催化剂的先决条件。
表3-5 不同的固定化完整细胞方法
（三）原生质体固定化
微生物细胞或植物细胞除去细胞壁后，就可获得原生质体。原生质体很不稳定，容易破裂，若将原生质体用多孔凝胶包埋起来制成固定化原生质体，由于有载体的保护作用，就会使原生质体的稳定性提高，免至破裂。固定化原生质体的制备包括原生质体的制备和其固定化两个阶段。
1. 原生质体的制备
（1）将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中；
（2）加入适宜的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破坏；
（3）分离除去细胞壁碎片，未作用的细胞以及细胞壁水解酶而得到原生质体。
2. 原生质体的固定化原生质体制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液；然后采用包埋法制成固定化原生质体。
3. 固定化原生质体的特点
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性，可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物，另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内产物不断地分泌到胞外。
固定化原生质体具有下列特点：
（1）固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率；
（2）固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用或连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力；
（3）固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量；
（4）固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性；这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。
（四）固定化细胞的应用
1. 固定化微生物细胞的应用
（1）利用固定化微生物生产各种产物：酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶和辅酶、抗生素等；
（2）固定化微生物细胞制造微生物传感器
2. 固定化原生质体的应用
固定化原生质体可用于生产各种氨基酸、酶或生物碱等。
（1）氨基酸的生产
（2）胞内酶的生产
（3）生物碱的生产
（4）甾体的转化
（5）木质素的降解
第三节 酶反应器
生物反应器就是为了适应生物反应（或称生化反应）的特点而设计的反应设备，而所谓生物反应或生化反应即是由各种不同的、或一系列的生物催化剂——酶在各种不同条件下催化的一个或一系列的反应，从本质上说都是酶反应。它们可以是单酶反应，也可以是增殖细胞内的酶反应；可以是游离酶（或细胞）反应，也可以是固定化酶（或细胞）的反应。
由于生物反应就是各种类型的酶反应，故生物反应器实质上也就是酶反应器。生物反应器是生物技术工艺的中心环节，是原料到产品的纽带。
一、生物反应器的特点
? 生物反应与一般的化学反应不同主要在于其反应皆系由生物催化剂——酶来催化的，因而反应条件要比较温和，即在接近中性pH、较低的温度及近似细胞生理条件下进行。
?生物的酶系非常复杂，在活细胞中它们互相协调而处于最优化状态；由于反应的环境条件会随着时间的进程而改变，就产生了一个如何控制反应过程以使其最优化的问题。
?对生长细胞来说，要考虑到如何维持发酵的最佳条件，主要包括细胞营养、代谢的调控以及反应产物的干扰。
?由于酶作用对底物的高度特异性，它可以定向的产生一些用一般化学反应难以甚至无法得到的产品；专一的产品有利于产物的回收（特别是应用固定化技术时）及质量的提高。
?极大多数生物反应皆是在水相进行，相对来说产物浓度较低，就产生了一个产物的回收工艺及本的问题。
二、酶反应器的类型
? 以酶作为催化剂进行反应所需的设备称为酶反应器。
? 酶反应器基本上是游离酶、固定化酶或固定化细胞催化反应的容器(附加上混合取样和检测设备)。反应器的作用是以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定产物。酶反应器不同于化学反应器，它是在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能也比较少。
? 酶反应器也不同于发酵反应器，因为它不表现自催化方式，即细胞的连续再生。
? 酶反应器的类型很多，有以反应器的结构分类，有以催化剂的形式分类，也有以工艺过程来分类。
?（一）游离酶反应器
1．搅拌罐式反应器
它由容器、搅拌器及保温装置组成。
2．超滤膜酶反应器?此反应器可以作用于胶态或不溶性底物，特别是产物对酶有抑制作用时．采用此装置较合适。但是，酶的长期操作稳定性差，而且酶易在起滤膜上吸附损失，或在膜表面浓缩极化。
?（二）固定化酶反应器
I．搅拌罐型反应器
有分批反应器(Batch Stirred Tank Reactor BSTR)相连续流搅拌罐反应器(Continuos Flow Stirred Tank Reactor，CSTR)(图7—2)。这类反应器的特点是内容物的混合是充分均匀的。
?2．固定床型反应器
把颗粒状或片状等固定化酶填充于固定床(也称填充床，床可直立或平放)内，底物按一定方向以恒定速度通过反应床(图7—2)。它是一种单位体积催化剂负荷量多，效率高的反应器。当前工业上多数采用此类反应器。
与全混流反应器(CSTR)相反，有另一类理想的、没有返混的反应器，称为活塞流反应器(PFR)。在其横截面上液体流动速度完全相同，沿流动方向底物及产物的浓度是逐渐变化的，但同一横切面上浓度是一致的。
因此，称为活塞流反应器(Plug Flow Reactor PFR)。高(长)径比较大的管式反应器，接近于活塞流反应器。
?固定床反应器可使用高浓度的催化剂，反应产生的产物和抑制剂可从反应器中不断地流出。由于产物浓度沿反应器长度是逐渐增高的，因此与CSTR相比．可减少产物的抑制作用。但是它存在下列缺点：
?(1)温度和pH难以控制。
?(2)底物和产物会产生轴向浓度分布。
?(3)清洗和更换部分固定化酶较麻烦。
?3．流化床型反应器
?流化床反应器(简称FBR，Fluidized Bed Reactor)是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器(形状可为柱形、锥形等)它有下列优点：
?(1)具有良好的传质及传热的性能。pH、温度控制及气体的供给比较容易。
?(2)不易堵塞，可适用于处理粘度高的液体。
?(3)能处理粉末状底物。
?(4)即使应用细粒子的催化剂，压力降也不会很高。
但也有缺点如下：
?(1)需保持一定的流速，运转成本高，难于放大。
?(2)由于颗粒酶处于流动状态，易导致粒子的机械破损。
?(3)由于流化床的空隙体积大，酶的浓度不高。
?(4)由于底物高速流动使酶冲出，降低了转化率。
?4．膜型反应器
由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器均称为模型反应器。用固定化酶膜组装成的平板状或螺旋状反应器、转盘型反应器、空心酶管和个空纤维膜反应器等都属于此类反应器。?5．鼓泡塔型反应器
? 在生物反应中，有不少的反应要涉及到有气体的吸收或产生，此类反应最好采用鼓泡塔型反应器。或三相流化床反应器。?（三）酶反应器的发展
1. 含有辅助因子再生的酶反应器
在酶反应中最常见的辅酶因子是辅酶I（NAD）、辅酶II（NADP）及三磷酸腺苷（ATP）；辅酶的再生方法有三大类，即电化学法、化学法及酶法。
2. 两相或多相反应器
3. 固定化多酶反应器
三、酶反应器的设计与选型
?（一）酶反应器的设计
对于酶反应器来说，就是要设计出一个既能充分发挥生物反应的优点，又可克服一些限制因素，以最低的生产成本，获得最高的产量和质量的酶反应器。
?1．酶反应器的设计原理
为了设计反应器以及决定反应操作条件，理论上必须了解下列事项：
(1)底物的酶促反应动力学以及温度、压力、 pH等操作参数对此特性的影响。
(2)反应器的型式和反应器内流体流动状态及传热特性。
(3)需要的生产量及生产工艺流程。
? 2．与设计有关的参数
(1)酶反应器生产强度Qp：酶反应器的生产强度Qp表示每小时每升反应体积所生产的产品的克数。
(2)产品转化率Yp/s及酶的催化率Rp/e：产品转化率Yp/s是指每克底物中有多少克转化为产物。(3)产物浓度P及底物停留时间t：产物浓度P是一个影响到分离提纯，也就是回收成本高低的关键问题。在连续工艺中，降低稀释率或增加酶浓度可使产物浓度升高，但会使Qs减小。
?（二）酶反应器的选择
在选择酶反应器的时候，必须考虑各种因素。一般应考虑以下几个方面：
?(1)酶的形状、大小及机械强度；
?(2)底物的性质；
?(3)反应操作的要求：
?(4)反应动力学及传质传热特性；
?(5)酶的稳定性、再生及更换；
?(6)反应器的制造成本及运行成本及应用的可塑性等。
四、酶反应器的操作
酶工程要解决的主要问题是如何降低酶催化过程的成本，即能以最少量的酶，最短的时间完成最大量的反应。要完成这个任务，除了要选择恰当的酶应用形式，选择和设计合适的酶反应器以外，还要确定合理的反应操作条件。
酶反应器的操作中，应该注意如下几个方面：
?(1)控制酶反应器中流动状态；
?(2)维持酶反应器的恒定生产能力；
?(3)保持酶反应器的稳定，使其能长期运转使用；
?(4)防止酶反应器的污染。
（一）酶反应器中流动状态的控制
（二）酶反应器的恒定生产能力的控制
（三）酶反应器的稳定性
（四）酶反应器的微生物污染
第四章 生物酶工程生物酶工程（biological enzyme engineering）是用生物学方法，特别是基因工程、蛋白质工程和组合库筛选法改造天然酶，创造性能优异的新酶；它是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，也称高级酶工程（advanced enzyme engineering）。主要包括3方面的内容：用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）；设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。
一、核酸酶
到目前为止，生物催化剂可以分为两类，一类为传统定义的“酶”（enzyme），其化学本质是蛋白质，又称蛋白酶（protein enzyme）；另一类是“核酸酶”（nucleic acid enzyme），其化学本质是核酸。
1.Ribozymes的发现
2.Ribozymes的类别
3.几类Ribozymes的介绍
4.Ribozymes发现的意义
二、抗体酶
抗体酶（antibody enzyme）是指具有催化能力的抗体——催化抗体（catalytic antibody）。
第五章 酶的应用
? 随着酶的工业化生产的发展，酶已广泛地应用于工业、农业、医药、环保及科研等领域。酶分子修饰，酶和细胞固定化等酶工程技本的发展，使酶的应用显示出更加广阔美好的前景。
? 现代酶工程技术始于20世纪中叶。随着微生物发酵技术的发展和酶分离纯化技术的提高，酶制剂生产开始走向规模化，并被应用于轻工、医药等生化过程。
? 20世纪60年代，酶固定化技术的诞生，改善了酶的稳定性，使酶在生化反应器中可以反复连续使用，极大地推动了酶工程技术的推广应用。
? 20世纪70年代，基因工程与酶催化理论的结合，给酶工程技术带来了前所未有的生机。
第一节 酶在轻工、食品方面的应用
目的国内外最广泛使用的领域是在食品和轻工业部门。国内外大规模工业主产的α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等大部分都在轻工和食品方面应用。
一、酶在食品工业方面的应用
食品工业是最早和最广泛应用酶的部门之一。目前已有几十种酶成功地用于食品工业。例如：葡萄糖、饴糖、果葡糖浆等的生产，蛋白质品加工，果蔬加工，食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。
（一）制糖工业1. 酶法生产葡萄糖酶法生产葡萄糖是以淀粉为原材料，先经α-淀粉酶液化成糊精，再用糖化酶催化生成葡萄糖。淀粉酶是最早实现工业生产的酶， 也是迄今为止用途最广的酶。制造葡萄糖时酸糖化法与酶糖化法的比较
2. 果葡糖浆的生产?果葡糖浆是由葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成部分果糖而得到的葡萄糖与果糖的混合糖浆。
?全世界的淀粉酶产量已达1000多万吨，其中70%为果葡糖浆。3. 饴糖、麦芽糖、高麦芽糖浆的生产
?饴糖是用米饭同谷芽一起加热保温做成，近年来国内饴糖已改用碎米粉等为原料，先用细菌淀粉酶液化，再加少量麦芽糖糖化制成。
?麦芽糖的制法为：将淀粉用(-淀粉酶轻度液化，加热(-淀粉酶失活，再加入(-淀粉酶与脱枝酶，在pH5.0~6.0，40~60oC反应24~48h，淀粉几乎完全水解。当浓缩到90%以上时，可析出纯度98%以上的结晶麦芽糖。
?高麦芽糖浆是含麦芽糖为主的淀粉糖浆，仅含少量葡萄糖。其制法为：以含固形物35%，DE10左右的淀粉液化液，加入霉菌(-淀粉酶0.5%~0.8%，于pH5.5、55oC水解48h再加以脱色精制浓缩而成，其DE40~50，含麦芽糖45%~60%，葡萄糖2%~7%以及麦芽三糖等。
（二）啤酒发酵
啤酒是以麦芽为原料，经糖化发酵而成的酒精饮料，麦芽中含降解原料生成可发酵性物质所必需的各种酶类，主要为淀粉酶、蛋白酶、(-葡聚糖酶、纤维素酶以及核酸分解酶等。在糖化过程中这些酶分解原料中淀粉蛋白质，生成还原糖、糊精、氨基酸、肽类等物质。（三）在蛋白制品加工方面的应用
蛋白质是食品中的营养成分之一。以蛋白质为主要成分的制品称为蛋白质制品，如蛋制品、鱼制品和乳制品等。酶在蛋白质制品加工的主要用途是改善组织，嫩化肉类，转化废弃蛋白质成为供人类使用或作为饲料的蛋白质浓缩液，因而可以增加蛋白质的价值和可利用性。
不同来源的蛋白酶在反应条件和底物专一性上有很大差别。在食品工业中应用的主要有中性蛋白酶和酸性蛋白酶。动、植物来源的蛋白酶在食品工业上应用很广泛，这些蛋白酶包括植物来源的木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶以及动物来源的胰蛋白酶、胃蛋白酶和粗胰乳酶。
（四）在水果、蔬菜加工方面的应用
在瓜果蔬菜的加工过程中，其鲜味及果汁的口感非常重要。水果加工中最重要的酶是果胶酶，是一群复杂的酶，分为原果胶酶、果胶酯酶（PE）、聚半乳糖醛缩酶（PG）、果胶酸裂解酶以及果胶裂解酶，广泛存在于各类微生物中。
二、 酶在轻工方面的应用
酶在轻工业方面的应用,概括起来主要有以下三个方面：
（1）原料处理
（2）用酶生产各种产品
（3）用酶增强产品的使用效果。1. 原料处理
许多轻工原料在应用或加工之前都需要经过原料处理。用酶处理原料可以缩短原料处理时间，提高处理效果，提高产品质量等。
（1）发酵原料的处理
酵母或细菌等微生物进行酒精、酒类、甘油、乳酸、氨基酸核苷酸等生产时，大多数以淀粉、纤维素为主要原料。由于有些微生物本身缺乏淀粉酶和纤维素酶系，因而无法直接利用这些原料。因此必须经过原料处理，将原料转化为微生物可利用的小分子物质。 （2）纺织原料的处理
在纺织工业中，为了增强纤维的强度和光滑性，便于纺织，需要先行上浆。将淀粉用α-淀粉酶处理一段时间，使粘度达到一定程度就可用作上浆的浆料。纺织品在漂白、印染之前，还须将附着在其上的浆料除去，利用α-淀粉酶使浆料水解，就可使浆料褪尽，这称为退浆。有些纺织品上浆使用的是动物胶作胶浆，可用蛋白酶使之退浆。
(3) 造纸原料的制浆造纸原料的纤维中含有大量木质素，它容易使纸变为褐色，强度降低。通常使用碱性硫酸盐和二氯化盐处理以除去木质素，这些化学药品的致癌性已被证实，因而造成严重的环境污染。用木质素酶可以使木质素水解，这样不但可以提高纸的质量，而且使环境污染的程度大为减轻。(4).生丝的脱胶处理天然蚕丝的主要成分是不溶于水的有光泽的丝蛋白。丝蛋白的表面有一层丝胶包裹着，在高级丝绸的制作过程中，必须进行脱胶处理，即将表面上的丝胶除去，以提高丝的质量。采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或微生物蛋白酶处理，可在比较温和的条件下催化丝胶蛋白水解，进行生丝脱胶。
(5). 羊毛的除垢羊毛表面有鳞状物质，即一些蛋白质聚合体。目前应用枯草杆菌蛋白酶处理后，可以消除鳞状物质，而且还使毛料具有防缩水性，防止羊毛起球，形成毛毡。处理后的毛料很柔软，易于染色。 2. 轻工产品制造方面的应用
(1)酶法生产L-氨基酸L-型氨基酸是人体内蛋白质合成的原料，因而L-型氨基酸在医学和食品工业上有很重要的意义。
工业上已用固定化大肠杆菌菌体的天门冬氨酸酶将延胡索酸（反丁烯二酸）氨基化生成 L-天门冬氨酸。以L-天门冬氨酸为底物，采用固定化假单胞菌菌体的天门冬氨酸脱羧酶，可连续生产L-丙氨酸。
用己内酰胺水解酶生产L-赖氨酸：该法由L -α-氨基-ε-己内酰氨水解酶与α–氨基-ε-己内酰胺消旋酶联合作用，将 DL-α氨基－ε－己内酰胺转化为Ｌ－赖氨酸。所用的原料DL-α-氨基-ε-己内酰胺是由合成尼龙的副产品环己烯通过化学合成法得到的。原料中的Ｌ－α－氨基－ε－己内酰胺，经Ｌ－α－氨基－ε－己内酰胺水解酶作用后生成L-赖氨酸。余下的 D－α－氨基－ε－己内酰胺在消旋酶的作用下变成DL-型，再把其中的L-型水解为L-赖氨酸。如此重复进行，可把原料几乎都变成L-赖氨酸。
用噻唑啉羧酸水解酶合成L-半胱氨酸: 将化学合成的DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸中的L-2-氨基噻唑啉-4-羧酸经噻唑啉羧酸水解酶作用生成L-半胱氨酸。余下的D-2-氨基噻唑啉-4-羧酸再经消旋酶作用变成DL-型。反复进行，不断生成L-半胱氨酸。
(2)酶法生产核苷酸核苷酸在食品和医药等方面有重要用途，可利用多种酶进行生产。例如：用桔青酶或产黄青酶产生的5ˊ-磷酸二酯酶水解核糖核酸（RNA），生产各种5ˊ-核苷酸。用腺苷酸脱氨酶水解AMP生成肌苷酸（IMP）。用核苷磷酸化酶，可催化肌苷进行磷酸化生成5ˊ-肌苷酸，催化鸟苷生成5ˊ-鸟苷酸等。用核苷酸磷酸化酶，催化AMP生成ADP和ATP等。(3)酶法生产有机酸酶法合成有机酸也是结合有机化学合成与生化合成的长处而构成的生产工艺，已经用于工业生产的有苹果酸，酒石酸和长链脂肪酸等。此外乳酸等也可用于酶法合成。
如：苹果酸的酶法合成?L-苹果酸在食品工业为一优良的酸味剂，在化工，印染，医药品生产上也有不少用途，可用发酵法和酶法生产，工业上以富马酸为原料，通过微生物富马酸酶合成的。
3.加酶增加产品的使用效果在某些轻工产品中添加一定量的酶，可以显著地增加产品的使用效果。
（1） 加酶洗涤剂：–洗涤用的酶制剂需要满足下列条件：
（1）碱性条件（pH 9-10）下能够有效洗涤；
（2）表面活性剂（LAS, AOS）存在下，很少失活；
（3）在荧光染料、漂白剂、香料等洗涤剂辅助成分存在下不失活；
（4）在洗涤温度下能有效地发挥作用。
–衣服上有机污垢15-40%以蛋白质与纤维结合的方式存在，如果将酶加入洗衣粉中, 用酶来分解污物上的蛋白质、油脂及淀粉类物质,能有效地除去污垢，大大缩短洗涤时间，防止衣物发黄变色,提高洗涤效果。（2）加酶牙膏，牙粉和漱口水：将适当的酶添加到牙膏，牙粉或漱口水中，可以利用酶的催化作用，增加洁齿效果，减少牙垢并防止龋齿的发生。可添加到洁齿用品中的酶有蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶和右旋糖酐酶等。其中右旋糖酐酶对预防龋齿有显著效果。（3）加酶饲料：酶应用于饲料，其作用一为补充畜禽内源酶的不足。，有助于提高畜禽健康水平和生产性能。另一作用为解除饲料中抗营养因子。所谓抗营养因子，是指饲料中对养分起拮抗作用的一些成分。
（4）加酶护肤品在各种护肤品及化妆品中添加超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶、尿酸酶和弹性蛋白酶等，可有效地提高护肤效果。因溶菌酶可以水解细菌的细胞膜，除治疗以外，还可以做润肤霜、洗发膏和洗面奶等。NovoNordisk 公司生产与化妆品相关的制品，含有可以清除皮肤表面死亡的细胞的蛋白酶。另外为了清除皮肤表面的自由基，使用抗衰老的超氧化物歧化酶也在计划之中。
第二节 酶在医药方面的应用随着对疾病发生的分子机制的深入了解，医药用酶的应用范围越来越广泛。酶在医药领域的应用主要是用于疾病的诊断、治疗和制造药物。一、疾病诊断方面的应用疾病治疗效果的好坏，在很大程度上决定于诊断的准确性。疾病诊断的方法很多，其中酶学诊断发展迅速。由于酶催化的高效性和特异性，酶学诊断方法具有可靠、简便又快捷的特点，在临床诊断中已被广泛应用。酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。
1.根据体液内酶活力的变化诊断疾病 一般健康人体液内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。若出现某些疾病，则体液内的某种或某些酶的活力将会发生相应的变化。故此，可以根据体液内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。
2. 用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病? 酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量从而诊断某些疾病。例如：利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的联合作用，检测血液或尿液中葡萄糖的含量，从而作为糖尿病临床诊断的依据，这两种酶都可以固定化后制成酶试纸或酶电极，可十分方便的用于临床检测。
?此外，酶标免疫测定在疾病诊断方面的应用也越来越广泛。所谓酶标免疫测定，是先把酶与某种抗体或抗原结合，制成酶标记的抗体或抗原。然后利用酶标抗体（或酶标抗原）与待测定的抗原（或抗体）结合，再借助于酶的催化特性进行定量测定，测出酶-抗体-抗原结合物中的酶的含量，就可以计算出欲测定的抗体或抗原的含量。通过抗体或抗原的量就可诊断某种疾病。
二、疾病治疗方面的应用由于酶具有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有种类多，用量少，纯度高的特点。1.蛋白酶蛋白水解酶是能够使蛋白质构造和功能发生变化的酶，它对于细胞运动、组织的破坏和变形、激素的活化、受体和配基的相互作用、感染、细胞增殖等过程都有影响。蛋白酶可用于治疗多种疾病，是临床上使用最早、用途最广的药用酶之一。目前临床上使用的蛋白酶大部分来自于动物和植物，如胰蛋白酶、胃蛋白酶和菠萝蛋白酶等。
蛋白酶在医药领域的应用最初是在消化药上，用于治疗消化不良和食欲不振。2.溶菌酶 溶菌酶也是一种应用广泛的药用酶，具有抗菌、消炎、镇痛等作用。用于治疗手术性出血、咯血、鼻出血，分解脓液，消炎镇痛，治疗外伤性浮肿，增强放射线治疗的效果等。
3.超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（SOD）催化超氧负离子（O2ˉ）进行氧化还原反应，使机体免遭O2ˉ的损害。因此SOD具有抗辐射作用，并对红斑狼疮、皮炎、结肠炎及氧中毒等疾病有显著疗效。4.L-天门冬酰胺酶L-天门冬酰胺酶是第一种用于治疗白血病的酶。因为癌细胞生长时需要天冬酰氨。L-天门冬酰胺酶可以切断天冬酰胺的供给，因此对癌症，特别是白血病的治疗有显著疗效。三、在药物生产方面的应用酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。1.青霉素酰化酶
2.β-酪氨酸酶β-酪氨酸酶可催化L-酪氨酸或邻苯二酚生成二羟苯丙氨酸（DOPA,多巴）。反应如下。多巴(Dopa)是治疗帕金森氏(Parkinson)综合症的一种重要药物。
所谓帕金森氏综合症是1817年英国医师Parkinson所描述的一种大脑中枢神经系统发生病变的老年性疾病。其主要症状为手指颤抖，肌肉僵直，行动不便。病因是由于遗传原因或人体代谢失调，不能由酪氨酸生成多巴或多巴胺（一种神经传递介质）。
3.核苷磷酸化酶? 核苷中的核糖被阿拉伯糖取代可以形成阿糖苷。阿糖苷具有抗癌和抗病毒的作用，是令人注目的药物。其中阿糖腺苷疗效显著。阿糖腺苷（腺嘌呤阿拉伯糖苷）可由嘌呤核苷磷酸化酶催化阿糖尿苷（尿嘧啶阿拉伯糖苷）转化而成。
?由阿糖尿苷生成阿糖腺苷的反应分两步完成。首先阿糖尿苷在尿苷磷酸化酶的作用下生成阿拉伯糖-1-磷酸；然后阿糖-1-磷酸再在嘌呤核苷磷酸化酶的作用下生成阿糖腺苷。
4.无色杆菌蛋白酶人胰岛素与猪胰岛素只有在B 链第30位的氨基酸不同。无色杆菌（Achromobacter lydicus）蛋白酶可以特异性地催化胰岛素B链羧基末端（第30位）上的氨基酸置换反应，由猪胰岛素 （Ala -30）转变为人胰岛素（Thr -30），以增加疗效。具体过程为：在无色杆菌蛋白酶作用下，猪胰岛素第30位的丙氨酸被水解除去，然后在同一酶的作用下使之与苏氨酸丁脂偶联。然后用三氟乙酸（TFA）和苯甲醚除去丁醇，即得到人胰岛素。
第三节 在分析检测方面的应用
?利用酶催化作用的高度专一性对物质进行检测，已成为物质分析检测的重要手段。
?用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的。故此，要进行酶法检测必须具备两个基本条件：一是要有专一性高的酶，二是对酶作用后的物质变化要有可靠的检测方法。
?酶法检测一般包括两个步骤。第一步是酶反应。将酶与样品接触，在适宜的条件下（包括温度、pH值、抑制剂和激活剂浓度等）进行催化反应。第二步是测定反应前后物质的变化情况，即测定底物的减少，产物的增加或辅酶的变化等。
?根据酶反应的不同，酶法检测可以分成单酶反应，多酶偶连反应和酶标免疫反应等三类。
1. 单酶反应检测利用单一种酶与底物反应，然后用各种方法测出反应前后物质的变化情况，从而确定底物的量。这是最简单的酶法检测技术。使用的酶可以是游离酶，也可以是固定化酶或单酶电极等。现举例说明如下：
（1） L-谷氨酸脱羧酶
L-谷氨酸脱羧酶专一地催化 L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和二氧化碳，生成的二氧化碳可以用华勃氏呼吸仪或二氧化碳电极等测定。该酶已经广泛地用于L-谷氨酸的定量分析。可使用的酶形式有游离酶和酶电极。
（2） 脲酶
脲酶能专一地催化尿素水解生成氨和二氧化碳。通过气体检测或者使用氨电极、二氧化碳电极等，测出氨或二氧化碳的量，从而确定尿素的含量。
（3） 葡萄糖氧化酶
根据葡萄糖氧化酶能专一地氧化葡萄糖这一特点，可利用它进行葡萄糖的检测。葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖的氧化反应生成葡萄糖酸和双氧水，反应中所消耗氧的量或生成的葡萄糖酸的量都与葡萄糖有定量的关系。用pH电极、氧电极和Pt（H2O2）电极等可以测定酸的生成或氧的减少来确定葡萄糖的量。该酶已广泛地用于食品、发酵工业和临床诊断等方面。
（4） 胆固醇氧化酶
该酶催化胆固醇与氧反应生成胆固醇（胆甾烯酮）。通过气体检测技术或者使用氧电极来测出氧的减少量，就可以确定胆固醇的含量。
（5） 虫荧光素酶
该酶可催化荧光素（LH2）与腺三磷（ATP）反应，使ATP水解生成AMP和焦磷酸，放出的能量转变为光。通过光度计或光量计测出光量，就可以测出ATP的量。可以将虫荧光素酶固定在光导纤维上，并与光量计结合组成酶荧光传感器，可以快速、简便灵敏地检测出ATP。
单酶催化反应进行物质检测具有简便、快捷、灵敏、准确的特点，是酶法检测中最广泛采用的技术。固定化酶与能量转换器密切结合组成的单酶电极，使酶法检测朝连续化、自动化的方向发展。
2. 酶偶联反应检测 多酶偶联反应检测是利用两种或两种以上酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。有些物质经过单酶催化反应后，对物质变化情况进行检测时会受到其他物质的干扰，表现为检测的灵敏度不高等现象，使检测难于进行或检测结果的精确度不够。为此可采用两种或两种以上的酶进行连续式或平行式的偶连反应，使酶法检测易于进行并达到较理想的结果。利用多酶偶联反应检测已有不少成功的例子。
①萄糖氧化酶与过氧化物酶偶联
②β-半乳糖苷酶与葡萄糖氧化酶偶联
③己糖激酶与葡萄糖氧化酶偶联
3. 酶标记免疫反应检测酶标记免疫反应检测首先是将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。若要测定样品中抗原含量，就将酶与欲测定的对应抗体结合，制成酶标抗体，反之，若要测定抗体，则需先制成酶标抗原。然后将酶标抗体（或酶标抗原）与样品液中待测抗原（或抗体），通过免疫反应（或抗体）结合在一起，形成酶-抗体-抗原复合物。通过测定复合物中酶的含量就可得出欲测定的抗原或抗体的量。
常用于酶标免疫测定的酶有碱性磷酸酶和过氧化氢酶等。
第四节 酶在生物工程中的应用
生物工程主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等4个方面内容。
一、酶在除去细胞壁方面的应用
微生物细胞和植物细胞的表层部有细胞壁。细胞壁对微生物和植物维持其细胞的形状和结构起着重要作用，可保护细胞遭外界因素的破坏。但在生物工程方面，很多时候都需要除去细胞壁。例如：
(1)胞内物质的提取
(2)原生质体的制备：
?根据不同纳脑的结构和细胞壁组分的不同，除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。现分述如下
①除去细菌细胞壁
②除去酵母细胞壁
③除去霉菌细胞壁
④植物细胞壁的破除
二、酶在大分子切割方面的应用
生物工程经常与生物大分子打交道。在许多情况下需要把大分子切割成较小的分子或片断，以便在生物工程的有关领域使用。在生物大分子的切割过程中往往要求在特定的位点上进行，这就只能借助于具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能做到。
1.限制性核酸内切酶
2.DNA外切核酸酶
3.碱性磷酸酶
4.核酸酶S1
三、酶在分子拼接方面的应用
?许多酶都具有分子拼接能力，能将两个或多个分子连接在一起而合成较大的分子。这些酶类在生物体内是至关重要的，它们催化各种各样的生物合成反应。
1.DNA连接酶
2.DNA聚合酶
DNA聚合酶的共同特点是：
(1)需要模板或引物。
(2)不能起始新的DNA链的合成。
(3)催化脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3’—OH末端。
(4)合成的方向是从5’—末端至3’—末端。
3.末端脱氧核苷酸转移酶
4.反转录酶
| 课件名称： | 酶工程（enzyme engineering）教案 |
| 课件分类： | 生物 |
| 课件类型： | 电子教案 |
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