思考和练习 一、绪论—分子生物学实验的诞生和发展 ????1.简要概括分子生物学的发展历程。 ????2.分子生物学实验技术的发展给生命科学带来的影响如何？ 二、分子生物学实验基本知识简介 ????1.分子生物学实验常用的工具酶有哪些？它们的结构特点、功能及用途是什么？ ????2.分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？每种载体在分子生物实验中的功能是什么？ ????3.克隆载体和表达载体有何不同点？ ????4.如何保证克隆基因的保真性？ ????5.如何选择合适的载体？ ????6.都有哪些受体细胞？受体细胞的特点什么？ ????7.载体和受体（宿主）细胞之间的关系是什么？ ????8.如何选择合适的受体细胞？ ????9.如何获得和鉴定目的基因？ ????10.外源基因导入受体细胞的方法有哪些？各有什么优缺点？ ????11.如何筛选重组子？ 三、分子生物学实验室常用仪器设备及其使用 ????1.分子生物学实验常规仪器都有哪些？它们的适用范围是什么？ ????2.离心机在使用时应该注意什么？ ????3.除了常规仪器设备外，还有那些仪器设备可用于分子生物学实验？ 四、大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 ????1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ ????2.为什么要设置阴性对照？ ????3.如阴性对照中长出菌，原因？ ????4.在Amp培养板中，菌的密度过高或培养时间过长时会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是 Amps的，原因？ ????5.影响转化效率的因素有哪些？ ????6.还有哪些方法可以将外源基因导入受体细胞？各有什么优缺点？ 五、质粒DNA的提取及其定性定量分析 ????1.如何去除下列物质（蛋白、基因组DNA、RNA、糖类、脂类、小分子物质）？ ????2.用什么方法能够定量核酸？ ????3.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ ????4.如何提高核酸电泳的分辨率？ ????5.EB染色的特点和注意事项是什么？ ????6.核酸分离过程中酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？ ????7.在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？ ????8.纯化的核酸时如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？ ????9.有哪些因素影响核酸的沉淀？ 六、PCR基因扩增及扩增产物的回收 ????1.怎样保证PCR扩增的特异性和产率？ ????2.如何设计PCR引物？ ????3.在PCR引物中引入酶切位点时应注意什么？ ????4.PCR扩增体系中为什么要有镁离子？ ????5.如何优化PCR扩增体系？ ????6.如何优化PCR扩增的条件？ ????7.核酸回收时应该注意什么？ ????8.如何提高琼脂糖凝胶电泳的分辨率 ????9.核酸的染色方法有哪些？各有什么优缺点？使用时应该注意什么？ ????10.影响核酸的OD260、OD280的因素有哪些？ 七、DNA重组（限制性酶切和连接） ????1.什么是DNA重组？它包括哪些因素？ ????2.如何提高DNA的重组效率？ ????3.筛选重组子的方法有哪些？ ????4.对核酸进行限制性酶切时应注意什么？ ????5.转化质粒DNA和转化重组DNA有什么不同？ 八、哺乳动物基因组DNA的分离及定性定量分析 ????1.提取基因组DNA时应注意些什么？ ????2.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ ????3.大分子基因组DNA的凝胶电泳应注意什么？ 九、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测、设计实验讨论 ????1.外原基因在原核生物中表达时，如何控制和优化表达条件？ ????2.外原基因的融合表达和非融合表达各有什么优缺点？ ????3.超声波破碎菌体时需要注意些什么？ 十、植物总RNA的提取及其定性定量分析 ????1.在进行RNA实验时应该注意哪些方面？ ????2.在纯化RNA时，DEPC的作用是什么？ ????3.为什么最后要去掉残留的DEPC？ ????4.如何分离提取脂类和糖类含量高的组织的总RNA？ ????5.如何分离提取RNA酶含量或活性含量高的组织的总RNA？ ????6.如何分离提取mRNA？ ????7.还有其它简单的方法提取RNA吗？ 十一、蛋白质印迹 ????1.Western时应注意什么？ ????2.如何提高SDS－PAGE的分辨率？ ????3.Western的检测方法有哪些？它们各有什么优缺点？ ????4.如何提高Western检测的灵敏度？ ????5.Western和其它分子杂交有什么异同点？ 十二、Southern（演示） ????1.Southern杂交时，如何减少非特异性结合？ ????2.探针的标记方法有哪些？ ????3.如何获得探针？ ????4.Southern杂交后的检测方法有哪些？ 十三、DNA序列测定（演示） ????1.DNA序列分析都有哪些方法？每种方法各有什么优缺点？ ????2.变性聚丙烯凝胶电泳时应注意什么？ ????3.银染色法的基本原理是什么？ ????4.银染色时应注意什么？ 十四、RT-PCR及mRNA的差异显示 ????1.变性聚丙烯凝胶电泳时应注意什么？ ????2.银染色法的基本原理是什么？ ????3.银染色时应注意什么？ ????4.是否还有别的实验技术检测mRNA的差异？每种方法各有什么优缺点？