·106-(总第147期)水利渔业2006年第26卷第5期草鱼呼肠孤病毒的研究进展肖雪，颜其贵，欧洋，曹洪志，樊汉樵，李冰，赖维莉，张传斌，周磊，冯停，林涛，刘亚
(四川农业大学动物生物技术中心，四川雅安625014)
摘要:草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒，严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成，编码11种结构多肤。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶，在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果，提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性，初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。
关健词:草鱼出血病;草鱼呼肠孤病毒(GCRV) ; dsRNA
中图分类号:5941.41文献标识码;A文章编号:1003一1278 (2006) 05 -0106 -04
草鱼出血病是一种危害草鱼的高度传染性、致死性的病毒性传染病。1978年开始报道这种病的病原体是一种病毒，并分离鉴定了毒株854的理化特性和生物学特性。1983年从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒
(Grass Carp Haemorrhage Virus,GCHV )，并鉴定为呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属的一个新成员川。水生呼肠孤病毒在世界范围内造成了极大的危害，不仅能引起淡水鱼类的感染，而且还能感染海鱼，现在已证实2002年新加坡大面积发生的马鱿鱼流行病是水生呼肠孤病毒引起川。草鱼出血病病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，现在已有资料证实是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株川，不仅感染草鱼，而且还可以感染青鱼，是鱼种培育阶段的最大病害。1995年，病毒分类命名委员会对该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovi-
rus,GCRV )。
2890，且能保持14h以上的稳定，因此病毒流行具有季节性。病毒毒力的差异与保存温度、时间有关。比较我国学者分离并保存的具有感染性的草鱼出血病病毒
GCRV873,GCRV875,GCRV876，发现这3株病毒在一3090
保存10年仍然能够感染草鱼肾细胞(CIK)，在病毒毒力测定中，3种病毒感染细胞的滴度均在102TCID,,/mL以上，比新分离的GCRV991略低。经过3一4代的传代后，
其滴度均有所升高，GCRV873达到最高6.4 x 10"TCID50/
ML1s 1。
现在已证实了GCRV具有较弱的凝集人的“O"型红细胞的能力，也能引起鸡红细胞高滴度凝集，而且这种凝集能被特异性抗血清所抑制[[6]。
1形态特征
病毒形态结构与正呼肠孤病毒相似。病毒粒子为20
面体，5,3,2对称的球形颗粒，直径为65一72 rim，核心直径约为50 nm，无囊膜，具有双层衣壳。外衣壳约9 nn,
上面有20个中空型的颗粒;内衣壳5,2 run，用a糜蛋白酶消化外衣壳后，可见内衣壳上面有12个钉状物突起，
而对GCRV873精细结的研究中发现，内衣壳上只有6个圆柱形钉状物川。
2理化特性
病毒粒子在pH 3一10的范围内较稳定，56℃下作用
30 min仍具有感染性，对氯仿和乙醚均不敏感。完整的病毒粒子在CSCI密度梯度离心的浮力密度为1.37岁
c3cm，蔗糖梯度离心则为1,305 g/cm3，沉降系数为550Sa
病毒核心能合成RNA聚合酶，酶活性的最适温度是
收稿日期:2005一12-20
通讯作者:颜其贵
作者简介:肖雪，1981年生，女，四川省雅安人，在读硕士研究生，主要从事病原分子生物学研究。
3培养特性
该病毒能在草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼囊胚细胞系
(GCB)、草鱼性腺细胞(CO),CIK、草鱼吻端细胞(ZC-
7901)、脚鱼囊胚培养细胞(CAB)、草鱼胚胎细胞系(CP-
80)等中增殖，对BHK,Vero等哺乳动物的细胞不敏感。
CIK细胞是该病毒最敏感的细胞系。不同的毒株对不同细胞系的敏感性又有所差异。用6种细胞系:CIK,CAB,
肥头鲤上皮细胞(FHM )、鱼卵巢细胞(GCO),鲤鱼的上皮癌纸状细胞(EPC)和给鱼的输卵管细胞系(CCO)接种从越南分离出的毒株GCRV一V,GCRV9014和
GCRV873E71,GCRV873能够引起CIK,CAB,FHM和GCO
典型的细胞病变，但GCRV一V和GCRV9014在感染的6
种细胞系中，均未观察到细胞病变。GCRV一V在盲传3
代后通过免疫反应能够检测到病毒粒子。我国分离的毒株GCRV991能在CIK,FHM细胞系上很好地增殖，而在
EPC上不能生长，同其它毒株一样，在哺乳动物的BHK,
Vero细胞系上不能生长。
4病毒组织嗜性和病理变化
病毒主要经鱼鳃进人鱼体，4d后发病，5一7d后表现出明显的出血症状，进人死亡高峰。人工感染后，在肾脏组织细胞内观察到大小约为50nm的病毒，散布于细胞质内，在肠组织细胞内观察到大小为70一78nm的病毒粒
2006年第26卷第5期水利渔业(总第147期)·107
子，形态与离心提纯的病毒粒子相同。因此，无外衣壳的未成熟病毒存在于肾脏，成熟的病毒粒子是在肠道内。
各脏器的血管和微血管内皮细胞也可以观察到病毒[[al0
病毒破坏循环系统，使血管扩张，凝血作用减弱，血清乳酸脱氢酶同工酶的相对活性紊乱，鱼体生理功能严重失调，进一步引发各器官的病变和功能的丧失。病毒对肾脏和肠道的直接作用进一步加剧了循环系统的破坏。病毒对部分脏器(如肝脏)和免疫系统具有破坏力，
不是因为病毒的直接作用，而是病毒感染后产生的一些可溶性因子以及血管损伤的进一步发展。
5 GCRV分子生物学
5.1 GCRV基因组结构
目前水生呼肠孤病毒属的病毒以RNA杂交为依据可以分为7个亚型。水生呼肠孤病毒基因组具有以下共同特征:RNA3’末端不具有Poly ( A)尾;就某种病毒而言，
各dsRNA基因组片段5‘和3‘末端都享有相同的4一6个
by的两端保守序列，紧连特异的倒转重复序列。病毒具有内源性RNA聚合酶，可以进行体外转录。
GCRV基因组由11条分节段dsRNA组成，总分子量为15.46 x 106 Dalton，其中最小的片段0.55 x 106Dalton,
最大的片段为3.1 x 106Dalton。由于病毒基因组是分节段的，造成不同病毒毒株的复杂性和高度可变性。根据基因片段在聚丙烯酞胺凝胶上的迁移率，由慢到快，基因组片段按分子量分为3个组，分别命名为Ll一3,M4一6,
S7一11。随毒株的不同，分子量有所差别(0.3x1护一3.1
x 106 Dalton) o GCRV873模型的研究表明，每个片段都具有5' (GUUAUUU)和3'( UUCAUC)的保守序列[9-11]0
这些末端插人重复序列是相当保守的，被认为是病毒基因组的一般特征。除Sll外，每个片段只编码1种多肤。
5.2基因组的转录和翻译
病毒基因组的转录分为早期转录和晚期转录。早期转录是RNA转录酶以病毒dsRNA为模板;晚期转录是以子代病毒基因组为模板。GCRV早期基因转录是从病毒感染细胞4h后开始，10h后获得晚期基因的转录产物，其
mRNA的大小和数目大体上与病毒基因组相一致〔121。具体过程是宿主细胞胞饮吞噬病毒粒子，胞内的溶菌酶消化掉病毒一半的衣壳蛋白，成为多孔状态的亚病毒颗粒，
剩下的外衣壳在转录中保护反应核心，提高转录效率。
在亚病毒颗粒内，转录出的正链RNA通过颗粒上的孔释放到细胞质中，许多新合成的mRNA链与反应核心相连成环形结构扩是反应核心的典型特征。正链RNA即可以翻译成各种蛋白质，也可以作为半基因组装配人壳体中成为前核。前核中的正链RNA才由病毒的聚合酶加倍成为dsRNA和衣壳蛋白组装成为新的病毒体。
我国学者[13]研究GCRV873基因组转录时，发现在病毒基因组外存在许多小分子量的RNA片段。这些片段来源于病毒基因组转录时，原病毒基因组的剪切、重排，因此富含原基因组某一片段3‘端和5'端的保守区和倒转重复区，缺失中间部分。末端保守序列是病毒蛋白筛选
dsRNA进行包装的标志，重复序列是该片段区别于其它片段的特征序列，因此又被错误包装进病毒衣壳形成缺损型病毒颗粒。缺损型颗粒不编码功能性蛋白，能进行自我复制，但是这些小片段遇到了互补片断，就将重组成完整的病毒核酸，重新获得感染性，因此考虑到其安全性问题，缺失型颗粒一般作为研究病毒基因功能的工具。
5.3基因编码的蛋白
现在已经确认病毒粒子有11种结构多肤。我国学者体外翻译GCRV873基因组编码了12条多肤，研究表明，各基因组片段与编码多肤的关系是大体一一对应的，
除S8,S9和Sll编码的多肤与病毒衣壳中的多肤在分子量上无完全对应关系，S11编码2种多肤，推测是体外表达的非成熟中间产物，需要进行修饰，现在未见证实这一推测的报道。S10的翻译能力较弱外。根据基因命名其编码的蛋白为Vpl到Vpl l o VP1一5和Vp10编码的是核心衣壳多肤,VP8,VP9,VP6和VP7编码的是外衣壳多肤〔’心1。现在还不能完全确定报导的这些多肤为结构多肤，但也没有排除它们有属于结构多肤的成分。
M5编码结构蛋白VP5，该蛋白与MRV的内衣壳结构蛋白衅相似。M6编码由648个氨基酸残基组成，分子量68,7KD的外衣壳蛋白。推测该蛋白拥有Asn -42 -
Pro一43蛋白水解位点，进人细胞后容易被水解掉，便与转录产物的释放，该位点与哺乳动物的mul蛋白相似。
Qiu T等〔141用pET载体表达S8，得到由409个氨基酸残基组成，分子量为44KD的内衣壳蛋白，该蛋白与哺乳动物的Sigma2蛋白有密切的联系。对于该蛋白是内衣壳蛋白，还是外衣壳蛋白现在还没有定论[15,16] o Tao Qiu
等〔11]报道S10编码由276个氨基酸组成的外衣壳蛋白，
推测其分子量约为29,7 KD，含1个锌指序列调节基因表达。该蛋白的氨基酸序列与银大马哈鱼水生呼肠孤病毒
S10、条纹妒呼肠孤病毒S10以及哺乳类呼肠孤病毒S4相似的亲水序列，与其它呼肠孤病毒无明显同源性。
我国学者证实VP2具有RNA聚合酶活性，该酶在
RNA病毒中存在高度保守的GDD结构域〔’?〕。VPl表现帽化转录的RNA和甲基转移酶的活性，但是缺失一般甲基转移酶KxDG保守区。VP1在鸟昔酸转移反应中，且
pH <- 6,0时表现出最大活性，使一种组氨酸质子化，这个特点在已知的正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒中具有保守性[18-20]。 VP30具有NTPase及解旋酶活性，绑定dsR-
NAo S9编码的由352个氨基酸组成，分子量为37,7KD
的非结构蛋白，与MRV以及鸟类呼肠孤病毒科(MRV)的
QNS蛋白有密切的联系，与王炜等[[21〕对GCRV873的研究是一致的。该蛋白的二级结构含有40.1%。一螺旋和
49.4%0一折叠片。对该蛋白的生化实验和免疫性分析还未见进一步的报道。部分基因片段不止含有一个起始密码子，所以部分基因片断可能编码一种蛋白。
6 GCRV的免疫性
GCRV与其它已知的鱼类呼肠孤病毒无交叉抗原，不同毒株之间也存在抗原性差异。病毒结构蛋白VPl,
VP5,VP6,VP9的抗血清具有中和效价，VP6诱导的中和抗体效价最高，极可能是主要的中和抗原。GCRV低温下
·108(总第147期)水利渔业2006年第26卷第5期保存时，外衣壳蛋白会不完全地自动降解，丧失了部分具有免疫性的多肤，因此其中和效价略低于病毒粒子，渗透性高于病毒粒子，有利于提高免疫效果[[217。目前GCRV
还无血清型分类的报道。我国学者研究表明GCRV有5
种多肤(VP3,VP8,VP9,VP10,VP11)含有糖成分，是糖蛋白[22 7。
试应用编码该蛋白的基因制作基因工程亚单位苗。因此，在进行流行病学调查的基础上，能够构建VP6外壳蛋白基因工程亚单位疫苗。
参考文献:
7病毒的检测
对病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法。肾脏是电镜观察病毒粒子的最佳部位。细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酞胺凝胶电泳
(PAGE)等经典方法虽然较为复杂，但仍是诊断GCRV公认的有效手段。现代分子生物学新技术大大提高了检测效率。杨广志等【237建立的葡萄珠菌A蛋白协同凝集试验(SPA一。oA)可以快速高效准确地检测组织中的病毒，
而且简单易操作，对设备没有要求。何福林等[(67建立醛化鸡红细胞的HA和HI实验能快速检测病毒，而且由于醛化的鸡红细胞在4℃下保存1年多仍具有新鲜红细胞表面受体活性，因此不会影响凝集效果。常规ELISA在草鱼出血病病的检测上已有应用，但检测速度较慢。邵健忠等{247报道的Dot一ELISA能够检出3pg的GCRV，比常规ELISA提高了20倍，而且更快速易行。RT一PCR是近年来发展最为迅速的检测技术，该技术能够检测痕量样品，敏感性和特异性都是最高的，最小检测量甚至可达
0.Ipg病毒核酸，在病毒感染的各个时期都可检测，是病毒早期诊断和预防的主要技术四。
8疫苗的研究
在该病的防治中，主要是采取用灭活苗预防。现在由于该病毒无血清型分类，病毒各毒株间基因组也存在较大的差异，因此疫苗制作的关键就在于筛选免疫原性强的毒株。现在临床上应用国家农业部批准的甲醛灭活苗[(267。组织浆灭活疫苗和弱毒苗在生产上应用已取得了较好效果，免疫保护力在80%以上，免疫力可持续13个月，而通过多代培养进行减毒的弱毒活疫苗，采用注射法接种后免疫保护力也在85%以上，但安全性较差，有返祖现象出现。在疫苗的开发中，免疫途径也是影响疫苗效果的重要因素。目前，针对鱼类的免疫途径主要有注射、
浸泡。注射耗费大量的人力物力，对鱼类造成应激反应，
而浸泡的效果又不是很好。新型疫苗的开发也要考虑到免疫途径。
，展望
随着分子生物学的飞速发展，对GCRV分子结构和其相关作用机制的认识，为GCRV的预防、控制及治疗提供了新的思考。①现在已经开发出了干涉载体，应用
RNA干涉(RNAi)抑制病毒的复制已经成为可能。GCRV
重要酶类具有高度保守性，可以作为RNAi的靶基因，在复制的早期就发生抑制，把病毒对细胞的损害降低到最小程度。RNAi也是研究敲除基因功能的一种技术。②
尽管研究证实了VP6是主要中和抗原，但是还没有人尝
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第四，大貌第M时相卵母细胞退化过程中，滤泡细胞侵人卵内吞噬卵黄的过程及成熟卵母细胞未排出体外而进人衰亡的演变过程比鱼类更为激烈。
通过对大貌的精、卵巢切片观察发现，即使在成熟的精巢切片中可同时找到精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子，在成熟的卵巢切片中可找到不同时相的卵母细胞，这充分表明大貌的性腺发育是不同步的。这是大鱿对自然生态环境的一种特殊适应，确保种群的延续性。这一现象也为大貌的人工模拟生态繁殖奠定了基础，可以对大貌进行强化培育，使其能多次产卵和排精，并且是在同一时间排精和产卵。
大貌卵母细胞发育过程中，细胞学变化过程是由小逐渐增大的过程，第W,V时相的卵母细胞增大到了极点，成熟卵可达5一9mm，此时核膜消融，核仁分组，核偏位。精母细胞发育是由大到小，细胞质逐渐减少，嗜碱性逐渐增强，内部结构被遮盖，成熟变态后精子头部呈长辣椒状，尾部较长，粗壮有力，比起大多数鱼类精子发生过程有独特之处。
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草鱼出血病是一种危害草鱼的高度传染性、致死性的病毒性传染病。1978年开始报道这种病的病原体是一种病毒，并分离鉴定了毒株854的理化特性和生物学特性。1983年从草鱼出血病中分离出一株草鱼出血病病毒
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病毒形态结构与正呼肠孤病毒相似。病毒粒子为20
面体，5,3,2对称的球形颗粒，直径为65一72 rim，核心直径约为50 nm，无囊膜，具有双层衣壳。外衣壳约9 nn,
上面有20个中空型的颗粒;内衣壳5,2 run，用a糜蛋白酶消化外衣壳后，可见内衣壳上面有12个钉状物突起，
而对GCRV873精细结的研究中发现，内衣壳上只有6个圆柱形钉状物川。
2理化特性
病毒粒子在pH 3一10的范围内较稳定，56℃下作用
30 min仍具有感染性，对氯仿和乙醚均不敏感。完整的病毒粒子在CSCI密度梯度离心的浮力密度为1.37岁
c3cm，蔗糖梯度离心则为1,305 g/cm3，沉降系数为550Sa
病毒核心能合成RNA聚合酶，酶活性的最适温度是
收稿日期:2005一12-20
通讯作者:颜其贵
作者简介:肖雪，1981年生，女，四川省雅安人，在读硕士研究生，主要从事病原分子生物学研究。
3培养特性
该病毒能在草鱼鳍条细胞(CF)、草鱼囊胚细胞系
(GCB)、草鱼性腺细胞(CO),CIK、草鱼吻端细胞(ZC-
7901)、脚鱼囊胚培养细胞(CAB)、草鱼胚胎细胞系(CP-
80)等中增殖，对BHK,Vero等哺乳动物的细胞不敏感。
CIK细胞是该病毒最敏感的细胞系。不同的毒株对不同细胞系的敏感性又有所差异。用6种细胞系:CIK,CAB,
肥头鲤上皮细胞(FHM )、鱼卵巢细胞(GCO),鲤鱼的上皮癌纸状细胞(EPC)和给鱼的输卵管细胞系(CCO)接种从越南分离出的毒株GCRV一V,GCRV9014和
GCRV873E71,GCRV873能够引起CIK,CAB,FHM和GCO
典型的细胞病变，但GCRV一V和GCRV9014在感染的6
种细胞系中，均未观察到细胞病变。GCRV一V在盲传3
代后通过免疫反应能够检测到病毒粒子。我国分离的毒株GCRV991能在CIK,FHM细胞系上很好地增殖，而在
EPC上不能生长，同其它毒株一样，在哺乳动物的BHK,
Vero细胞系上不能生长。
4病毒组织嗜性和病理变化
病毒主要经鱼鳃进人鱼体，4d后发病，5一7d后表现出明显的出血症状，进人死亡高峰。人工感染后，在肾脏组织细胞内观察到大小约为50nm的病毒，散布于细胞质内，在肠组织细胞内观察到大小为70一78nm的病毒粒
2006年第26卷第5期水利渔业(总第147期)·107
子，形态与离心提纯的病毒粒子相同。因此，无外衣壳的未成熟病毒存在于肾脏，成熟的病毒粒子是在肠道内。
各脏器的血管和微血管内皮细胞也可以观察到病毒[[al0
病毒破坏循环系统，使血管扩张，凝血作用减弱，血清乳酸脱氢酶同工酶的相对活性紊乱，鱼体生理功能严重失调，进一步引发各器官的病变和功能的丧失。病毒对肾脏和肠道的直接作用进一步加剧了循环系统的破坏。病毒对部分脏器(如肝脏)和免疫系统具有破坏力，
不是因为病毒的直接作用，而是病毒感染后产生的一些可溶性因子以及血管损伤的进一步发展。
5 GCRV分子生物学
5.1 GCRV基因组结构
目前水生呼肠孤病毒属的病毒以RNA杂交为依据可以分为7个亚型。水生呼肠孤病毒基因组具有以下共同特征:RNA3’末端不具有Poly ( A)尾;就某种病毒而言，
各dsRNA基因组片段5‘和3‘末端都享有相同的4一6个
by的两端保守序列，紧连特异的倒转重复序列。病毒具有内源性RNA聚合酶，可以进行体外转录。
GCRV基因组由11条分节段dsRNA组成，总分子量为15.46 x 106 Dalton，其中最小的片段0.55 x 106Dalton,
最大的片段为3.1 x 106Dalton。由于病毒基因组是分节段的，造成不同病毒毒株的复杂性和高度可变性。根据基因片段在聚丙烯酞胺凝胶上的迁移率，由慢到快，基因组片段按分子量分为3个组，分别命名为Ll一3,M4一6,
S7一11。随毒株的不同，分子量有所差别(0.3x1护一3.1
x 106 Dalton) o GCRV873模型的研究表明，每个片段都具有5' (GUUAUUU)和3'( UUCAUC)的保守序列[9-11]0
这些末端插人重复序列是相当保守的，被认为是病毒基因组的一般特征。除Sll外，每个片段只编码1种多肤。
5.2基因组的转录和翻译
病毒基因组的转录分为早期转录和晚期转录。早期转录是RNA转录酶以病毒dsRNA为模板;晚期转录是以子代病毒基因组为模板。GCRV早期基因转录是从病毒感染细胞4h后开始，10h后获得晚期基因的转录产物，其
mRNA的大小和数目大体上与病毒基因组相一致〔121。具体过程是宿主细胞胞饮吞噬病毒粒子，胞内的溶菌酶消化掉病毒一半的衣壳蛋白，成为多孔状态的亚病毒颗粒，
剩下的外衣壳在转录中保护反应核心，提高转录效率。
在亚病毒颗粒内，转录出的正链RNA通过颗粒上的孔释放到细胞质中，许多新合成的mRNA链与反应核心相连成环形结构扩是反应核心的典型特征。正链RNA即可以翻译成各种蛋白质，也可以作为半基因组装配人壳体中成为前核。前核中的正链RNA才由病毒的聚合酶加倍成为dsRNA和衣壳蛋白组装成为新的病毒体。
我国学者[13]研究GCRV873基因组转录时，发现在病毒基因组外存在许多小分子量的RNA片段。这些片段来源于病毒基因组转录时，原病毒基因组的剪切、重排，因此富含原基因组某一片段3‘端和5'端的保守区和倒转重复区，缺失中间部分。末端保守序列是病毒蛋白筛选
dsRNA进行包装的标志，重复序列是该片段区别于其它片段的特征序列，因此又被错误包装进病毒衣壳形成缺损型病毒颗粒。缺损型颗粒不编码功能性蛋白，能进行自我复制，但是这些小片段遇到了互补片断，就将重组成完整的病毒核酸，重新获得感染性，因此考虑到其安全性问题，缺失型颗粒一般作为研究病毒基因功能的工具。
5.3基因编码的蛋白
现在已经确认病毒粒子有11种结构多肤。我国学者体外翻译GCRV873基因组编码了12条多肤，研究表明，各基因组片段与编码多肤的关系是大体一一对应的，
除S8,S9和Sll编码的多肤与病毒衣壳中的多肤在分子量上无完全对应关系，S11编码2种多肤，推测是体外表达的非成熟中间产物，需要进行修饰，现在未见证实这一推测的报道。S10的翻译能力较弱外。根据基因命名其编码的蛋白为Vpl到Vpl l o VP1一5和Vp10编码的是核心衣壳多肤,VP8,VP9,VP6和VP7编码的是外衣壳多肤〔’心1。现在还不能完全确定报导的这些多肤为结构多肤，但也没有排除它们有属于结构多肤的成分。
M5编码结构蛋白VP5，该蛋白与MRV的内衣壳结构蛋白衅相似。M6编码由648个氨基酸残基组成，分子量68,7KD的外衣壳蛋白。推测该蛋白拥有Asn -42 -
Pro一43蛋白水解位点，进人细胞后容易被水解掉，便与转录产物的释放，该位点与哺乳动物的mul蛋白相似。
Qiu T等〔141用pET载体表达S8，得到由409个氨基酸残基组成，分子量为44KD的内衣壳蛋白，该蛋白与哺乳动物的Sigma2蛋白有密切的联系。对于该蛋白是内衣壳蛋白，还是外衣壳蛋白现在还没有定论[15,16] o Tao Qiu
等〔11]报道S10编码由276个氨基酸组成的外衣壳蛋白，
推测其分子量约为29,7 KD，含1个锌指序列调节基因表达。该蛋白的氨基酸序列与银大马哈鱼水生呼肠孤病毒
S10、条纹妒呼肠孤病毒S10以及哺乳类呼肠孤病毒S4相似的亲水序列，与其它呼肠孤病毒无明显同源性。
我国学者证实VP2具有RNA聚合酶活性，该酶在
RNA病毒中存在高度保守的GDD结构域〔’?〕。VPl表现帽化转录的RNA和甲基转移酶的活性，但是缺失一般甲基转移酶KxDG保守区。VP1在鸟昔酸转移反应中，且
pH <- 6,0时表现出最大活性，使一种组氨酸质子化，这个特点在已知的正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒中具有保守性[18-20]。 VP30具有NTPase及解旋酶活性，绑定dsR-
NAo S9编码的由352个氨基酸组成，分子量为37,7KD
的非结构蛋白，与MRV以及鸟类呼肠孤病毒科(MRV)的
QNS蛋白有密切的联系，与王炜等[[21〕对GCRV873的研究是一致的。该蛋白的二级结构含有40.1%。一螺旋和
49.4%0一折叠片。对该蛋白的生化实验和免疫性分析还未见进一步的报道。部分基因片段不止含有一个起始密码子，所以部分基因片断可能编码一种蛋白。
6 GCRV的免疫性
GCRV与其它已知的鱼类呼肠孤病毒无交叉抗原，不同毒株之间也存在抗原性差异。病毒结构蛋白VPl,
VP5,VP6,VP9的抗血清具有中和效价，VP6诱导的中和抗体效价最高，极可能是主要的中和抗原。GCRV低温下
·108(总第147期)水利渔业2006年第26卷第5期保存时，外衣壳蛋白会不完全地自动降解，丧失了部分具有免疫性的多肤，因此其中和效价略低于病毒粒子，渗透性高于病毒粒子，有利于提高免疫效果[[217。目前GCRV
还无血清型分类的报道。我国学者研究表明GCRV有5
种多肤(VP3,VP8,VP9,VP10,VP11)含有糖成分，是糖蛋白[22 7。
试应用编码该蛋白的基因制作基因工程亚单位苗。因此，在进行流行病学调查的基础上，能够构建VP6外壳蛋白基因工程亚单位疫苗。
参考文献:
7病毒的检测
对病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法。肾脏是电镜观察病毒粒子的最佳部位。细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酞胺凝胶电泳
(PAGE)等经典方法虽然较为复杂，但仍是诊断GCRV公认的有效手段。现代分子生物学新技术大大提高了检测效率。杨广志等【237建立的葡萄珠菌A蛋白协同凝集试验(SPA一。oA)可以快速高效准确地检测组织中的病毒，
而且简单易操作，对设备没有要求。何福林等[(67建立醛化鸡红细胞的HA和HI实验能快速检测病毒，而且由于醛化的鸡红细胞在4℃下保存1年多仍具有新鲜红细胞表面受体活性，因此不会影响凝集效果。常规ELISA在草鱼出血病病的检测上已有应用，但检测速度较慢。邵健忠等{247报道的Dot一ELISA能够检出3pg的GCRV，比常规ELISA提高了20倍，而且更快速易行。RT一PCR是近年来发展最为迅速的检测技术，该技术能够检测痕量样品，敏感性和特异性都是最高的，最小检测量甚至可达
0.Ipg病毒核酸，在病毒感染的各个时期都可检测，是病毒早期诊断和预防的主要技术四。
8疫苗的研究
在该病的防治中，主要是采取用灭活苗预防。现在由于该病毒无血清型分类，病毒各毒株间基因组也存在较大的差异，因此疫苗制作的关键就在于筛选免疫原性强的毒株。现在临床上应用国家农业部批准的甲醛灭活苗[(267。组织浆灭活疫苗和弱毒苗在生产上应用已取得了较好效果，免疫保护力在80%以上，免疫力可持续13个月，而通过多代培养进行减毒的弱毒活疫苗，采用注射法接种后免疫保护力也在85%以上，但安全性较差，有返祖现象出现。在疫苗的开发中，免疫途径也是影响疫苗效果的重要因素。目前，针对鱼类的免疫途径主要有注射、
浸泡。注射耗费大量的人力物力，对鱼类造成应激反应，
而浸泡的效果又不是很好。新型疫苗的开发也要考虑到免疫途径。
，展望
随着分子生物学的飞速发展，对GCRV分子结构和其相关作用机制的认识，为GCRV的预防、控制及治疗提供了新的思考。①现在已经开发出了干涉载体，应用
RNA干涉(RNAi)抑制病毒的复制已经成为可能。GCRV
重要酶类具有高度保守性，可以作为RNAi的靶基因，在复制的早期就发生抑制，把病毒对细胞的损害降低到最小程度。RNAi也是研究敲除基因功能的一种技术。②
尽管研究证实了VP6是主要中和抗原，但是还没有人尝
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第四，大貌第M时相卵母细胞退化过程中，滤泡细胞侵人卵内吞噬卵黄的过程及成熟卵母细胞未排出体外而进人衰亡的演变过程比鱼类更为激烈。
通过对大貌的精、卵巢切片观察发现，即使在成熟的精巢切片中可同时找到精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子，在成熟的卵巢切片中可找到不同时相的卵母细胞，这充分表明大貌的性腺发育是不同步的。这是大鱿对自然生态环境的一种特殊适应，确保种群的延续性。这一现象也为大貌的人工模拟生态繁殖奠定了基础，可以对大貌进行强化培育，使其能多次产卵和排精，并且是在同一时间排精和产卵。
大貌卵母细胞发育过程中，细胞学变化过程是由小逐渐增大的过程，第W,V时相的卵母细胞增大到了极点，成熟卵可达5一9mm，此时核膜消融，核仁分组，核偏位。精母细胞发育是由大到小，细胞质逐渐减少，嗜碱性逐渐增强，内部结构被遮盖，成熟变态后精子头部呈长辣椒状，尾部较长，粗壮有力，比起大多数鱼类精子发生过程有独特之处。
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