第九章 植物组织培养技术及其在育种中的应用植物组织培养技术是现代植物生物技术的基本技术。
一,现代生物技术及其基本概念
（一）生物技术概念生物技术（ Biotechnology)，有时也称生物工程（ Bioengineering）,是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。
（二）生物技术的种类
1,基因工程（ Gene Engineering）
2,细胞工程（ Cell Engineering ）
3,酶工程（ Enzyme Engineering ）
4,发酵工程（ Fermentation Engineering ）
5,蛋白质工程（ Protein Engineering ）
（三）细胞工程细胞工程就是在细胞水平研究开发、
利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。
（四）克隆概念
1,分离基因的技术；
2,扩增基因的技术；
3,将单一细胞扩增成细胞群体的技术；
4,将一个生命体复制成一个与之完全相同的新个体的过程；
5,将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。
6,一个遗传上来源完全相同的生物群体 。
二、植物组织培养的基本步骤
1、植物细胞的全能性（ Cell Totipotency）
一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。
2、植物离体分化的类型
无菌短枝型
丛生芽增殖型
器官发生型
胚状体发生型
原球茎发生型
3、植物组织培养的特点
培育材料经济；
培养条件可人为控制；
生长周期短，繁殖率高；
管理方便，利于自动化控制。
5、植物组织培养的基本操作
无菌操作技术
细胞培养技术
原生质体融合技术
接种用具的灭菌接种前，必须把用具放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为
36-38% 熏蒸 5小时以上再开紫外光灯照射 40-60分钟，
以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室（箱）内，用 5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一般市售的有效成份为 47-53%）或 5% 的石灰炭酸液喷雾消毒，再打开紫外光灯照 20-40分钟，这样消毒后，
再经 30-40分钟便可进行接种。
接种材料的表面灭菌接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝污染的主要关键,先用 70-75%的酒精浸泡 10-15秒钟或用酒精棉球擦两遍,初步杀死表面所带的微生物,
放在 10%的漂白粉液或饱和漂白粉液中浸泡 15-30
分钟杀菌,然后用无菌水冲洗 2-3次 。
消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包好,待取花药接种,注意,穗子或花蕾的操作要在无菌条件下进行 。
5、植物组织培养所需营养与环境条件
（ 1）无机营养大量元素,一般是指浓度大于 0.5mmol/L.氮 (N),磷 (P),
钾 (K),钙 (Ca),镁 (Mg),硫 (S) 。
微量元素,包括铁 (Fe),铜 (Cu),钼 (Mo),锌 (Zn),
钠 (Na),锰 (Mn),钴 (Co),硼 (B),碘 (I)。
（ 2）有机营养维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。
（ 3）生长调节物
生长素,2,4 - D、奈乙酸 (NAA)、吲哚丁酸（ IBA）、
吲哚乙酸 (IAA) 。
细胞分裂素,激动素（ KT）,6-苄基氨基嘌呤（ 6BA）,
玉米素（ ZT）。
赤霉素 （ GA）,脱落酸（ ABA）,乙烯利（ CEDP）。
（ 4）琼脂
（ 5）能源和渗透压
（ 6）其他成分
（ 7）温度
（ 8）光照（光强、光质）
培养基的配制：
培养基母液的配制 ；
配制培养基的步骤；
培养基的分装及灭菌。
6、植物组织培养经历的五个阶段：
（ 1） 预备阶段
外植体的获得；
接种材料的消毒处理；
配制适宜的培养基；
（ 2） 诱导去分化阶段
（ 3）继代增殖阶段
（ 4）生根成芽阶段
（ 5）移栽成活阶段三、植物组织培养技术在育种中的应用
种质资源保护；
优良品种快速繁殖；
诱发和离体筛选突变体；
克服远缘杂交困难；
克服种子发育中的障碍；
单倍体育种的技术环节
基因工程的基础技术
（一）单倍体育种
1,单倍体的概念及其特点只含有一套染色体组的生物体；
被子植物的配子体世代。
矮小性；
不育性；
全显性。
2,单倍体植物在育种上的意义
1,单倍体植物的直接利用；
2,克服杂种分离，缩短育种年限；
3,快速获得异花授粉植物的自交系；
4,单倍体植物的诱变育种；
5,克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；
3,单倍体植株和愈伤组织的培养
（ 1） 单倍体材料的采集单倍体育种的首要问题是如何获得大最的单倍体植株 。 据现有的研究材料,用花药培养产生单倍体植株有两个途径,
第一是在离体培养的花药中,花粉经过类似胚胎发育的过程直接形成单倍体植物,如烟草,
曼陀罗等 。
第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。
（ 2）花药的接种
接种前的准备工作接种和培养花药是在无菌条件下进行的,所用的一切用具必须彻底灭菌 。
花粉发育时期的鉴定适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要的,为此,进行花药培养前,要用显微镜进行花粉发育时期的鉴定 。
经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与花药或花序的外部形态联系起来，找出花粉单核期或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花药进行接种培养。
（ 3） 从愈伤组织分化成苗诱导愈伤组织分化出根,茎,叶的方法是在愈伤组织长到 1-3毫米大小 （ 如小米大 ） 时,即可转移到诱导分化培养基上,促使分化长出植株 。
一般说来,愈伤组织如果先形成芽,随后根自然会发生,如果先有根,以后不一定会出芽 。 因此,
掌握芽分化的条件是十分重要的 。
愈伤组织转移培养工作是在无菌室或接种箱内进行的,转移后愈伤组织培养在 23-28℃ 恒温室内,每日光照 9-11小时,可用日光灯作辅助光,光强度在 2000勒克斯以上 。
在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上的一但转移后的一但转移后仍应向上，否则会影响生长，同时在转移时，就避免沾带过多的培养基。
4,染色体加倍处理方式：
试管内进行；
花粉植株定植后进行；
药剂处理；
植株鉴定。
单倍体育种程序：
材料采集? 接种培养? 诱导愈伤组织
获得再生植株? 染色体加倍? 幼苗培育和品种选择
（二）原生质体培养与体细胞杂交常规杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。 科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，
逐渐将眼光转向细胞融合，试图通过这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。
1,原生质体的概念植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。 此时，细胞外仅由细胞膜包裹,呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。
原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。
2,原生质体的特点
比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，
为实现异源遗传物质转化提供了较好的实验材料。
原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开辟了一条新的育种途径。
3,发展概况
1892,J,A,Klerker 用机械法获得原生质体；
1960,E.C,Cocking 用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁形成再生植株 ;
1960,G,Barski发现,题细胞原生质体能融合在一起形成单核的、并能进行分裂的杂种细胞；
1972,P.S.Carlon首次获得烟草体细胞种间杂种。
80’s 此项技术在我国得到发展。
4,原生质体的制备
（ 1）取材与灭菌
（ 2）酶解 (纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 )
（ 3）分离 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）
（ 4）洗涤
（ 5）鉴定（形态观测、活性鉴定）
原生质体的培养：
细胞壁再生；
细胞分裂；
植株再生。
5,原生质体的融合
化学法诱导融合
1) 按比例混合双亲原生质体 -
2) 滴加 PEG-
3) 滴加高钙高 PH值溶液 -
4) 洗涤原生质体溶液 -
5) 离心获得原生质体溶液 -
6) 筛选杂种细胞 -
7) 再生杂种细胞。
物理法诱导融合
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
－
－
－
－
－
－
基本程序：
原生质体的获得；
电击融合；
筛选杂种细胞；
杂种细胞再生和完整植株的形成。
6,融合细胞的培养鉴定与筛选
杂和细胞的显微镜鉴别；
互补法鉴定杂和细胞；
细胞与分子生物学法；
植株形态的鉴别。
（三）人工种子人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素、及其他成分的人工胶囊。
其具有种子的功能，可直接用于田间播种。
1,人工种子的构成人工种皮胚 状 体人工胚乳
2,人工种子的特点,
（ 1）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；
（ 2）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；
（ 3）成本低，适于田间机械化生产；
（ 4）可根据需要调节胚乳成分。
3,人工种子的制备
（ 1）胚状体的制备及其同步生长；
（ 2）人工胚乳的制备；
（ 3）配制包埋剂及人工包埋。
人工种子包埋示意图
4%海藻酸钠体细胞胚包埋丸
2% CaCl
人工种子水
4、人工种子的贮存与萌发低温、干燥、洁净。
（四）基因工程
（一）基因工程的含义按照人们的愿望,进行严密的设计,通过体外 DNA重组技术 和 DNA
转移技术，有目的地改造生物种性，
使现有物种在短时间内趣于完善,创造出新的生物类型。
致癌农杆菌介导的 Ti质粒载体转化法
2、重组 DNA的直接转化法微粒散射技术 (Particle bombardment)
（二）基因工程的基本步骤
1、目的基因的克隆与鉴定；
2、植物表达载体的构建；
3、植物的遗传转化；
4、转化细胞的筛选；
5、转基因植株的鉴定。
基因基因克隆 基因转化
DNA重组技术植物遗传转化技术植物组织培养技术分子标记技术在育种中的应用
1,DNA遗传标记的特点：
数量极多；
遗传上稳定；
排除了环境差异,
2,DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱；
分析亲缘关系；
定位农艺性状；
分子标记辅助选择；
种质资源及杂种后代的鉴定。
3,分子标记技术
1,RFLP
Restriction fragment length polymorphisms
2,RAPD
3,AFLP
4,SSR
5,SSLP
一,现代生物技术及其基本概念
（一）生物技术概念生物技术（ Biotechnology)，有时也称生物工程（ Bioengineering）,是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。
（二）生物技术的种类
1,基因工程（ Gene Engineering）
2,细胞工程（ Cell Engineering ）
3,酶工程（ Enzyme Engineering ）
4,发酵工程（ Fermentation Engineering ）
5,蛋白质工程（ Protein Engineering ）
（三）细胞工程细胞工程就是在细胞水平研究开发、
利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。
（四）克隆概念
1,分离基因的技术；
2,扩增基因的技术；
3,将单一细胞扩增成细胞群体的技术；
4,将一个生命体复制成一个与之完全相同的新个体的过程；
5,将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。
6,一个遗传上来源完全相同的生物群体 。
二、植物组织培养的基本步骤
1、植物细胞的全能性（ Cell Totipotency）
一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。
2、植物离体分化的类型
无菌短枝型
丛生芽增殖型
器官发生型
胚状体发生型
原球茎发生型
3、植物组织培养的特点
培育材料经济；
培养条件可人为控制；
生长周期短，繁殖率高；
管理方便，利于自动化控制。
5、植物组织培养的基本操作
无菌操作技术
细胞培养技术
原生质体融合技术
接种用具的灭菌接种前，必须把用具放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为
36-38% 熏蒸 5小时以上再开紫外光灯照射 40-60分钟，
以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室（箱）内，用 5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一般市售的有效成份为 47-53%）或 5% 的石灰炭酸液喷雾消毒，再打开紫外光灯照 20-40分钟，这样消毒后，
再经 30-40分钟便可进行接种。
接种材料的表面灭菌接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝污染的主要关键,先用 70-75%的酒精浸泡 10-15秒钟或用酒精棉球擦两遍,初步杀死表面所带的微生物,
放在 10%的漂白粉液或饱和漂白粉液中浸泡 15-30
分钟杀菌,然后用无菌水冲洗 2-3次 。
消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包好,待取花药接种,注意,穗子或花蕾的操作要在无菌条件下进行 。
5、植物组织培养所需营养与环境条件
（ 1）无机营养大量元素,一般是指浓度大于 0.5mmol/L.氮 (N),磷 (P),
钾 (K),钙 (Ca),镁 (Mg),硫 (S) 。
微量元素,包括铁 (Fe),铜 (Cu),钼 (Mo),锌 (Zn),
钠 (Na),锰 (Mn),钴 (Co),硼 (B),碘 (I)。
（ 2）有机营养维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。
（ 3）生长调节物
生长素,2,4 - D、奈乙酸 (NAA)、吲哚丁酸（ IBA）、
吲哚乙酸 (IAA) 。
细胞分裂素,激动素（ KT）,6-苄基氨基嘌呤（ 6BA）,
玉米素（ ZT）。
赤霉素 （ GA）,脱落酸（ ABA）,乙烯利（ CEDP）。
（ 4）琼脂
（ 5）能源和渗透压
（ 6）其他成分
（ 7）温度
（ 8）光照（光强、光质）
培养基的配制：
培养基母液的配制 ；
配制培养基的步骤；
培养基的分装及灭菌。
6、植物组织培养经历的五个阶段：
（ 1） 预备阶段
外植体的获得；
接种材料的消毒处理；
配制适宜的培养基；
（ 2） 诱导去分化阶段
（ 3）继代增殖阶段
（ 4）生根成芽阶段
（ 5）移栽成活阶段三、植物组织培养技术在育种中的应用
种质资源保护；
优良品种快速繁殖；
诱发和离体筛选突变体；
克服远缘杂交困难；
克服种子发育中的障碍；
单倍体育种的技术环节
基因工程的基础技术
（一）单倍体育种
1,单倍体的概念及其特点只含有一套染色体组的生物体；
被子植物的配子体世代。
矮小性；
不育性；
全显性。
2,单倍体植物在育种上的意义
1,单倍体植物的直接利用；
2,克服杂种分离，缩短育种年限；
3,快速获得异花授粉植物的自交系；
4,单倍体植物的诱变育种；
5,克服远缘杂种不孕性与不稳定的现象；
3,单倍体植株和愈伤组织的培养
（ 1） 单倍体材料的采集单倍体育种的首要问题是如何获得大最的单倍体植株 。 据现有的研究材料,用花药培养产生单倍体植株有两个途径,
第一是在离体培养的花药中,花粉经过类似胚胎发育的过程直接形成单倍体植物,如烟草,
曼陀罗等 。
第二是在离体培养的花药中，花粉形成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。
（ 2）花药的接种
接种前的准备工作接种和培养花药是在无菌条件下进行的,所用的一切用具必须彻底灭菌 。
花粉发育时期的鉴定适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要的,为此,进行花药培养前,要用显微镜进行花粉发育时期的鉴定 。
经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与花药或花序的外部形态联系起来，找出花粉单核期或单核期的花蕾或花序的外部形态标志选取花药进行接种培养。
（ 3） 从愈伤组织分化成苗诱导愈伤组织分化出根,茎,叶的方法是在愈伤组织长到 1-3毫米大小 （ 如小米大 ） 时,即可转移到诱导分化培养基上,促使分化长出植株 。
一般说来,愈伤组织如果先形成芽,随后根自然会发生,如果先有根,以后不一定会出芽 。 因此,
掌握芽分化的条件是十分重要的 。
愈伤组织转移培养工作是在无菌室或接种箱内进行的,转移后愈伤组织培养在 23-28℃ 恒温室内,每日光照 9-11小时,可用日光灯作辅助光,光强度在 2000勒克斯以上 。
在转移愈伤组织时，应注意其极性，原来向上的一但转移后的一但转移后仍应向上，否则会影响生长，同时在转移时，就避免沾带过多的培养基。
4,染色体加倍处理方式：
试管内进行；
花粉植株定植后进行；
药剂处理；
植株鉴定。
单倍体育种程序：
材料采集? 接种培养? 诱导愈伤组织
获得再生植株? 染色体加倍? 幼苗培育和品种选择
（二）原生质体培养与体细胞杂交常规杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。 科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，
逐渐将眼光转向细胞融合，试图通过这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。
1,原生质体的概念植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。 此时，细胞外仅由细胞膜包裹,呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。
原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。
2,原生质体的特点
比完整的细胞更容易获得外来遗传物质，
为实现异源遗传物质转化提供了较好的实验材料。
原生质体在一定条件下可以融合成杂种细胞，开辟了一条新的育种途径。
3,发展概况
1892,J,A,Klerker 用机械法获得原生质体；
1960,E.C,Cocking 用酶法首先从番茄根尖中分离出大量有活性的原生质体并通过培养再生出细胞壁形成再生植株 ;
1960,G,Barski发现,题细胞原生质体能融合在一起形成单核的、并能进行分裂的杂种细胞；
1972,P.S.Carlon首次获得烟草体细胞种间杂种。
80’s 此项技术在我国得到发展。
4,原生质体的制备
（ 1）取材与灭菌
（ 2）酶解 (纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 )
（ 3）分离 （沉淀法、漂洗法、滴洗法）
（ 4）洗涤
（ 5）鉴定（形态观测、活性鉴定）
原生质体的培养：
细胞壁再生；
细胞分裂；
植株再生。
5,原生质体的融合
化学法诱导融合
1) 按比例混合双亲原生质体 -
2) 滴加 PEG-
3) 滴加高钙高 PH值溶液 -
4) 洗涤原生质体溶液 -
5) 离心获得原生质体溶液 -
6) 筛选杂种细胞 -
7) 再生杂种细胞。
物理法诱导融合
＋
＋
＋
＋
＋
＋
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－
基本程序：
原生质体的获得；
电击融合；
筛选杂种细胞；
杂种细胞再生和完整植株的形成。
6,融合细胞的培养鉴定与筛选
杂和细胞的显微镜鉴别；
互补法鉴定杂和细胞；
细胞与分子生物学法；
植株形态的鉴别。
（三）人工种子人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素、及其他成分的人工胶囊。
其具有种子的功能，可直接用于田间播种。
1,人工种子的构成人工种皮胚 状 体人工胚乳
2,人工种子的特点,
（ 1）可以不受环境条件的限制，周年进行生产；
（ 2）经人工无性繁殖产生，有利于保存该种系的优良性状；
（ 3）成本低，适于田间机械化生产；
（ 4）可根据需要调节胚乳成分。
3,人工种子的制备
（ 1）胚状体的制备及其同步生长；
（ 2）人工胚乳的制备；
（ 3）配制包埋剂及人工包埋。
人工种子包埋示意图
4%海藻酸钠体细胞胚包埋丸
2% CaCl
人工种子水
4、人工种子的贮存与萌发低温、干燥、洁净。
（四）基因工程
（一）基因工程的含义按照人们的愿望,进行严密的设计,通过体外 DNA重组技术 和 DNA
转移技术，有目的地改造生物种性，
使现有物种在短时间内趣于完善,创造出新的生物类型。
致癌农杆菌介导的 Ti质粒载体转化法
2、重组 DNA的直接转化法微粒散射技术 (Particle bombardment)
（二）基因工程的基本步骤
1、目的基因的克隆与鉴定；
2、植物表达载体的构建；
3、植物的遗传转化；
4、转化细胞的筛选；
5、转基因植株的鉴定。
基因基因克隆 基因转化
DNA重组技术植物遗传转化技术植物组织培养技术分子标记技术在育种中的应用
1,DNA遗传标记的特点：
数量极多；
遗传上稳定；
排除了环境差异,
2,DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱；
分析亲缘关系；
定位农艺性状；
分子标记辅助选择；
种质资源及杂种后代的鉴定。
3,分子标记技术
1,RFLP
Restriction fragment length polymorphisms
2,RAPD
3,AFLP
4,SSR
5,SSLP
