第三章 细胞的破碎和分离
3.1 分类
3.2 细胞破碎理论
3.3 细胞破碎技术
3.4 物理法和化学法的比较
3.5 破碎方法的选择
3.6 细胞破碎的评价
3.7 基因工程表达产物
3.1 分 类物理法 化学法固体剪切法 (珠磨法 ) 酶溶法液体剪切法 化学降解法（酸碱法）
撞击法 表面活性剂法超声法 有机溶剂膨胀法渗透法 萃取法
3.2 细胞破碎理论
1),细胞破碎
A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜剪切力 F,假定细胞直径为 d(in,m),维持球体所需的综合维持力为?(in,N/m),则破碎细胞所需 F(in,Pa)为如利用流体剪切力?(Pa)的作用,则在牛顿流体中则破碎细胞所需的速度梯度为：
3.2 细胞破碎理论意义：细胞直径?,所需压力或剪切力?,破碎难度?。
渗透压法：渗透压差 ()为
c=细胞内外小分子的浓度差,R=气体常数,T = 绝对温度 。
2),产物释放如细胞破碎速度与未破碎细胞浓度成正比,则有
3.2 细胞破碎理论如破碎 cell产物释放的速度与 cell内外的浓度差成正比,则有
cm为产物的最大释放浓度,x0为起始细胞浓度,从上三式得上式为两步释放的速度方程,如细胞破碎或产物释放的其中一步很快,则表现为一级动力学释放过程,此时方程为破碎速度控制过程,释放速度控制方程：
3.3 细胞破碎技术
1),固体剪切法 (珠磨法,c最有效的物理破碎法 )
操作简介
3.3 细胞破碎技术计算破碎遵循一级动力学定律,即对上述方程积分得对于 n次连续搅拌研磨操作,则得蛋白质的物料平衡式
：平均停留时间,V：磨腔的总体积,Q：发酵液的流量 。
3.3 细胞破碎技术影响因素
a)转盘外缘速度 (见下图 )：
适合条件：圆盘外缘速度 < 20m/s,一般在 5-15m/s。
b)珠粒添量和大小添量,(见上图,添量体积一般占总体积的 80-90%)
粒径：一般在 0.2mm(实验室 ),<0.4mm(工业 )。 最终由实验确定
3.3 细胞破碎技术
c) 温度,温度在 5-40?C范围内对破碎影响较小 。 但研磨产热,
功率?,温度? 。 如产物热不稳定,必须控温 。
d) 细胞浓度 x：最佳 x由实验确定 。 一般产热量随细胞浓度的降低而下降,但单位细胞重量的能耗?。
e) 破碎效率：
R：每 kg成品细胞 (如酵母 )释放的蛋白量,Q：物料流量,
P’：珠磨机消耗的功率 。
f) 流量 Q,破碎为一级反应 。 Q?,E?,R?； Q?,E?,R?。
3.3 细胞破碎技术不同流量和搅拌速度下的效率 。 -20,?-50,?-100?
10-6m3/s 流量； 1–8,2–10,3–15,4–20 m/s 外缘速度
3.3 细胞破碎技术
2),液体剪切法 (最常用的方法之一 )
操作
3.3 细胞破碎技术计算服从一级反应定律式中,R为 pro释放量,Rm为 pro最大释放量,
影响因素操作压力 p,p?,R? ;相反,R? 。 温度? 2?C /10MPa 。
破碎次数 N,N?,R?。
温度,比速度 k与温度有关,温度?25?C,k?1.5倍 。
细胞抗破碎系数 a,a酵母 =2.9,a大肠杆菌 = 2.1。
细胞种类,影响 k值 。
细胞浓度,
Z：常数,p0：破碎所需的最低压力,?：细胞浓度的参数 。
3.3 细胞破碎技术阀门底座,刃缘阀座,平边阀座优点
A,在大规模 cell破碎中,高压匀浆机和珠磨机用得最多 ;
B,高压匀浆机最适合于酵母和细菌 ;
C,珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适,
3.3 细胞破碎技术
3) 撞击破碎法操作：细胞喷雾高速冻结
300 m/s氮气流优点：
A,细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间,破碎程度均匀,避免反复和过度破碎；
B,破碎的程度可无级调节,避免细胞内部结构的破坏,特别适合于细胞器的回收；
C,实验室和工业规模均可应用,细胞浓度在 10-20%,实验室规模的间歇处理能力在 50-500 mL/h,工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上 。
3.3 细胞破碎技术
4) 超声破碎法 (15—25kHz)
3.3 细胞破碎技术机理在超声作用下产生的空穴化作用 (cavitation),空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力 。
优点：适合于多种细胞的破碎缺点,A,影响因素多,如振幅,黏度,表面张力,
液体体积和流速,探头材料和形状； B,超声产生超氧离子毒害作用； C,有效能量的利用率低；
D,产热大,需控温； E,不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎 。
3.3 细胞破碎技术
5) 化学破碎法酶溶法,酸碱法,有机溶剂胞溶法,表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键,使细胞壁破碎 。
优点：
A,产品释放的选择性；
B,提取速度和收效高；
C,产品的破坏小；
D,对外界环境,如 pH和温度等要求低；
E,不残留细胞碎片 。
3.4 物理法和化学法的比较物理破碎法缺点：
A,高能,高温,高噪音,高剪切力 (四高 ),易使产品变性失活；
B,非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难；
C,细胞碎片大小不一,难分离 。
化学破碎法缺点：
A,费用高；
B,引起新的污染,尤其是其他化学方法；
C,一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用 。
3.5 破碎方法的选择选择的一般原则
A,提取产物在细胞质内,用机械法破碎
B,提取产物在细胞膜附近,用化学法
C,提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法破碎技术杂交研究应注意的问题
A,杂交技术可产生很大优势 。 如
B,破碎技术对下游分离技术的影响 。 破碎颗粒清除,产物的分离纯化
C,在发酵阶段,考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响
D,菌种的培育,胞内产物? 胞外产物
3.6 细胞破碎的评价破碎率定义
N0：原细胞数,N：破碎后残存的正常细胞 。 N0和 N的可通过直接计数和间接计数法得到 。
直接计数法方法,样本稀释 --- 染色 --- 上样 计数 。
计算,同上 。
优点,方法简单 。
缺点,
A,计数时间长,B,只有活细胞才被计数,误差大,C,细胞聚集时,不利计数,D,染色误差 。
3.6 细胞破碎的评价间接计数法方法,样本离心 --- 取上清液 --- 测特定蛋白质或酶 ---
与理论的最大值比较 。
计算：
Rm：理论最大值,R：实验测得值 。
优点,A,方法客观可靠,尤其对蛋白质和酶,B,有多种选择的指标,胞内位置 (如胞膜,胞壁,近胞膜蛋白等 )，
灵活性大 。
缺点,影响因素多,如温度,pH值,剪切力,溶液的稀释等 。
解决办法,筛选相对稳定和恒定的指标 。
3.7 基因工程表达产物基因工程取得的成果
A,基因工程的一般过程
B,抗虫棉,天然彩色棉
C,高附加值的药品：
白细胞介素 -II,?-(or?- or?-)干扰素,humulin,牛生长素,
anti-thrombin-III,IgG,GM-CSF,TPA等
D,基因牛
3.7 基因工程表达产物存在的问题
A,包含体
B,N-端多一个蛋氨酸残基,表达产物未糖基化 （ 大肠杆菌 ）
C,表达产物过度糖基化,目标产物变成抗原 （ 酵母 ）
D,大肠杆菌的内毒素包含体的解决方法 （ 一般步骤 ）
A,包含体的分离
B,包含体溶解,变性,还原,一般用尿素,盐酸胍,SDS
C,变形蛋白质的复性和重新氧化
D,一般的分离纯化
3.7 基因工程表达产物例：人?-干扰素的后处理工艺发酵液离心 (发酵液冷却至 10?C以下,4000r/min离心 10min)
菌体细胞破碎 (1倍体积细胞 +10倍体积 PBS buffer,冰浴超声破碎 5次,30s/次,4000r/min离心 30min),洗涤 (0.1% Triton X-
100溶液,1000r/min离心 20min,重复三次 )
包含体提取变性 (包含体 +8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer
0.2 mM EDTA,10mM DTT室温搅拌 2h,离心 (15000r/min,
30min)
3.7 基因工程表达产物变性液稀释 (取 1份变形液 +99份上述 buffer(不含 DTT),使尿素浓度小于 0.1M,4?C下搅拌 24h）
复性液浓缩 (用截留 10000D的超滤器浓缩 100倍 ),透析后离心
(15000r/min离心 30min)
浓缩上清液
Sephacryl s-200柱层析分离层析柱 2?100cm,pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱收集主峰,冻干,终产物
(纯度可达 100%,DNA及热源合格 )
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3.2 细胞破碎理论
3.3 细胞破碎技术
3.4 物理法和化学法的比较
3.5 破碎方法的选择
3.6 细胞破碎的评价
3.7 基因工程表达产物
3.1 分 类物理法 化学法固体剪切法 (珠磨法 ) 酶溶法液体剪切法 化学降解法（酸碱法）
撞击法 表面活性剂法超声法 有机溶剂膨胀法渗透法 萃取法
3.2 细胞破碎理论
1),细胞破碎
A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜剪切力 F,假定细胞直径为 d(in,m),维持球体所需的综合维持力为?(in,N/m),则破碎细胞所需 F(in,Pa)为如利用流体剪切力?(Pa)的作用,则在牛顿流体中则破碎细胞所需的速度梯度为：
3.2 细胞破碎理论意义：细胞直径?,所需压力或剪切力?,破碎难度?。
渗透压法：渗透压差 ()为
c=细胞内外小分子的浓度差,R=气体常数,T = 绝对温度 。
2),产物释放如细胞破碎速度与未破碎细胞浓度成正比,则有
3.2 细胞破碎理论如破碎 cell产物释放的速度与 cell内外的浓度差成正比,则有
cm为产物的最大释放浓度,x0为起始细胞浓度,从上三式得上式为两步释放的速度方程,如细胞破碎或产物释放的其中一步很快,则表现为一级动力学释放过程,此时方程为破碎速度控制过程,释放速度控制方程：
3.3 细胞破碎技术
1),固体剪切法 (珠磨法,c最有效的物理破碎法 )
操作简介
3.3 细胞破碎技术计算破碎遵循一级动力学定律,即对上述方程积分得对于 n次连续搅拌研磨操作,则得蛋白质的物料平衡式
：平均停留时间,V：磨腔的总体积,Q：发酵液的流量 。
3.3 细胞破碎技术影响因素
a)转盘外缘速度 (见下图 )：
适合条件：圆盘外缘速度 < 20m/s,一般在 5-15m/s。
b)珠粒添量和大小添量,(见上图,添量体积一般占总体积的 80-90%)
粒径：一般在 0.2mm(实验室 ),<0.4mm(工业 )。 最终由实验确定
3.3 细胞破碎技术
c) 温度,温度在 5-40?C范围内对破碎影响较小 。 但研磨产热,
功率?,温度? 。 如产物热不稳定,必须控温 。
d) 细胞浓度 x：最佳 x由实验确定 。 一般产热量随细胞浓度的降低而下降,但单位细胞重量的能耗?。
e) 破碎效率：
R：每 kg成品细胞 (如酵母 )释放的蛋白量,Q：物料流量,
P’：珠磨机消耗的功率 。
f) 流量 Q,破碎为一级反应 。 Q?,E?,R?； Q?,E?,R?。
3.3 细胞破碎技术不同流量和搅拌速度下的效率 。 -20,?-50,?-100?
10-6m3/s 流量； 1–8,2–10,3–15,4–20 m/s 外缘速度
3.3 细胞破碎技术
2),液体剪切法 (最常用的方法之一 )
操作
3.3 细胞破碎技术计算服从一级反应定律式中,R为 pro释放量,Rm为 pro最大释放量,
影响因素操作压力 p,p?,R? ;相反,R? 。 温度? 2?C /10MPa 。
破碎次数 N,N?,R?。
温度,比速度 k与温度有关,温度?25?C,k?1.5倍 。
细胞抗破碎系数 a,a酵母 =2.9,a大肠杆菌 = 2.1。
细胞种类,影响 k值 。
细胞浓度,
Z：常数,p0：破碎所需的最低压力,?：细胞浓度的参数 。
3.3 细胞破碎技术阀门底座,刃缘阀座,平边阀座优点
A,在大规模 cell破碎中,高压匀浆机和珠磨机用得最多 ;
B,高压匀浆机最适合于酵母和细菌 ;
C,珠磨机可用于酵母和细菌,但对真菌菌丝和藻类更合适,
3.3 细胞破碎技术
3) 撞击破碎法操作：细胞喷雾高速冻结
300 m/s氮气流优点：
A,细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间,破碎程度均匀,避免反复和过度破碎；
B,破碎的程度可无级调节,避免细胞内部结构的破坏,特别适合于细胞器的回收；
C,实验室和工业规模均可应用,细胞浓度在 10-20%,实验室规模的间歇处理能力在 50-500 mL/h,工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上 。
3.3 细胞破碎技术
4) 超声破碎法 (15—25kHz)
3.3 细胞破碎技术机理在超声作用下产生的空穴化作用 (cavitation),空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力 。
优点：适合于多种细胞的破碎缺点,A,影响因素多,如振幅,黏度,表面张力,
液体体积和流速,探头材料和形状； B,超声产生超氧离子毒害作用； C,有效能量的利用率低；
D,产热大,需控温； E,不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎 。
3.3 细胞破碎技术
5) 化学破碎法酶溶法,酸碱法,有机溶剂胞溶法,表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键,使细胞壁破碎 。
优点：
A,产品释放的选择性；
B,提取速度和收效高；
C,产品的破坏小；
D,对外界环境,如 pH和温度等要求低；
E,不残留细胞碎片 。
3.4 物理法和化学法的比较物理破碎法缺点：
A,高能,高温,高噪音,高剪切力 (四高 ),易使产品变性失活；
B,非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难；
C,细胞碎片大小不一,难分离 。
化学破碎法缺点：
A,费用高；
B,引起新的污染,尤其是其他化学方法；
C,一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用 。
3.5 破碎方法的选择选择的一般原则
A,提取产物在细胞质内,用机械法破碎
B,提取产物在细胞膜附近,用化学法
C,提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法破碎技术杂交研究应注意的问题
A,杂交技术可产生很大优势 。 如
B,破碎技术对下游分离技术的影响 。 破碎颗粒清除,产物的分离纯化
C,在发酵阶段,考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响
D,菌种的培育,胞内产物? 胞外产物
3.6 细胞破碎的评价破碎率定义
N0：原细胞数,N：破碎后残存的正常细胞 。 N0和 N的可通过直接计数和间接计数法得到 。
直接计数法方法,样本稀释 --- 染色 --- 上样 计数 。
计算,同上 。
优点,方法简单 。
缺点,
A,计数时间长,B,只有活细胞才被计数,误差大,C,细胞聚集时,不利计数,D,染色误差 。
3.6 细胞破碎的评价间接计数法方法,样本离心 --- 取上清液 --- 测特定蛋白质或酶 ---
与理论的最大值比较 。
计算：
Rm：理论最大值,R：实验测得值 。
优点,A,方法客观可靠,尤其对蛋白质和酶,B,有多种选择的指标,胞内位置 (如胞膜,胞壁,近胞膜蛋白等 )，
灵活性大 。
缺点,影响因素多,如温度,pH值,剪切力,溶液的稀释等 。
解决办法,筛选相对稳定和恒定的指标 。
3.7 基因工程表达产物基因工程取得的成果
A,基因工程的一般过程
B,抗虫棉,天然彩色棉
C,高附加值的药品：
白细胞介素 -II,?-(or?- or?-)干扰素,humulin,牛生长素,
anti-thrombin-III,IgG,GM-CSF,TPA等
D,基因牛
3.7 基因工程表达产物存在的问题
A,包含体
B,N-端多一个蛋氨酸残基,表达产物未糖基化 （ 大肠杆菌 ）
C,表达产物过度糖基化,目标产物变成抗原 （ 酵母 ）
D,大肠杆菌的内毒素包含体的解决方法 （ 一般步骤 ）
A,包含体的分离
B,包含体溶解,变性,还原,一般用尿素,盐酸胍,SDS
C,变形蛋白质的复性和重新氧化
D,一般的分离纯化
3.7 基因工程表达产物例：人?-干扰素的后处理工艺发酵液离心 (发酵液冷却至 10?C以下,4000r/min离心 10min)
菌体细胞破碎 (1倍体积细胞 +10倍体积 PBS buffer,冰浴超声破碎 5次,30s/次,4000r/min离心 30min),洗涤 (0.1% Triton X-
100溶液,1000r/min离心 20min,重复三次 )
包含体提取变性 (包含体 +8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer
0.2 mM EDTA,10mM DTT室温搅拌 2h,离心 (15000r/min,
30min)
3.7 基因工程表达产物变性液稀释 (取 1份变形液 +99份上述 buffer(不含 DTT),使尿素浓度小于 0.1M,4?C下搅拌 24h）
复性液浓缩 (用截留 10000D的超滤器浓缩 100倍 ),透析后离心
(15000r/min离心 30min)
浓缩上清液
Sephacryl s-200柱层析分离层析柱 2?100cm,pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱收集主峰,冻干,终产物
(纯度可达 100%,DNA及热源合格 )
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