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第三章 高效液相色谱法第一节 概 述高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的 效率 和实现了 自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9?107Pa） ;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、
分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、
高效或现代液相色谱法。
二、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相 —— 固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂 。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
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第一节 概 述剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、
液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
三、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、
分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：
塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和
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第一节 概 述气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：
（ 1）应用范围不同气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制,据统计只有大约 20%的有机物能用气相色谱分析 ；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约 占有机物
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第一节 概 述的 70 ~ 80%。
（ 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素 。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
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第一节 概 述等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
（ 3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
（ 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
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第一节 概 述综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、
医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成（图 14-2）。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，
待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
一、高压输液系统
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第二节 高效液相色谱仪高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为 1到 2 L,用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程 。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，
因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
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第二节 高效液相色谱仪色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为 0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，
密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为 恒压泵 和 恒流泵 两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
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第二节 高效液相色谱仪
3,梯度洗脱装置梯度洗脱 就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性,pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类：
一类是 外梯度装置 （又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
另一类是 内梯度装置 （又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混
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第二节 高效液相色谱仪合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质 是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的 k值，使所有谱带都以最佳平均 k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质 k值的变化是通过溶质的极性,pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
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第二节 高效液相色谱仪三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为 2 ~ 6mm,柱长为 10 ~50cm,柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。
四、检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是,灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 。
在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是 溶质性检
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第二节 高效液相色谱仪测器,它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器,它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。
属于此类检测器有示差折光检测器等。
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相一、固定相高效液相色谱固定相 以承受高压能力 来分类，可分为 刚性固体和硬胶 两大类。
刚性固体以 二氧化硅 为基质，可承受 7.0?108~1.0?109Pa
的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由 聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成 。可承受压力上限为 3.5?108Pa。 固定相按 孔隙深度 分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相两类。
1,表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球,在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶,氧化硅,离子交换剂,分子筛,聚酰胺等 。
这类固定相的多孔层厚度小,孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效亦高；颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达到平衡,较适合做常规分析 。 由于多孔层厚度薄,
最大允许量受到限制 。
2,全多孔型固定相由直径为 10nm的硅胶微粒凝聚而成 。 这类固定相由于颗
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相粒很细（ 5~10?m）,孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，
并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：
（ 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。
（ 2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比 溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，
溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。
（ 3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相
（ 4）化学稳定性好
（ 5）低粘度（粘度适中）
若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
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第四节 液 — 固色谱法液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
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第四节 液 — 固色谱法易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；
不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。
一、液固色谱法固定相液固色谱法采用的固体吸附剂按其 性质 可分为 极性和非极性 两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。
极性吸附剂可进一步分为 酸性吸附剂和碱性吸附剂 。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液 — 固色谱法镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。
碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中,最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝 。
在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。
三、液 -固吸附色谱流动相液相色谱的流动相必须符合下列要求：
（ 1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
（ 2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
（ 3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
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第四节 液 — 固色谱法
（ 4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
（ 5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。
在液 -固色谱中，选择流动相的 基本原则 是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相 。
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比 k值范围很广则使用梯度洗脱。
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第五节 液液色谱法液液色谱又称液液分配色谱。
在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。
以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的 差速迁移,从而实现分离。分配系数（ K） 或分配比
（ k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。
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第五节 液液色谱法一、固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：
（ 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为 30 ~
40?m的实心玻璃球和厚度约为 1 ~ 2?m的多孔性外层所组成。
（ 2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径 30
~ 50?m的多孔型颗粒。
（ 3）全多孔型微粒载体，由 nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为 5 ~ 10?m。 由于颗粒小，
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第五节 液液色谱法所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。
由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。 如?, — 氧二丙腈（ ODPN）,聚乙二醇（ PEG）,十八烷（ ODS） 和角鲨烷固定液等。
二、流动相在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小,因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端,例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相
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第五节 液液色谱法通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。
以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为 正相分配色谱,适合于分离极性化合物；
反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为 反相分配色谱,这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。
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第六节 化学键合相色谱将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，
但仍难以完全避免固定液的流失。
70年代初发展了一种新型的固定相 —化学键合固定相。
这种固定相是 通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上,代替机械涂渍的液体固定相。
这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几
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第六节 化合键合色谱法乎所有类型的化合物。
根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱 。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，
也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。
一、化学键合固定相法化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、
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第六节 化合键合色谱法干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：
（ 1）硅酸酯型（ =Si-O-C=） 键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（ =Si-O-C=） 键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。
（ 2）硅氮型（ =Si-N=） 键合相如果用 SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），
再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。
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第六节 化合键合色谱法可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。
（ 3）硅碳型（ =Si-C=） 键合相将硅胶表面氯化后，使 Si-Cl键转化为 Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。
（ 4）硅氧烷型（ =Si-O-Si-C=） 键合相将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。
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第六节 化合键合色谱法二、反相键合相色谱法在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶 -
C18H37（简称 O D S或 C18）硅胶 -苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇 /水，乙腈 /水，水和无机盐的缓冲液等。
目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水 +有机溶剂）
中极性弱的有机溶剂吸附于 非极性烷基配合 基表面，组分分子在流动相中与被 非极性烷基配合 基 所吸附的液相中进行分
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第六节 化合键合色谱法配。
吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的 疏水特性 。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，
这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分
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第六节 化合键合色谱法的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。
在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
三、正相键合色谱法在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团,键合相的名称由键合上去的基团而定 。最常用的有氰基（ -C N）,氨基（ -NH2）、二醇基
（ DIOL） 键合相。 流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性
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第六节 化合键合色谱法溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。
通常用于分离极性化合物。
一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比 K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。
该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。
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第六节 化合键合色谱法四、离子性键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学各种离子交换基团如 -SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl
等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。
化学键合色谱具有下列优点：
（ 1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以
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第六节 化合键合色谱法通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、
极性和离子型化合物。
（ 2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。
（ 3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。
（ 4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
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第七节 离子交换色谱法离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
一、固定相离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式,一是常见的纯离子交换树脂；
第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；第三种为大孔径网络型树脂 。
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第七节 离子交换色谱法典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在 4 ~ 16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。
按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。 阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂 。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为 -SO3-H+,其中 -SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分,H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。
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第七节 离子交换色谱法阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。 阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。
二、流动相离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。
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第八节 排阻色谱法排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的色谱柱的 填料是凝胶,它是一种表面惰性，
含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，
大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，
甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很
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第八节 排阻色谱法小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，
直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。
尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
排阻色谱的固定相一般可分为 软性、半刚性和刚性凝胶 三类。
所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
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第八节 排阻色谱法
（ 1） 软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。
（ 2） 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。
（ 3） 刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。
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第九节 色谱分离方法的选择要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围 。
选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。
一、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在 200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在 200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、
液 -液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于 2000，则
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第九节 色谱分离方法的选择可用空间排阻色谱法。
二、溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；
微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液 -固色谱法。
三、化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），
可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也
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第九节 色谱分离方法的选择都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；
对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。
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色谱法基本要求
1,掌握色谱法的分类，色谱流出曲线及有关术语；
2,掌握色谱法的基本理论，了解柱效的影响因素；
3,掌握分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间关系；
4,了解定性、定量分析方法；
5,掌握气相色谱流程及气相色谱仪的结构；
6,掌握气相色谱固定相的特性；
7,掌握检测器性能指标的描述方法；
8,掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念；
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色谱法基本要求
9,了解液相色谱法的主要类型及固定相、流动相的选择。
10.了解色谱方法选择。
第三章 高效液相色谱法第一节 概 述高效液相色谱法是继气相色谱之后,70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。
高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的 效率 和实现了 自动化 操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9?107Pa） ;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
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第一节 概 述出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、
分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、
高效或现代液相色谱法。
二、液相色谱分离原理及分类和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相 —— 固定相和流动相组成。 液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂 。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
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第一节 概 述剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、
液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
三、液相色谱与气相色谱的比较液相色谱所用基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、
分离度、选择性等与气相色谱一致。液相色谱所用基本理论：
塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。但由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和
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第一节 概 述气体的性质不相同；此外，液相色谱所用的仪器设备和操作条件也与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：
（ 1）应用范围不同气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制,据统计只有大约 20%的有机物能用气相色谱分析 ；而液相色谱则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约 占有机物
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第一节 概 述的 70 ~ 80%。
（ 2）液相色谱能完成难度较高的分离工作因为：
①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素 。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。
②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱。
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第一节 概 述等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择。
（ 3）由于液体的扩散性比气体的小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。
（ 4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应用中，这两种色谱技术是互相补充的。
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第一节 概 述综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、
医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。
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第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成（图 14-2）。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，
待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
一、高压输液系统
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第二节 高效液相色谱仪高压输液系统由 溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表 等组成。
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为 1到 2 L,用来贮存足够数量、符合要求的流动相。
2.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程 。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，
因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过
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第二节 高效液相色谱仪色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为 0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，
密封性好。
高压输液泵，按其性质可分为 恒压泵 和 恒流泵 两大类。
恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。
恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
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第二节 高效液相色谱仪
3,梯度洗脱装置梯度洗脱 就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性,pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类：
一类是 外梯度装置 （又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。
另一类是 内梯度装置 （又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混
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第二节 高效液相色谱仪合，再输至柱系统。
梯度洗脱的实质 是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的 k值，使所有谱带都以最佳平均 k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质 k值的变化是通过溶质的极性,pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。
二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。
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第二节 高效液相色谱仪三、分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为 2 ~ 6mm,柱长为 10 ~50cm,柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。
四、检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是,灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 。
在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是 溶质性检
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第二节 高效液相色谱仪测器,它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器,它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。
属于此类检测器有示差折光检测器等。
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相一、固定相高效液相色谱固定相 以承受高压能力 来分类，可分为 刚性固体和硬胶 两大类。
刚性固体以 二氧化硅 为基质，可承受 7.0?108~1.0?109Pa
的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。
硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由 聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成 。可承受压力上限为 3.5?108Pa。 固定相按 孔隙深度 分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相两类。
1,表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球,在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料,如硅胶,氧化硅,离子交换剂,分子筛,聚酰胺等 。
这类固定相的多孔层厚度小,孔浅,相对死体积小,出峰迅速,柱效亦高；颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达到平衡,较适合做常规分析 。 由于多孔层厚度薄,
最大允许量受到限制 。
2,全多孔型固定相由直径为 10nm的硅胶微粒凝聚而成 。 这类固定相由于颗
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相粒很细（ 5~10?m）,孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
二、流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，
并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：
（ 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。
（ 2）溶剂与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比 溶剂的紫外截止波长 要长。所谓溶剂
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，
溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。
对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。
（ 3）高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。
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第三节 高效液相色谱的固定相和流动相
（ 4）化学稳定性好
（ 5）低粘度（粘度适中）
若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。
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第四节 液 — 固色谱法液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的 吸附中心 。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，故也称为液固吸附色谱。
吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，
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第四节 液 — 固色谱法易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；
不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。
一、液固色谱法固定相液固色谱法采用的固体吸附剂按其 性质 可分为 极性和非极性 两种类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。
极性吸附剂可进一步分为 酸性吸附剂和碱性吸附剂 。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液 — 固色谱法镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。
碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中,最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝 。
在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。
三、液 -固吸附色谱流动相液相色谱的流动相必须符合下列要求：
（ 1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
（ 2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
（ 3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
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第四节 液 — 固色谱法
（ 4）应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
（ 5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。
在液 -固色谱中，选择流动相的 基本原则 是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相 。
为了获得合适的溶剂极性，常采用两种、三种或更多种不同极性的溶剂混合起来使用，如果样品组分的分配比 k值范围很广则使用梯度洗脱。
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第五节 液液色谱法液液色谱又称液液分配色谱。
在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。
以气液分配色谱法一样，这种分配平衡的总结果导致各组分的 差速迁移,从而实现分离。分配系数（ K） 或分配比
（ k）小的组分，保留值小，先流出柱。然而与气相色谱法不同的是，流动相的种类对分配系数有较大的影响。
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第五节 液液色谱法一、固定相液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：
（ 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为 30 ~
40?m的实心玻璃球和厚度约为 1 ~ 2?m的多孔性外层所组成。
（ 2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径 30
~ 50?m的多孔型颗粒。
（ 3）全多孔型微粒载体，由 nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠。这种载体粒度为 5 ~ 10?m。 由于颗粒小，
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第五节 液液色谱法所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体。
由于液相色谱中，流动相参与选择作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的差异。因此，液相色谱中，只需几种不同极性的固定液即可。 如?, — 氧二丙腈（ ODPN）,聚乙二醇（ PEG）,十八烷（ ODS） 和角鲨烷固定液等。
二、流动相在液液色谱中，除一般要求外，还要求流动相对固定相的溶解度尽可能小,因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端,例如当选择固定液是极性物质时，所选用的流动相
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第五节 液液色谱法通常是极性很小的溶剂或非极性溶剂。
以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为 正相分配色谱,适合于分离极性化合物；
反之，如选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱称为 反相分配色谱,这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。
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第六节 化学键合相色谱将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，
但仍难以完全避免固定液的流失。
70年代初发展了一种新型的固定相 —化学键合固定相。
这种固定相是 通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上,代替机械涂渍的液体固定相。
这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几
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第六节 化合键合色谱法乎所有类型的化合物。
根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱 。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，
也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。
一、化学键合固定相法化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、
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第六节 化合键合色谱法干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：
（ 1）硅酸酯型（ =Si-O-C=） 键合相将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（ =Si-O-C=） 键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。
（ 2）硅氮型（ =Si-N=） 键合相如果用 SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），
再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。
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第六节 化合键合色谱法可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。
（ 3）硅碳型（ =Si-C=） 键合相将硅胶表面氯化后，使 Si-Cl键转化为 Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。
（ 4）硅氧烷型（ =Si-O-Si-C=） 键合相将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。
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第六节 化合键合色谱法二、反相键合相色谱法在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶 -
C18H37（简称 O D S或 C18）硅胶 -苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇 /水，乙腈 /水，水和无机盐的缓冲液等。
目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。
分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水 +有机溶剂）
中极性弱的有机溶剂吸附于 非极性烷基配合 基表面，组分分子在流动相中与被 非极性烷基配合 基 所吸附的液相中进行分
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第六节 化合键合色谱法配。
吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的 疏水特性 。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，
这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。
一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分
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第六节 化合键合色谱法的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。
在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。
三、正相键合色谱法在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团,键合相的名称由键合上去的基团而定 。最常用的有氰基（ -C N）,氨基（ -NH2）、二醇基
（ DIOL） 键合相。 流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性
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第六节 化合键合色谱法溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。
通常用于分离极性化合物。
一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比 K值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。
该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。
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第六节 化合键合色谱法四、离子性键合相色谱法当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学各种离子交换基团如 -SO3H,-CH2NH2,-COOH,-CH2N(CH3)Cl
等时，形成了所谓的离子性键合色谱。其分离原理与离子交换色谱一样，只是填料是一种新型的离子交换剂而已。
化学键合色谱具有下列优点：
（ 1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以
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第六节 化合键合色谱法通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、
极性和离子型化合物。
（ 2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。
（ 3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。
（ 4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
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第七节 离子交换色谱法离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。
一、固定相离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式,一是常见的纯离子交换树脂；
第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；第三种为大孔径网络型树脂 。
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第七节 离子交换色谱法典型的离子交换树脂是由苯乙烯和二乙烯苯交联共聚而成。其中，二乙烯苯起到交联和加牢整个结构的作用，其含量决定了树脂交联度的大小。交联度一般控制在 4 ~ 16%范围内，高度交联的树脂较硬而且脆，但选择性较好。在基体网状结构上引入各种不同酸碱基团作为可交换的离子基团。
按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。
阳离子交换树脂上具有与阳离子交换的基团。 阳离子交换树脂又可分为强酸性和弱酸性树脂 。强酸性阳离子交换树脂所带的基团为 -SO3-H+,其中 -SO3-和有机聚合物牢固结合形成固定部分,H+是可流动的能为其它阳离子所交换的离子。
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第七节 离子交换色谱法阴离子交换树脂具有与样品中阴离子交换的基团。 阴离子交换树脂也可分为强碱性和弱碱性树脂。
二、流动相离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。
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第八节 排阻色谱法排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。
排阻色谱的色谱柱的 填料是凝胶,它是一种表面惰性，
含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出入。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，
大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗入，
甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗脱出来，它的洗脱体积很
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第八节 排阻色谱法小，小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积较大，
直到所有孔内的最小分子到达柱出口，完成按分子大小而分离的洗脱过程。
尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。
排阻色谱的固定相一般可分为 软性、半刚性和刚性凝胶 三类。
所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富有弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。
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第八节 排阻色谱法
（ 1） 软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。
（ 2） 半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。
（ 3） 刚性凝胶 如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。
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第九节 色谱分离方法的选择要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围 。
选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。
一、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在 200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在 200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、
液 -液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于 2000，则
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第九节 色谱分离方法的选择可用空间排阻色谱法。
二、溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；
微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液 -固色谱法。
三、化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），
可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也
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第九节 色谱分离方法的选择都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；
对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。
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色谱法基本要求
1,掌握色谱法的分类，色谱流出曲线及有关术语；
2,掌握色谱法的基本理论，了解柱效的影响因素；
3,掌握分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间之间关系；
4,了解定性、定量分析方法；
5,掌握气相色谱流程及气相色谱仪的结构；
6,掌握气相色谱固定相的特性；
7,掌握检测器性能指标的描述方法；
8,掌握液相色谱仪的基本结构及基本概念；
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色谱法基本要求
9,了解液相色谱法的主要类型及固定相、流动相的选择。
10.了解色谱方法选择。
