高效液相色谱方法及应用
(High Performance Liquid
Chromatography,HPLC)
1、高效液相色谱法的原理
2、高效液相色谱仪
3、固定相和流动相
4、色谱分离条件选择及定性定量分析
5、高效液相色谱法的特点及应用
1、高效液相色谱法的原理
1.1 高效液相色谱法的特点
1.1.1 与经典液相色谱法比较：
高速、高效、高灵敏度、高自动化 。
1.1.2 与气相色谱法比较应用范围广,更利于选择最佳分离条件且可在常温下操作 。
1.1.3 高效液相色谱法的特点
（ 1） 分离效能高 （ 2） 选择性高
（ 3）检测灵敏度高 （ 4）分析速度快适合于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
1.2 高效液相色谱法的分类按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类
1.2.1 吸附色谱 （ Adsorption
Chromatography）
1.2.2 分配色谱 （ Partition Chromatography）
1.2.3 离子色谱 （ Ion Chromatography）
1.2.4 体积排阻色谱 （ Size Exclusion
Chromatography）
1.2.5 亲和色谱 （ Affinity Chromatography）
分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱分配色谱（键和相）
离子色谱
（离子交换）
体积排阻色谱（凝胶）
亲和色谱固定相 全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相 不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同 pH
值的缓冲溶液有机溶剂或一定 pH值的缓冲溶液不同 pH值的缓冲溶液，
可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解
1.3 基本原理
1.3.1 色谱过程,塔板理论、速率理论、定量定性方法。
1.3.2 色谱峰展宽的因素
(1)柱内展宽 1.涡流扩散 A。 2.纵向扩散
B/u。 3传质阻力 Cu。
(2)柱外展宽：降低柱效的重要原因
2,高效液相色谱仪简介
高压输液系统,储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器及梯度洗脱装置。
进样系统,进样器，进样阀。
分离系统,色谱柱，恒温箱。
检测系统记录系统,检测器、记录装置
2.1 高压输液系统
2.1.1 贮液罐
2.1.2 流动相脱气
（ 1）吹氦脱气法 （ 2）加热回流法
（ 3）抽真空脱气法 （ 4）超声波脱气法
（ 5）在线真空脱气法
2.1.3 高压输液泵
（ 1） 恒流泵：输出恒定体积流量的流动相
（ 2）恒压泵：又称气动放大泵，输出恒定压力的泵。
2.1.4 输液系统的辅助设备
（ 1） 管道过滤器 （ 2） 脉动阻尼器
2.1.5 梯度洗脱装置
（ 1） 低压梯度（外梯度） （ 2）高压梯度（内梯度）
（ 3）影响梯度洗脱的因素
2.2 进样系统
2.2.1 停流进样装置
2.2.2 六通阀进样装置
2.2.3 自动进样器
2.3.1色谱柱是液相色谱的心脏部件，包括柱管与固定相。
柱管材料,玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。
色谱柱长,5～ 30cm，内径为 4～ 5mm，凝胶色谱柱内径
3～ 12mm，制备往内径较大，可达 25mm 以上。
分离前备有个 前置柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，
保证分离的性能不受影响 。
柱子装填 得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜ 20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
2.3 分离系统
2.3.2 色谱柱：反相键合相色谱柱最常用的就是 ODS柱，也就是 C18柱。
常规柱、快速柱、微量色谱柱、制备柱和浓缩住。
2.3.3 柱温箱的温度控制要求比较精确，因为流体的粘度受温度的影响较大。
2.4 检测器
2.4.1 检测器的性能指标
（ 1）噪声
（ 2）基线漂移
（ 3）灵敏度
（ 4）线性范围
（ 5）检测器的池体积
2.4.2 检测器的种类
2.4.2.1 紫外吸收检测器
（ ultraviolet－ visible detector,UVD ）
2.4.2.2 荧光检测器
（ fluorescence detector,FD ）
2.4.2.3示差折光检测器
（ differential refractive Index detector,RID）
2.4.2.4电化学检测器
（ electron-chemical detector,ED）
2.4.2.5化学发光检测器
（ chemiluminescence detector,CD）
2.4.2.5 蒸发激光散射检测器（ ELSD）
（通用灵敏的质量检测器）。
(High Performance Liquid
Chromatography,HPLC)
1、高效液相色谱法的原理
2、高效液相色谱仪
3、固定相和流动相
4、色谱分离条件选择及定性定量分析
5、高效液相色谱法的特点及应用
1、高效液相色谱法的原理
1.1 高效液相色谱法的特点
1.1.1 与经典液相色谱法比较：
高速、高效、高灵敏度、高自动化 。
1.1.2 与气相色谱法比较应用范围广,更利于选择最佳分离条件且可在常温下操作 。
1.1.3 高效液相色谱法的特点
（ 1） 分离效能高 （ 2） 选择性高
（ 3）检测灵敏度高 （ 4）分析速度快适合于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
1.2 高效液相色谱法的分类按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类
1.2.1 吸附色谱 （ Adsorption
Chromatography）
1.2.2 分配色谱 （ Partition Chromatography）
1.2.3 离子色谱 （ Ion Chromatography）
1.2.4 体积排阻色谱 （ Size Exclusion
Chromatography）
1.2.5 亲和色谱 （ Affinity Chromatography）
分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较吸附色谱分配色谱（键和相）
离子色谱
（离子交换）
体积排阻色谱（凝胶）
亲和色谱固定相 全多孔固体吸附剂固定液载带在固相基体上高效微粒离子交换剂具有不同孔径的多孔性凝胶多种不同性能的配位体键联在固相基体上流动相 不同极性有机溶剂不同极性有机溶剂和水不同 pH
值的缓冲溶液有机溶剂或一定 pH值的缓冲溶液不同 pH值的缓冲溶液，
可加入改性剂分离原理吸附与解吸溶解与挥发可逆性的离子交换多孔凝胶的渗透或过滤具有锁匙结构络合物的可逆性离解
1.3 基本原理
1.3.1 色谱过程,塔板理论、速率理论、定量定性方法。
1.3.2 色谱峰展宽的因素
(1)柱内展宽 1.涡流扩散 A。 2.纵向扩散
B/u。 3传质阻力 Cu。
(2)柱外展宽：降低柱效的重要原因
2,高效液相色谱仪简介
高压输液系统,储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器及梯度洗脱装置。
进样系统,进样器，进样阀。
分离系统,色谱柱，恒温箱。
检测系统记录系统,检测器、记录装置
2.1 高压输液系统
2.1.1 贮液罐
2.1.2 流动相脱气
（ 1）吹氦脱气法 （ 2）加热回流法
（ 3）抽真空脱气法 （ 4）超声波脱气法
（ 5）在线真空脱气法
2.1.3 高压输液泵
（ 1） 恒流泵：输出恒定体积流量的流动相
（ 2）恒压泵：又称气动放大泵，输出恒定压力的泵。
2.1.4 输液系统的辅助设备
（ 1） 管道过滤器 （ 2） 脉动阻尼器
2.1.5 梯度洗脱装置
（ 1） 低压梯度（外梯度） （ 2）高压梯度（内梯度）
（ 3）影响梯度洗脱的因素
2.2 进样系统
2.2.1 停流进样装置
2.2.2 六通阀进样装置
2.2.3 自动进样器
2.3.1色谱柱是液相色谱的心脏部件，包括柱管与固定相。
柱管材料,玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。
色谱柱长,5～ 30cm，内径为 4～ 5mm，凝胶色谱柱内径
3～ 12mm，制备往内径较大，可达 25mm 以上。
分离前备有个 前置柱,前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，
保证分离的性能不受影响 。
柱子装填 得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜ 20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。
2.3 分离系统
2.3.2 色谱柱：反相键合相色谱柱最常用的就是 ODS柱，也就是 C18柱。
常规柱、快速柱、微量色谱柱、制备柱和浓缩住。
2.3.3 柱温箱的温度控制要求比较精确，因为流体的粘度受温度的影响较大。
2.4 检测器
2.4.1 检测器的性能指标
（ 1）噪声
（ 2）基线漂移
（ 3）灵敏度
（ 4）线性范围
（ 5）检测器的池体积
2.4.2 检测器的种类
2.4.2.1 紫外吸收检测器
（ ultraviolet－ visible detector,UVD ）
2.4.2.2 荧光检测器
（ fluorescence detector,FD ）
2.4.2.3示差折光检测器
（ differential refractive Index detector,RID）
2.4.2.4电化学检测器
（ electron-chemical detector,ED）
2.4.2.5化学发光检测器
（ chemiluminescence detector,CD）
2.4.2.5 蒸发激光散射检测器（ ELSD）
（通用灵敏的质量检测器）。
