第一章 绪 论(Introduction)
1.分析化学的发展和仪器分析的产生
分析化学的地位
无机化学 生物化学
分析化学
物理化学 有机化学
化学的其它领域
2.仪器分析的历史发展概况
2.1分析化学的发展和仪器分析的产生
（1）什么是仪器分析？
一般的说，仪器分析是指采用比较复杂或特殊的仪器设备，通过测量物质的某些物理或物理化学性质的参数及其变化来获取物质的化学组成、成分含量及化学结构等信息的一类方法,这些方法一般都有独立的方法原理及理论基础．
（2）定 义仪器分析是以物质的物理和物理化学性质为基础建立起来的一种分析方法，测定时，常常需要使用比较复杂的仪器．它是分析化学的发展方向．仪器分析是化学类专业必修的基础课程之一,
分析化学（分析学）是一门自然科学．它致力于建立和应用各种方法、仪器和战略以获得有关物质在一定时间或空间内的组成、结构和能态的信息,
这是一个高度概括的定义．它包括了任务、手段、目标和适用面；但不涉及分析化学的具体内涵,
物质的很多物理和物理化学性质与它们的化学组成、含量和结构之间也有着内在的联系，测定这些物理和物理化学性质，也可获得所需要的定性和定量分析信息．这类方法称之谓物理和物理化学分析法．
1.与化学分析的关系：相互和配合补充，化学分析以常量分析为主，仪器分析以微量分析为主．
2.不是一门独立的学科：需要其它学科的发展和支持
3.化学及生物研究的重要工具：许多学科的发展离不开仪器分析仪器分析的产生是科学技术发展的需要、必然，也是科学技术发展的结晶,
不少学科的发展对分析化学提出了更高的要求，如微量或痕量分析，无损分析，形态分析等．
仪器分析的历史发展概况仪器分析的三次巨大变革
第一次巨大变革分析天平的发明
溶液理论的建立（四大平衡的建立）
这是第一次革命
第二次巨大变革第二次世界大战前后的科学技术
物理学和电子技术的发展为仪器分析奠定了基础
第三次变革计算机的发明：尤其微型计算的发展，给仪器分析带来 全新的革命．
仪器分析的特点
1,灵敏度高，检出限低,
2,选择性好,
3,操作简便,分析速度快,易于实现自动化,
4,相对误差一般较大,
5,价格一般来说比教昂贵．
3.仪器分析的分类
1.光分析法：谱法和非光谱法
2,电分析化学方法：以电讯号作为计量关系的一类方法,主要有五大类,电导、电位、电解、库仑及伏安．
3,色谱法：是一类分离分析方法,主要有气相色谱和液相色谱,
4,其它仪器分析方法
① 质谱,② 热分析，③ 放射分析
4.前景展望科学仪器的创新是知识创新和技术创新的重要内容．发展科学仪器应当视为国家战略．分析仪器是科学仪器的重要组成部分．分析仪器工业是高技术信息产业．分析仪器的发展是现代科学、经济和社会发展的重要基础和推动力之一．分析仪器的主要应用领域正向生物医学领域转移．
分析仪器是人们感觉器官的延伸
分析仪器的微型化和智能化
分析仪器的大众化、个性化和日用品化，贵重仪器的网络化
建立和发展虚拟仪器概念,分析仪器的主要应用领域正向着生物医学领域转移
前景展望简单地说,
1,生命科学研究对分析化学提出高的要求．活体分析，单细胞分析，基因分析，及药物的检测等,
2.环境监测及控制,自动化 智能化 微型化基础课的要求
现代仪器分析法的种类十分繁杂，作为仪器分析基础课，只能选择其中最重要和最常用的方法作为本课程内容,
对待教学实验和基础课的关系．
通过本课程的学习，要求学生掌握仪器分析方法的原理和仪器的简单结构；要求学生初步具有根据分析的目的，结合学到的各种仪器分析方法的特点，应用范围，选择适宜的分析方法的能力,
课后作业：
名词解释仪器分析
分析化学简答题仪器分析的特点有那些？他与分析化学的关系？
仪器分析可以分为那些类别？
第二章 紫外-可见吸收光谱法序言
紫外-可见分光光度法具有如下特点：
A 灵敏度高：可进行微量分析10-5-10-6mol/L。
B 准确度高：误差为2-5%，符合微量分析的要求。
C 操作简便、分析速度快：几分钟
D 应用广泛：定性、定量、纯度分析等紫外-可见吸收光谱法（ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis）是研究波长范围在200-800nm光区内的分子吸收光谱的一种常用方法。该方法灵敏度和选择性较好，所使用的一起设备简单，广泛应用于无机和有机物质的定性和定量测定。
光学分析法概述光学分析法是根据物质发射、吸收电磁辐射以及物质与电磁辐射的相互作用来进行分析的一类仪器分析方法。光学分析方法有光谱方法和非光谱分析方法两类。
（其中紫外区：10-380nm）
光谱方法：
基于辐射的波长及强度测量的方法。通常需要测定式样的光谱，式样的光谱是由于物质原子或分子的特定能级的跃迁产生的。其作用可以进行定性分析（根据其特征光谱的波长）和定量分析（光谱的强度也与物质的含量有关）。
光谱方法可分为分子光谱和原子光谱。紫外-可见分光光度计、荧光光谱分析、及红外光谱分析属于分子光谱；而原子发射光谱分析和原子吸收光谱分析则属于原子光谱。
根据辐射能量的传递方式，光谱方法又可以分为发射光谱、吸收光谱、荧光光谱及拉曼光谱等。
非光谱方法：
主要利用电磁辐射与物质的相互作用所引起的电磁辐射在方向上的改变或物理性质的变化来进行分析。它不涉及光谱的测定（因为它不涉及能量的跃迁）。主要利用辐射的折射、反射、色散、散射、干涉及偏振等现象，如比浊法、偏振法、旋光色散法及X射线衍射等。
紫外-可见吸收光谱的产生及基本原理
2.1 物质对光的选择性吸收
分子的紫外-可见吸收光谱是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析方法。当某种物质受到光的照射时，物质分子就会与光发生碰撞，其结果是光子的能量传递到了分子上。这样，处于稳定状态的基态分子就会跃迁到不稳定的高能态，即激发态：
M（基态）+hv------M*（激发态）
这就是对光的吸收作用。
由于物质的能量是不连续的，即能量上一量子化的。只有当入射光的能量（hv）与物质分子的激发态和基态的能量差相等时才能发生吸收
△E=E2-E1= hv=hc/λ
而不同的物质分子因其结构的不同而具有不同的量子化能级，即△E不同，故对光的吸收也不同。
名词：
吸收光谱曲线（光吸收曲线）PPP7：它反映了物质对不同波长光的吸收情况。PPP7图2-1表示不同浓度的高锰酸钾溶液的吸收光谱。
紫外-可见吸收光谱定性分析的依据：光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长，用λmax表示，同一种吸光物质，浓度不同时，吸收曲线的形状不同，λmax不变，只是相应的吸光度大小不同，这是定性分析的依据。
紫外-可见吸收光谱定量分析的依据：朗伯-比尔定律。
2.2 朗伯-比尔定律。
紫外-可见分光光度计的定量分析的依据是朗伯-比尔定律。
如图2-2（P8）
名词：透光率（透光度） T=I/I0
其中T越大表示对光的吸收越小，反之越大。
透光率倒数的对数称为吸光度：A=
1760年朗伯指出，如果溶液的浓度一定，则光的吸收强度A与溶液液层的厚度b成正比：
A=
1952年比尔又指出：当单色光通过液层厚度一定的含吸光物质的溶液后，溶液的吸光度A与溶液的浓度c成正比，既
A=
两个公式合并起来就是朗伯-比尔定律
A=
此公式的物理意义是，当一束平行的单色光通过均匀的含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质浓度及吸收层厚度成正比。若溶液浓度以mol/L表示，则此时 吸光系数称为摩尔吸光系数ε则
A=
其中ε为只能通过计算来求得，它是各种吸光物质对一定波长单色光吸收的特征系数。ε越大，表示该物质对此波长的光吸收能力越大。
在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和。
2.3 偏离比尔定律的原因主要原因：目前仪器还不能提供真正的单色光以及吸光物质性质的改变。
非单色光引起的偏离由于溶液本身的化学和物理因素引起的偏离分子结构与紫外-可见吸收光谱
3.1 分子的电子光谱分子内部的运动可分为价电子运动、分子内原子在平衡位置附近的震动和分子绕其中心的转动。因此分子具有电子能级、转动能级和震动能级。分子对电磁辐射的吸收是分子总能量变化的和。
E=Eel+Evib+Erot 电子electron vibrancy n.振动,振动性,活跃,响亮 滚动roll
3.2 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带紫外-可见吸收光谱是由分子中价电子的跃迁而产生的。
3.3 影响吸收带的因素分子结构、溶剂的极性和温度等各种因素都会对吸收谱带产生影响。
电子共轭体系的影响空间阻碍的影响取代基的影响溶剂的影响课后作业：
名词解释：
朗伯-比尔定律
透光率（透光度）
简答：
可见吸收光谱的产生及基本原理
（2）朗伯-比尔定律
4,紫外-可见分光光度计基本结构结构：紫外-可见分光光度计一般由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录（计算机）等部分组成。
单光束分光光度计
单波长分类（按波长）,双光束分光光度计
双波长分光光度计单波长单光束分光光度计（P18图2-10）
光源 单色器 吸收池 检测器 读出装置
（样品槽）
721、722及751型分光光度计的工作原理如图所示：（首先仪器预热30MIN）光源发出的混合光经过单色器分光，得到平行单色光。（将装有参比或空白溶液的比色皿加入吸收池，调节A为零或T为100%，然后将装有待测液的比色皿加入吸收池中测定。）平行单色光通过吸收池后，出射光照射在检测器上转换成电信号，并有读出装置显示吸光度值。
（1）光源：作用是提供激发能，使待测分子吸收产生跃迁。要求光源能发出足够强的连续光谱，并具有良好的稳定性，且辐射能量随波长无明显变化。
紫外-可见分光光度计采用的光源有热辐射光源和气体放电光源。利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源，如钨灯（340-2500nm）、卤钨灯。气体放热光源是在低压直流电条件下，氢气或氘（dao）气放电所产生的连续辐射。一般为氢灯或氘等，他们在近自外区测定时使用。他们可以在160-360nm范围内产生连续辐射。
（2）单色器：单色器是从光源发出的复合光中分离出所需要的单色光的光学装置。P18图2-11
（3）吸收池：也成为比色皿，用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃两种。石英比色皿适合与用于可见-紫外区的测量。玻璃池只用于可见区。为了减少反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。
（4）检测器：检测光信号，测量单色光通过溶液后光强度的变化，并将光信号转变成电信号。常用光电池或光电管作为检测器。
3.2 单波长双光束分光光度计单光束仪器中，分光后的单色光直接通过比色皿，分别通过样品和参比溶液（利用拉杆）。适合与特定波长的吸收。在双光束仪器中，从光源发出的光经过反射镜后分成相等的两束光，一束通过参比池，一束通过待测溶液；最后测定的是两者的光信号强度差。
优点是克服了单光束仪器由于光源不稳定引起的误差，并且可以方便的对全波段进行扫描。
3.3 双波长分光光度计（略）
也可以作为单波长双光束分光光度计。
优点是可以降低杂散光，光谱精度高。
5,定性分析
5.1 原理：紫外-可见光谱鉴定有机化合物，通常是在相同的测定条件下，比较未知物与已知化合物的紫外-可见吸收光谱图，若两者的谱图相同，则可知待测化合物与已知化合物具有相同的生色团。这也说明有时候两种化合物的紫外-可见吸收光谱图相同，但两者的结构不一定相同。有时候不同的分子结构产生相同的吸收光谱（但此时他们的吸光系数是不同的，所以在比较他们的λmax的同时也要比较它们的εmax。如果他们的λmax和εmax都相同则是同一种物质）。
物质（有机物质）的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团和助色团的特性，而表示她分子本身的特性。所以，仅仅靠紫外-可见光谱不能完全决定物质的分子结构，必须和其他的方法配合使用才能得到可靠的结论。
5.2 应用利用紫外-可见吸收光谱图可以对未知样品进行鉴定利用紫外-可见吸收光谱图可以对有机化合物的分子结构进行推断。
利用紫外-可见吸收光谱图可以对有机化合物的同分异构体进行推断。
利用紫外-可见吸收光谱图可以用于纯度的检查。
如果一化合物在紫外-可见区有较强的吸收带，有时可用摩尔吸光系数来检查其纯度。
6,定量分析
6.1 定量测定的条件测定波长的选择吸光度读数范围的选择狭缝宽度的选择有色化合物的形成
A 溶液的PH值
B 显色剂用量
C 反应时间
D 反应温度
E 掩蔽
F 加试剂的次序
6.2 单组分定量分析（工作曲线法/标准曲线法）
A 标准曲线的测定
B 样品测定
6.3 多组分混合物中各组分的同时测定
原理：根据在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有相加性。
7,几种常见的分光光度计
（1） 721可见分光光度计 测定的波长范围360-800nm，为一种 可见分光光度计。
（2） 722可见分光光度计 测定的波长范围330-800nm，为一种 可见分光光度计。
751紫外分光光度计
单光束紫外可见分光光度计，测定的波长范围200-1000nm。在320-1000nm内，用钨丝等做光源，在200-320nm内用氘灯做光源。
作业：
P28第3题简述单波长单光束分光光度计的工作原理（图）。
简述紫外-可见分光光度计在物质定性分析上的应用。
简述紫外-可见分光光度计在物质定量分析上的应用。
第三章 原子发射光谱原子发射光谱分析的定义：
习惯上简称光谱分析（AES，atomic emission spectrometry）；是通过记录和测量元素的激发态原子所发出的特征辐射的波长和强度对其进行定性、半定量和定量分析的方法。
光谱分析的基本原理：
（1）定性分析的基本原理：不同元素的原子结构不同，因而原子各能级之间的能量差△E也不同，各能级间的跃迁所对应的辐射也不同。所以可根据所检测到的辐射的频率或波长对样品进行定性分析。
（2）定量分析的基本原理：当元素含量不同时，同一波长所对应的辐射强度也不相同。所以可以根据所检测到的辐射强度对各元素进行定量分析。
当电子在每两个轨道间跃迁时，就以光的形式释放出多余的能量。由于原子轨道是不连续的，其价电子的跃迁也是不连续的，因此得到的光谱不是连续光谱，而是线状光谱。这种谱线的波长取决于两能级间的能量差。
△E=E2-E1= hv=hc/λ
有上公式可以看出，两个能级间的能量差越大，则辐射光的的波长越短。各种物质的光谱是很复杂的。不同元素原子结构有差异，能级间的能量差异各不相同，当受到激发后就辐射出各种元素固有的特征谱线。
（3）激发电位：使原子激发的能量叫做激发电位。应该根基激发电位的大小来选择合适的光源。激发电位低的元素可以用能量较低的光源，如Na、K的谱线可用火焰激发。激发电位高的元素，用能量较高的光源，如电弧、火花等光源。
激发电位低的元素用高能量光源激发时，往往会使其电离成离子，这种元素的原子达到电离所需要的能量，称为电离电位。离子与中性原子一样，也能被激发产生光谱，这种光谱成为离子线。
原子发射光谱分析过程的步骤提供外部能量使被测试式样蒸发、解离，产生气态原子，并使气态原子的外层电子激发至高能态。处于高能态的原子自发地跃迁回低能态时，以辐射的形式释放出多余的能量。
经过分光后形成一系列按波长顺序排列的谱线。
用光谱干板或检测器记录和检测各谱线的波长和强度，并据此解析出元素定性和定量的结论。
光谱分析的特点
优点：
灵敏度高选择性好：能同时测定几十种元素，而无须复杂的分离手续。实现各组分的分别测定。
准确度高：光谱分析的准确度随着被测元素含量的不同而不同。当含量大于1%分析的准确度较差，含量小于0.1%，其准确度优于化学分析法。
分析速度快：同时测定多种元素，几分钟可以测定十几中元素的分析结果。
样品用量少：样品用量为几毫克---几十毫克样品。
缺点：
由于取样量少，往往因为样品不均匀而使分析的误差增大；
光谱分析是一种相对的分析方法，需要一套标准样品对照，往往由于标准品不容易制备，给光谱分析造成一定的困难。
对一些非金属元素，如硫、卤素等，光谱分析的灵敏度很低，不宜采用。
光谱仪价格昂贵，实验费用较大。一般的化验室很难采用。
光谱分析的仪器光谱分析的仪器设备，主要由光源、摄谱仪和观测系统三部分组成。
5.1 光源：
光源的作用是对式样的蒸发和激发提供所需要的能量。提供外部能量使被测试式样蒸发、解离，产生气态原子，并使气态原子的外层电子激发至高能态。处于高能态的原子自发地跃迁回低能态时，以辐射的形式释放出多余的能量。
光谱分析中的经典光源有：支流电弧、交流电弧、电火花；新型光源有激光和等离子体等。
直流电弧：
采用上下两个电极，两极间施加一定直流电压（220-380V、5-30A），使两极间产生高压电弧。电极温度较高，适合于难挥发的元素。
交流电弧：
高压和低压交流电弧两种。电极温度低，交流电弧比较稳定，重现性和精确度好，适合于定量分析。
高压火花：
利用高压8000-15000V产生电火花，激发温度20000-40000K。有利于难激发元素的测定。
激光光源：
高强度，高单色性的光。可对直径10-250微米的微小区域进行显微分析。局部温度可达到10000K以上。
ICP（电感耦合高频等离子体焰炬）：
利用高频感应激发的光源。被认为是最有前景的激发光源。
5.2 摄谱仪：
光源发射的光，经过色散元件色散为按波长顺序排列的光谱，并用照相的方法记录光谱的仪器叫做摄谱仪。按照所使用色散元件的不同，分为棱镜摄谱仪和光栅摄谱仪两大类。
根据棱镜分辨能力的不同，可以将棱镜摄谱仪
根据棱镜分辨能力的不同，可以将棱镜分为大型摄谱仪（分辨力最好）、中型摄谱仪和小型摄谱仪。
光栅摄谱仪
性能优于棱镜摄谱仪，其色散率和分辨率都高，适合于分析那些谱线比较复杂的元素。
5.3 观测系统感光板
将感光材料涂在玻璃上而成。
光谱摄谱仪（映谱仪）
定性分析使用的仪器。
测微光度计（黑度计）
定量分析中应用的仪器
作业：
原子发射光谱定性分析的基本原理。
原子发射光谱定量分析的基本原理。
原子发射光谱定量分析的特点。
第三章 原子发射光谱光谱定性分析光谱定性分析是以在式样光谱中能否检出元素的特征谱线为依据。没每种元素都有许多条谱线，进行定性分析时，不必要把所有的谱线都一一找出，实际上只要找出元素的几条灵敏线或者特征谱线组，就可以确定式样中该元素是否存在。
元素的灵敏线及特征谱线组灵敏线（最后线）,PP210
特征谱线组：PP210
元素标准光谱图一般以铁的光谱为基准进行比较。
波长标尺：
定性分析方法：
比较法：
“识谱”
A 标准式样光谱比较法
B 与元素标准光谱图比较法摄谱方法（略）
光谱定量分析谱线强度与浓度关系内标法的原理乳剂特性曲线光谱定量分析三标准式样法光谱半定量分析比较光谱法显线法
ICP光谱法方法特点方法原理仪器设备干扰与检出线
作业：
电泳electrophoresis
?概 述
电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动。只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。
电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素；1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认 识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂贵难于普及。1940年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。
电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。
类? 别
名称
用支持体的电泳技术
1.纸上电泳
2.醋酸纤维薄膜电泳
3.薄层电泳
4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)
5.凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂（糖）凝胶
不用支持体的电泳技术
1.Tiselius或微量电泳
2.显微电泳
3.等电点聚焦电泳技术
4.等速电泳技术
5.密度梯度电泳
各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结 合研究核酸的一级结构。凝胶电泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方 面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。
?影响电泳的因素
不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表 示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有,
1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。
一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反 之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电 荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有 相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的 电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过 剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。
2、电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对 泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特,则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。
一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分 为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘 米；后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离 氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。
3、溶液的pH值
溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于 蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电 泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等 电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。 当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。
4、溶液的离子强度
溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离 子强度选择在0.05 - 0.1M之间。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散,高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低 电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。
5、电渗作用
在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在 电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时,γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动,这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以 吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由 于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的 力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。
琼脂糖凝胶电泳
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：
（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。
（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。
（3）电泳速度快。
（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。
（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。
然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。而琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖，含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。
琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。
琼脂糖电泳可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。
DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：
①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。
②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段。
③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。
④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围浓度<%（w/v）
分离线状DNA分子的有关范围（Kb)
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-3
2.0
0.1-2
丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
① 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子，是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③ 在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④ 丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。
在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表,
引 发 剂
加 速 剂
（NH4)2S2O8? （过硫酸胺）
TEMED （四甲基乙二胺）
（NH4)2S2O8? （过硫酸胺）
DMAPN （β－二甲基胺基丙晴）
核 黄 素
TEMED （四甲基乙二胺）
用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液,称光聚合反应。
聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响,
1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。
2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。
3、某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。
4、温度高聚合快，温度低聚合慢。
以上几点在制备凝胶时必须加以注意。 凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示。
交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三 度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。
有人测定了总浓度为20%的丙烯酰胺液，在六种不同比例的双丙烯酰胺存在下，聚合后的网孔大小。发现孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械 强度增强，与总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis)的浓度在5%时孔径最小，高于或 低于此值时，聚合体孔径都相对变大。凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它 往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践，得到了如表3所示的经验值，在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓 度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝 胶”。对那些用于重要研究的凝胶，最好是通过采用10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验，以选出最适凝胶浓度。
物 质
分子量范围
适用的凝胶浓度（%）
蛋白质
<104
1-4×104
4×104 -1×105
1-5×105
>5×105
20-30
15-20
10-15
5-10
2-5
核酸
<104
104-105
105-2×106
10-20
5-10
2-3.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲 液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨 能力。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体 有以下优点：
①电泳后区带界限清晰；
②通电时间较短（20分钟至1小时）；
③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；
④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。
它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸 水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出 发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。
选择的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响。若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白 电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。
电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做 上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不 同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多 物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
溶液中带电粒子（离子）在电场中移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1937?年瑞典学者?A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪?，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。
按分离原理的不同，电泳分为?4类：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳（见图）。
①移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电泳速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠（图a）。
②区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带（?图b?）。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。
③等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置?，形成一个个清晰的区带（?图c?），分辨率极高。
④等速电泳是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流?，所得到的区带是相互连接的（图d），且因“?自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。
电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。
等电聚焦
等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。
两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基－多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH＝3～10，也有各种较窄的范围如pH＝7～8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。
等电聚焦多采用水平平板电泳，也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2 mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带做为玻璃板间隔，可以形成厚度仅0.15 mm的薄层凝胶，大大降低成本，所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移，通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4％）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其是对于分子量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合，加入到带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板橇开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电极液（阳极为酸性如磷酸溶液，阴极为碱性如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH值由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值，等电点在pH值以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH＝pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH＝pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000V，0.5mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1小时），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意，由于两性电解质也会被染色，使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色，要首先经过10％的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。
等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点，将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.5～10之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。
等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性，例如一种蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的，所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析，但也可以用于纯化制备。虽然成本较高，但操作简单、纯化效率很高。除了通常的方法，制备性等电聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶如Sephadex G-75中进行。
毛细管电泳技术发展及应用前景
毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis,CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），毛细管电泳方法虽新工艺，但历史悠久，它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术，是由1937年A,Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis,CZE）。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔片数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb到DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。
毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于80年代中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展最为迅速的领域之一。
毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在 pH>3的情况下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。目前已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。
毛细管电泳技术的分离模式和检测模式的发展同样也是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的进展，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳技术（ACE），芯片毛细管电泳（CCE），非水毛细管电泳技术（NACE）；本文作者尝试将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合进行基因检测，取得较满意效果；国外已开始探索利用CE对PCR产物作DNA单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析筛查点突变。毛细管电泳技术发展迅速，是色谱最活跃的领域之一。毛细管电泳技术分离模式主要有以下几种。
（1）毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis,CZE）用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。CZE是最基本也是最常见的一种操作模式，应用范围最广，可用于多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。
（2）胶束电动毛细管色谱（Micellar? Electrokinetic Capillary Chromatography,MECC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸纳，形成胶束，被分离物质在水和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。MECC是唯一一种既能用于中性物质的分离又能分离带电组分的CE模式。
（3）毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis,CGE）在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶。CGE分凝胶和无胶筛分两类，主要用于DNA、RNA片段分离和顺序、PCR产物分析及蛋白质等大分子化合物的检测。
（4）亲和毛细管电泳，在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。
（5）毛细管电色谱，（Capillary Electrochromatography,CEC）是将高效液相色谱（HPLC）的固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。
（6）毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing,CIEF）是通过内壁涂层使电渗流减到最小，在两个电极槽分别装酸和碱，加高电压后，在毛细管内壁建立pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带。聚焦后，用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。CIEF已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。
（7）毛细管等速电泳，（Capillary isotachophoresis,CITP）采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。
（8）CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品，尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。可提供分子量及结构信息，适于目标化合物分析或窄质量范围内扫描分析，如多环芳香碳氢化合物（PAH）、寡聚核苷酸分析等。
毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：
（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。
（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。
（3）操作模式多，开发分析方法容易。
（4）实验成本低，消耗少。
（5）应用范围极广。
毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，甚至可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子/有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则可用于手性分离中性化合物。
毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域的应用也有较多应用。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。随着人类基因组计划的实施，人类基因组计划的完成比预期时间一再提前，其主要工具是毛细管电泳仪。但是人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。在医学研究中毛细管电泳技术越来越受到重视，但其临床应用尚属起步阶段，随着毛细管电泳技术的不断发展和完善，CE将在临床研究和基础研究领域发挥更重要的作用.
毛细管等速电泳 isotachophoresis 毛细管电泳分离模式之一。是基于样品中各组分电泳迁移率的差异，但是与毛细管区带电泳不同的是，等速电泳采用的是非连续的电解质溶液－前导电解质溶液充满整个毛细管，其淌度高于任何样品组分；终结电解质溶液置于一端的电泳槽中，其淌度低于任何样品组分。被分离组分按其不同的淌度夹在中间，所有组分按相同的电泳迁移速度一次流过检测窗口。
第七章 气相色谱法相色谱工作原理：是利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，?因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
气相色谱种类很多，性能也各有差别。主要包括两个系统。即气路系统和电路系统。气路系统主要有压力表、净化器、稳压阀、稳流阀、转子流量计、六通进样阀、进样器、色谱柱、检测器等；电子系统包括各用电部件的稳压电源、温控装置、放大线路、自动进样和收集装置、数据处理机和记录仪等电子器件。 按照功能单元分有：
（1）载气系统。包括气源、气体净化、气体流速控制和测量
（2）进样系统。包括进样器、汽化室——将液体样品瞬间汽化为蒸气
（3）色谱柱和柱温。包括恒温控制装置——将多组分样品分离为单个
（4）检测系统。包括检测器，控温装置
（5）记录系统。包括放大器、记录仪、有的仪器还有数据处理装置
为便于准确快速检测，GC-MS 和GC-FTIR 也是常用的联合检测组成。
另外，中心专家强度，在购置色谱仪时，不仅要注重主机的配置，对辅助配套设备也应该引起足够的重视，防止在性能和资金上的损失。
§5 气相色谱法原理（Gas Chromatography）
1,概述
1.1 色谱法:一种分离技术由俄国植物学家Tsweett创立
1.2原理
使混合物中各组分在两相间进行分配,其中一相是不动的(固定相),另一相(流动相)携带混合物流过此固定相,与固定相发生作用,在同一推动力下,不同组分在固定相中滞留的时间不同,依次从固定相中流出,又称色层法,层析法
1.3 分类
(1)气相色谱和液相色谱(流动相)
(2)柱色谱,纸(PC)色谱,薄层色谱(TLC)(固定相)
(3)吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,排阻色谱(物理化学原理)
(4)洗脱法,顶替法,迎头法
1.4 基本概念
4.死体积VM,VM = tM.F0(流动相体积流速)
5.保留体积VR,VR= tR,F0(流动相体积流速)
6.调整保留体积VR’,VR’= VR- VM
7.相对保留值r21,r21= VR’(2)/ VR’(1)
= tR’(2)/ tR’(1)
r21只与柱温,固定相性质有关,是色谱定性分析的重要参数,可用来表示固定相的选择性分配比k(partition ratio):
分配过程分配系数K=CS/CM
分配比k:在一定温度,压力下,在两相间达到平衡时,组分在两相之中的质量比
k=nS/nM k=KVS/VM (why?)
r21=k2/k1=K2/K1 k= tR’/ tM
色谱峰高区域宽度(Peak width):色谱峰宽度
1．标准偏差（σ）
即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。
2．半峰宽（Y1/2）
峰高一半处色谱峰的宽度 Y1/2=2.354σ
3．基线宽度（Y） Y=4σ
从色谱图得到的信息:
1.样品中所含组分数(峰个数)
2.定性分析(色谱峰的保留值)
3.定量分析(色谱峰面积或峰高)
4,评价色谱柱分离性能(区域宽度)
2,色谱分离法基本理论
涉及到试样中各组分在两相间的分配情况和各组分在色谱柱中的运动情况
2.1 踏板理论
1.假定:
(1)在每小段,气相平均组成与液相平均组成可以很快达到平衡,每小段高度称为理论踏板高度
(2)载气进入色谱柱是脉动似的,每次进气为一个板体积
(3)试样开始均加在第0号板上
(4)分配系数在各踏板上是常数(线性色谱)
2.内容
(1) 理论踏板数n>50(n=L/H)时,可得到基本对称的峰型曲线
(2)样品进入色谱柱后,可得到良好分离
(3)n与半峰宽及峰底宽的关系式当tR一定时,如果色谱峰越窄,则n越大,H越小,柱效能越高
(4)有效踏板数踏板理论只能定性给出板高的概念例题:p366 例1,例2
2.2 速率理论(rate theory)
1956年,Van Deemter等人提出的色谱过程的动力学理论,吸取了踏板理论中板高的概念,考虑影响板高的动力学因素,导出方程速率理论(rate theory)
H=A+B/u+u
1.涡流扩散项A(eddy diffusion term)
A=2(dp
使用适当细粒度和颗粒均匀的担体,尽量填充均匀,是减少涡流扩散,提高柱效的有效途径
2.分子扩散项(纵向扩散项)B(molecular diffusion term)
B=2 (Dg
采用相对分子质量较大的载气;担体填充均匀,可减少分子扩散
采用较高的载气流速,控制较低的柱温
3.传质项Cu)(resistance to mass transfer)
采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效固定相的液膜厚度薄,组分在液相的扩散系数大,则液相传质阻力就小
板高方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义,它指出了色谱柱填充的均匀程度,填料粒度的大小,流动相的种类与流速,固定相的液膜厚度对柱效的影响
4.载气流速u对理论踏板高度的影响
3,色谱分离条件的选择
3.1 柱效和选择性衡量柱效的指标:理论踏板数n有效衡量色谱柱的选择性:色谱图上两峰间的距离,主要取决于组分在固定相上的热力学性质
3.2 分离度(resolution)
R<1时,两峰不能分离
R=1时,两峰能分离
R=1.5时,两峰能完全分离要增大分离度需
1.增加踏板数n
2.加大容量因子(
3.增大选择性参数k
3.3色谱柱的选择与制备
1．固定相的选择
根据“相似相溶”的原则选择固定液,对于常见物质的分析，也可参阅色谱手册来确定合适的固定液。
固定液种类繁多，色谱手册中通常给出十几种优选固定液，能满足大部分色谱分析需要，对新试样要判别试样是否完全分离，需在不同分离柱上进行实验。
2．柱长和柱内径的选择已知分离度R正比于柱长的平方根，增加柱长对分离度有利，但会使组分的保留时间增加，且柱阻力增加，不便操作。柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱。填充色谱柱的柱长通常为1~3 m，内径3~4 cm。柱内径增加，柱效下降。
3．柱的制备
柱的制备包括固定液的涂渍和柱的填装。当选定固定液和担体后，还需确定固定液用量，原则是固定液应能均匀覆盖担体表面形成薄的液膜，固定液的用量通常用配比来表示（固定液与担体的质量比），一般在5%~25%之间。低配比，柱效较高。分析速度快，但允许的进样量低。
固定液的涂渍是将选定的固定液用合适的溶剂溶解后（溶剂用量以能完全浸没单体为宜），加入担体，缓慢蒸发溶剂至干燥。
螺旋形柱的填充通常采用真空填充法，应注意填充均匀，致密，但又不可使柱压太大。
4．色谱柱的老化制备好的色谱柱在使用前要进行老化处理，即将柱子在比其工作过程中的最高使用温度高25℃的情况下通载气加热几小时。为防止污染检测器，需将柱出口与检测器脱离直接引至室外。在老化过程中，填料中残存的溶剂以及固定相中可能存在的低沸点组分随载气流出。此外，还有助于使担体上的固定液分布的更加均匀。
3.4分离条件的选择
1．载气种类和流速的选择
由速率理论方程式：H = A + B / u + Cu可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，故必有一最佳载气流速能使色谱柱的理论塔板高度最小，柱效最高。当载气流速较小时，分子扩散项对柱效的影响较大，此时选用摩尔质量较大的气体如（N2，Ar）作为载气，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。当载气流速较大时，传质阻力项起主要作用，采用较小摩尔质量的载气（如H2，He），可减小传质阻力，提高柱效，载气的选择还应考虑检测器的种类。
２．柱温的选择
当柱子确定后，组分的分离程度还与柱温有关，因此，柱温的选择是十分重要的。首先应使柱温在固定液的最高至最低使用范围内。柱温升高，分离度下降，保留时间缩短，色谱峰变窄变高；柱温下降，分离度增加，分析时间延长。一般选择接近或略低于组分平均沸点的温度为柱温。对于组分复杂，沸程很宽的试样应采用程序升温的方法
３．进样方式和进样量的选择
液体试样采用色谱微量进样进样，进样器规格有1μL，10μL，100μL。
填充柱一般使用10μL进样器，进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样动作要快，时间要短。气体试样应采用气体进样阀进样。
４．气化温度的选择在色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，需要在此瞬间气化，气化温度一般较柱温高30~70℃。应防止气化温度太高而造成试样分解。
4.气相色谱
4.1气相色谱固定相
1.气固色谱固定相气固色谱固定相通常是具有一定活性的固体吸附剂细小颗粒，常见的有：活性炭，三氧化二铝，硅胶，分子筛，高分子多孔微球（GDX系列）等。
二、气液色谱固定相气液色谱固定相是以一种惰性固体微粒作支持剂（称其为担体或载体），在其表面涂敷上一高沸点的物质（其在色谱分离操作温度下呈液态，称其为固定液）而构成。
（一）担体
化学惰性的多孔固体微粒，具有较大的比表面积，固定液能均匀地分布在其表面。担体应能满足一定的要求。常见担体有硅藻土型和非硅藻土型两类。硅藻土型担体应用较广泛，它又分为红色担体和白色担体两种，它们都是由天然硅藻土煅烧而成。白色担体在煅烧前加入了少量助溶剂，如碳酸钠等。
红色担体：孔径较小，比表面积较大，具有较好的机械强度，适宜分离非极性或弱极性组分的试样。
白色担体：孔径较大，比表面积较小，机械强度较差，吸附性小适宜分离极性组分的试样。
担体使用前需要经过预处理（经酸洗、碱洗、硅烷化及釉化等处理，使担体表面钝化）。
（二）固定液
1．固定液通常是高沸点的有机化合物，使用时注意其使用温度。固定液应能满足一定的要求。
2．固定液的极性相对极性。
麦氏常数。
3．固定液的选择在掌握了固定液的相对极性和麦氏常数的基础上，根据试样的性质，参照“相似相溶”的原则，初步选择适当的固定液。
固定液的选择大致可分为以下五种情况：
（1）分离非极性组分一般选用非极性固定液。
（2）分离极性组分一般选用极性固定液。
（3） 分离非极性和极性（或易被极化的）组分的混合物一般选用极性固定液。
（4）分离能形成氢键的组分（如：醇，胺，水等）一般选用极性的或氢键型的固定液。
（5）对于复杂的难分离组分的分离通常采用特殊的固定液或混合固定液。
4.2气相色谱仪
1.气路系统(carrier gas)
(1)载气(2)气路结构(3)净化器(4)稳压恒流装置
2.进样系统(sample injection)
(1)进样器(2)气化室
3.分离系统色谱柱(capillary column)
4.温控系统
5.检测器(detector)
浓度型微分检测器:热导池检测器(thermal-conductivity detector TCD),
电子捕获检测器(electron-capture detector ECD)
质量型微分检测器:氢氧焰离子化检测器(hydrogen-flame ionization detector FID)
1.热导池检测器检测原理:不同的物质具有不同的热导系数 ECD FID
思考题:
1.进行色谱分析时,载气流速时高一些好,还是低一些好?
2.选择固定相时,应遵循什么原则?
3.热导池检测器的工作原理如何?
5,气相色谱分析方法及应用
5.5.1试样的预处理
1.化学衍生化2.裂解技术3.分离与富集 蒸馏,萃取,吸收,冷冻
5.5.1定性方法
1.利用保留值与已知物对照
(1)保留时间(2)峰高增量(3)双色谱系统
2.利用保留值经验规律定性碳数规律:一定温度下,同系物保留值的对数值与其分子中碳原子数成正比：lgtR’=A1n+C1
沸点规律:在一定色谱条件下,同族具有相同碳数的碳链异构体,其保留值的对数与其沸点成正比：
lgtR’=A2Tb+C2
3.根据文献保留值定性
(1)相对保留值定性法(2)保留指数定性法
5.5.2色谱定量方法
定量分析的依据:mi=fi’.Ai
fi’:相对校正因子
fi’=fi/fs=miAs/msAi
需要:
(1)准确测量峰面积(2)准确求出比例常数(3)正确选用定量分析方法
1.峰面积测量法
(1)Ai=1.065.hi.Y1/2(2)作图求峰面积(3)自动积分仪
2.定量方法
(1)外标法(external standard method)
6,高效液相色谱 HPLC（High Performance Liquid Chromatography）
6.1特点
1.高压2.高速3.高效4.高灵敏度对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物原则上都可用HPLC进行分离、分析
6.2 仪器
6.7 检测器溶质性检测器/紫外,电化学检测器/总体检测器:介电常数检测器
1.分析化学的发展和仪器分析的产生
分析化学的地位
无机化学 生物化学
分析化学
物理化学 有机化学
化学的其它领域
2.仪器分析的历史发展概况
2.1分析化学的发展和仪器分析的产生
（1）什么是仪器分析？
一般的说，仪器分析是指采用比较复杂或特殊的仪器设备，通过测量物质的某些物理或物理化学性质的参数及其变化来获取物质的化学组成、成分含量及化学结构等信息的一类方法,这些方法一般都有独立的方法原理及理论基础．
（2）定 义仪器分析是以物质的物理和物理化学性质为基础建立起来的一种分析方法，测定时，常常需要使用比较复杂的仪器．它是分析化学的发展方向．仪器分析是化学类专业必修的基础课程之一,
分析化学（分析学）是一门自然科学．它致力于建立和应用各种方法、仪器和战略以获得有关物质在一定时间或空间内的组成、结构和能态的信息,
这是一个高度概括的定义．它包括了任务、手段、目标和适用面；但不涉及分析化学的具体内涵,
物质的很多物理和物理化学性质与它们的化学组成、含量和结构之间也有着内在的联系，测定这些物理和物理化学性质，也可获得所需要的定性和定量分析信息．这类方法称之谓物理和物理化学分析法．
1.与化学分析的关系：相互和配合补充，化学分析以常量分析为主，仪器分析以微量分析为主．
2.不是一门独立的学科：需要其它学科的发展和支持
3.化学及生物研究的重要工具：许多学科的发展离不开仪器分析仪器分析的产生是科学技术发展的需要、必然，也是科学技术发展的结晶,
不少学科的发展对分析化学提出了更高的要求，如微量或痕量分析，无损分析，形态分析等．
仪器分析的历史发展概况仪器分析的三次巨大变革
第一次巨大变革分析天平的发明
溶液理论的建立（四大平衡的建立）
这是第一次革命
第二次巨大变革第二次世界大战前后的科学技术
物理学和电子技术的发展为仪器分析奠定了基础
第三次变革计算机的发明：尤其微型计算的发展，给仪器分析带来 全新的革命．
仪器分析的特点
1,灵敏度高，检出限低,
2,选择性好,
3,操作简便,分析速度快,易于实现自动化,
4,相对误差一般较大,
5,价格一般来说比教昂贵．
3.仪器分析的分类
1.光分析法：谱法和非光谱法
2,电分析化学方法：以电讯号作为计量关系的一类方法,主要有五大类,电导、电位、电解、库仑及伏安．
3,色谱法：是一类分离分析方法,主要有气相色谱和液相色谱,
4,其它仪器分析方法
① 质谱,② 热分析，③ 放射分析
4.前景展望科学仪器的创新是知识创新和技术创新的重要内容．发展科学仪器应当视为国家战略．分析仪器是科学仪器的重要组成部分．分析仪器工业是高技术信息产业．分析仪器的发展是现代科学、经济和社会发展的重要基础和推动力之一．分析仪器的主要应用领域正向生物医学领域转移．
分析仪器是人们感觉器官的延伸
分析仪器的微型化和智能化
分析仪器的大众化、个性化和日用品化，贵重仪器的网络化
建立和发展虚拟仪器概念,分析仪器的主要应用领域正向着生物医学领域转移
前景展望简单地说,
1,生命科学研究对分析化学提出高的要求．活体分析，单细胞分析，基因分析，及药物的检测等,
2.环境监测及控制,自动化 智能化 微型化基础课的要求
现代仪器分析法的种类十分繁杂，作为仪器分析基础课，只能选择其中最重要和最常用的方法作为本课程内容,
对待教学实验和基础课的关系．
通过本课程的学习，要求学生掌握仪器分析方法的原理和仪器的简单结构；要求学生初步具有根据分析的目的，结合学到的各种仪器分析方法的特点，应用范围，选择适宜的分析方法的能力,
课后作业：
名词解释仪器分析
分析化学简答题仪器分析的特点有那些？他与分析化学的关系？
仪器分析可以分为那些类别？
第二章 紫外-可见吸收光谱法序言
紫外-可见分光光度法具有如下特点：
A 灵敏度高：可进行微量分析10-5-10-6mol/L。
B 准确度高：误差为2-5%，符合微量分析的要求。
C 操作简便、分析速度快：几分钟
D 应用广泛：定性、定量、纯度分析等紫外-可见吸收光谱法（ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis）是研究波长范围在200-800nm光区内的分子吸收光谱的一种常用方法。该方法灵敏度和选择性较好，所使用的一起设备简单，广泛应用于无机和有机物质的定性和定量测定。
光学分析法概述光学分析法是根据物质发射、吸收电磁辐射以及物质与电磁辐射的相互作用来进行分析的一类仪器分析方法。光学分析方法有光谱方法和非光谱分析方法两类。
（其中紫外区：10-380nm）
光谱方法：
基于辐射的波长及强度测量的方法。通常需要测定式样的光谱，式样的光谱是由于物质原子或分子的特定能级的跃迁产生的。其作用可以进行定性分析（根据其特征光谱的波长）和定量分析（光谱的强度也与物质的含量有关）。
光谱方法可分为分子光谱和原子光谱。紫外-可见分光光度计、荧光光谱分析、及红外光谱分析属于分子光谱；而原子发射光谱分析和原子吸收光谱分析则属于原子光谱。
根据辐射能量的传递方式，光谱方法又可以分为发射光谱、吸收光谱、荧光光谱及拉曼光谱等。
非光谱方法：
主要利用电磁辐射与物质的相互作用所引起的电磁辐射在方向上的改变或物理性质的变化来进行分析。它不涉及光谱的测定（因为它不涉及能量的跃迁）。主要利用辐射的折射、反射、色散、散射、干涉及偏振等现象，如比浊法、偏振法、旋光色散法及X射线衍射等。
紫外-可见吸收光谱的产生及基本原理
2.1 物质对光的选择性吸收
分子的紫外-可见吸收光谱是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析方法。当某种物质受到光的照射时，物质分子就会与光发生碰撞，其结果是光子的能量传递到了分子上。这样，处于稳定状态的基态分子就会跃迁到不稳定的高能态，即激发态：
M（基态）+hv------M*（激发态）
这就是对光的吸收作用。
由于物质的能量是不连续的，即能量上一量子化的。只有当入射光的能量（hv）与物质分子的激发态和基态的能量差相等时才能发生吸收
△E=E2-E1= hv=hc/λ
而不同的物质分子因其结构的不同而具有不同的量子化能级，即△E不同，故对光的吸收也不同。
名词：
吸收光谱曲线（光吸收曲线）PPP7：它反映了物质对不同波长光的吸收情况。PPP7图2-1表示不同浓度的高锰酸钾溶液的吸收光谱。
紫外-可见吸收光谱定性分析的依据：光吸收程度最大处的波长叫做最大吸收波长，用λmax表示，同一种吸光物质，浓度不同时，吸收曲线的形状不同，λmax不变，只是相应的吸光度大小不同，这是定性分析的依据。
紫外-可见吸收光谱定量分析的依据：朗伯-比尔定律。
2.2 朗伯-比尔定律。
紫外-可见分光光度计的定量分析的依据是朗伯-比尔定律。
如图2-2（P8）
名词：透光率（透光度） T=I/I0
其中T越大表示对光的吸收越小，反之越大。
透光率倒数的对数称为吸光度：A=
1760年朗伯指出，如果溶液的浓度一定，则光的吸收强度A与溶液液层的厚度b成正比：
A=
1952年比尔又指出：当单色光通过液层厚度一定的含吸光物质的溶液后，溶液的吸光度A与溶液的浓度c成正比，既
A=
两个公式合并起来就是朗伯-比尔定律
A=
此公式的物理意义是，当一束平行的单色光通过均匀的含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质浓度及吸收层厚度成正比。若溶液浓度以mol/L表示，则此时 吸光系数称为摩尔吸光系数ε则
A=
其中ε为只能通过计算来求得，它是各种吸光物质对一定波长单色光吸收的特征系数。ε越大，表示该物质对此波长的光吸收能力越大。
在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和。
2.3 偏离比尔定律的原因主要原因：目前仪器还不能提供真正的单色光以及吸光物质性质的改变。
非单色光引起的偏离由于溶液本身的化学和物理因素引起的偏离分子结构与紫外-可见吸收光谱
3.1 分子的电子光谱分子内部的运动可分为价电子运动、分子内原子在平衡位置附近的震动和分子绕其中心的转动。因此分子具有电子能级、转动能级和震动能级。分子对电磁辐射的吸收是分子总能量变化的和。
E=Eel+Evib+Erot 电子electron vibrancy n.振动,振动性,活跃,响亮 滚动roll
3.2 有机化合物分子的电子跃迁和吸收带紫外-可见吸收光谱是由分子中价电子的跃迁而产生的。
3.3 影响吸收带的因素分子结构、溶剂的极性和温度等各种因素都会对吸收谱带产生影响。
电子共轭体系的影响空间阻碍的影响取代基的影响溶剂的影响课后作业：
名词解释：
朗伯-比尔定律
透光率（透光度）
简答：
可见吸收光谱的产生及基本原理
（2）朗伯-比尔定律
4,紫外-可见分光光度计基本结构结构：紫外-可见分光光度计一般由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录（计算机）等部分组成。
单光束分光光度计
单波长分类（按波长）,双光束分光光度计
双波长分光光度计单波长单光束分光光度计（P18图2-10）
光源 单色器 吸收池 检测器 读出装置
（样品槽）
721、722及751型分光光度计的工作原理如图所示：（首先仪器预热30MIN）光源发出的混合光经过单色器分光，得到平行单色光。（将装有参比或空白溶液的比色皿加入吸收池，调节A为零或T为100%，然后将装有待测液的比色皿加入吸收池中测定。）平行单色光通过吸收池后，出射光照射在检测器上转换成电信号，并有读出装置显示吸光度值。
（1）光源：作用是提供激发能，使待测分子吸收产生跃迁。要求光源能发出足够强的连续光谱，并具有良好的稳定性，且辐射能量随波长无明显变化。
紫外-可见分光光度计采用的光源有热辐射光源和气体放电光源。利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源，如钨灯（340-2500nm）、卤钨灯。气体放热光源是在低压直流电条件下，氢气或氘（dao）气放电所产生的连续辐射。一般为氢灯或氘等，他们在近自外区测定时使用。他们可以在160-360nm范围内产生连续辐射。
（2）单色器：单色器是从光源发出的复合光中分离出所需要的单色光的光学装置。P18图2-11
（3）吸收池：也成为比色皿，用于盛放分析试样，一般有石英和玻璃两种。石英比色皿适合与用于可见-紫外区的测量。玻璃池只用于可见区。为了减少反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。
（4）检测器：检测光信号，测量单色光通过溶液后光强度的变化，并将光信号转变成电信号。常用光电池或光电管作为检测器。
3.2 单波长双光束分光光度计单光束仪器中，分光后的单色光直接通过比色皿，分别通过样品和参比溶液（利用拉杆）。适合与特定波长的吸收。在双光束仪器中，从光源发出的光经过反射镜后分成相等的两束光，一束通过参比池，一束通过待测溶液；最后测定的是两者的光信号强度差。
优点是克服了单光束仪器由于光源不稳定引起的误差，并且可以方便的对全波段进行扫描。
3.3 双波长分光光度计（略）
也可以作为单波长双光束分光光度计。
优点是可以降低杂散光，光谱精度高。
5,定性分析
5.1 原理：紫外-可见光谱鉴定有机化合物，通常是在相同的测定条件下，比较未知物与已知化合物的紫外-可见吸收光谱图，若两者的谱图相同，则可知待测化合物与已知化合物具有相同的生色团。这也说明有时候两种化合物的紫外-可见吸收光谱图相同，但两者的结构不一定相同。有时候不同的分子结构产生相同的吸收光谱（但此时他们的吸光系数是不同的，所以在比较他们的λmax的同时也要比较它们的εmax。如果他们的λmax和εmax都相同则是同一种物质）。
物质（有机物质）的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团和助色团的特性，而表示她分子本身的特性。所以，仅仅靠紫外-可见光谱不能完全决定物质的分子结构，必须和其他的方法配合使用才能得到可靠的结论。
5.2 应用利用紫外-可见吸收光谱图可以对未知样品进行鉴定利用紫外-可见吸收光谱图可以对有机化合物的分子结构进行推断。
利用紫外-可见吸收光谱图可以对有机化合物的同分异构体进行推断。
利用紫外-可见吸收光谱图可以用于纯度的检查。
如果一化合物在紫外-可见区有较强的吸收带，有时可用摩尔吸光系数来检查其纯度。
6,定量分析
6.1 定量测定的条件测定波长的选择吸光度读数范围的选择狭缝宽度的选择有色化合物的形成
A 溶液的PH值
B 显色剂用量
C 反应时间
D 反应温度
E 掩蔽
F 加试剂的次序
6.2 单组分定量分析（工作曲线法/标准曲线法）
A 标准曲线的测定
B 样品测定
6.3 多组分混合物中各组分的同时测定
原理：根据在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有相加性。
7,几种常见的分光光度计
（1） 721可见分光光度计 测定的波长范围360-800nm，为一种 可见分光光度计。
（2） 722可见分光光度计 测定的波长范围330-800nm，为一种 可见分光光度计。
751紫外分光光度计
单光束紫外可见分光光度计，测定的波长范围200-1000nm。在320-1000nm内，用钨丝等做光源，在200-320nm内用氘灯做光源。
作业：
P28第3题简述单波长单光束分光光度计的工作原理（图）。
简述紫外-可见分光光度计在物质定性分析上的应用。
简述紫外-可见分光光度计在物质定量分析上的应用。
第三章 原子发射光谱原子发射光谱分析的定义：
习惯上简称光谱分析（AES，atomic emission spectrometry）；是通过记录和测量元素的激发态原子所发出的特征辐射的波长和强度对其进行定性、半定量和定量分析的方法。
光谱分析的基本原理：
（1）定性分析的基本原理：不同元素的原子结构不同，因而原子各能级之间的能量差△E也不同，各能级间的跃迁所对应的辐射也不同。所以可根据所检测到的辐射的频率或波长对样品进行定性分析。
（2）定量分析的基本原理：当元素含量不同时，同一波长所对应的辐射强度也不相同。所以可以根据所检测到的辐射强度对各元素进行定量分析。
当电子在每两个轨道间跃迁时，就以光的形式释放出多余的能量。由于原子轨道是不连续的，其价电子的跃迁也是不连续的，因此得到的光谱不是连续光谱，而是线状光谱。这种谱线的波长取决于两能级间的能量差。
△E=E2-E1= hv=hc/λ
有上公式可以看出，两个能级间的能量差越大，则辐射光的的波长越短。各种物质的光谱是很复杂的。不同元素原子结构有差异，能级间的能量差异各不相同，当受到激发后就辐射出各种元素固有的特征谱线。
（3）激发电位：使原子激发的能量叫做激发电位。应该根基激发电位的大小来选择合适的光源。激发电位低的元素可以用能量较低的光源，如Na、K的谱线可用火焰激发。激发电位高的元素，用能量较高的光源，如电弧、火花等光源。
激发电位低的元素用高能量光源激发时，往往会使其电离成离子，这种元素的原子达到电离所需要的能量，称为电离电位。离子与中性原子一样，也能被激发产生光谱，这种光谱成为离子线。
原子发射光谱分析过程的步骤提供外部能量使被测试式样蒸发、解离，产生气态原子，并使气态原子的外层电子激发至高能态。处于高能态的原子自发地跃迁回低能态时，以辐射的形式释放出多余的能量。
经过分光后形成一系列按波长顺序排列的谱线。
用光谱干板或检测器记录和检测各谱线的波长和强度，并据此解析出元素定性和定量的结论。
光谱分析的特点
优点：
灵敏度高选择性好：能同时测定几十种元素，而无须复杂的分离手续。实现各组分的分别测定。
准确度高：光谱分析的准确度随着被测元素含量的不同而不同。当含量大于1%分析的准确度较差，含量小于0.1%，其准确度优于化学分析法。
分析速度快：同时测定多种元素，几分钟可以测定十几中元素的分析结果。
样品用量少：样品用量为几毫克---几十毫克样品。
缺点：
由于取样量少，往往因为样品不均匀而使分析的误差增大；
光谱分析是一种相对的分析方法，需要一套标准样品对照，往往由于标准品不容易制备，给光谱分析造成一定的困难。
对一些非金属元素，如硫、卤素等，光谱分析的灵敏度很低，不宜采用。
光谱仪价格昂贵，实验费用较大。一般的化验室很难采用。
光谱分析的仪器光谱分析的仪器设备，主要由光源、摄谱仪和观测系统三部分组成。
5.1 光源：
光源的作用是对式样的蒸发和激发提供所需要的能量。提供外部能量使被测试式样蒸发、解离，产生气态原子，并使气态原子的外层电子激发至高能态。处于高能态的原子自发地跃迁回低能态时，以辐射的形式释放出多余的能量。
光谱分析中的经典光源有：支流电弧、交流电弧、电火花；新型光源有激光和等离子体等。
直流电弧：
采用上下两个电极，两极间施加一定直流电压（220-380V、5-30A），使两极间产生高压电弧。电极温度较高，适合于难挥发的元素。
交流电弧：
高压和低压交流电弧两种。电极温度低，交流电弧比较稳定，重现性和精确度好，适合于定量分析。
高压火花：
利用高压8000-15000V产生电火花，激发温度20000-40000K。有利于难激发元素的测定。
激光光源：
高强度，高单色性的光。可对直径10-250微米的微小区域进行显微分析。局部温度可达到10000K以上。
ICP（电感耦合高频等离子体焰炬）：
利用高频感应激发的光源。被认为是最有前景的激发光源。
5.2 摄谱仪：
光源发射的光，经过色散元件色散为按波长顺序排列的光谱，并用照相的方法记录光谱的仪器叫做摄谱仪。按照所使用色散元件的不同，分为棱镜摄谱仪和光栅摄谱仪两大类。
根据棱镜分辨能力的不同，可以将棱镜摄谱仪
根据棱镜分辨能力的不同，可以将棱镜分为大型摄谱仪（分辨力最好）、中型摄谱仪和小型摄谱仪。
光栅摄谱仪
性能优于棱镜摄谱仪，其色散率和分辨率都高，适合于分析那些谱线比较复杂的元素。
5.3 观测系统感光板
将感光材料涂在玻璃上而成。
光谱摄谱仪（映谱仪）
定性分析使用的仪器。
测微光度计（黑度计）
定量分析中应用的仪器
作业：
原子发射光谱定性分析的基本原理。
原子发射光谱定量分析的基本原理。
原子发射光谱定量分析的特点。
第三章 原子发射光谱光谱定性分析光谱定性分析是以在式样光谱中能否检出元素的特征谱线为依据。没每种元素都有许多条谱线，进行定性分析时，不必要把所有的谱线都一一找出，实际上只要找出元素的几条灵敏线或者特征谱线组，就可以确定式样中该元素是否存在。
元素的灵敏线及特征谱线组灵敏线（最后线）,PP210
特征谱线组：PP210
元素标准光谱图一般以铁的光谱为基准进行比较。
波长标尺：
定性分析方法：
比较法：
“识谱”
A 标准式样光谱比较法
B 与元素标准光谱图比较法摄谱方法（略）
光谱定量分析谱线强度与浓度关系内标法的原理乳剂特性曲线光谱定量分析三标准式样法光谱半定量分析比较光谱法显线法
ICP光谱法方法特点方法原理仪器设备干扰与检出线
作业：
电泳electrophoresis
?概 述
电泳是指带粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。例如蛋白质具有两性电离性质。当蛋白质溶液的pH在蛋白质等电点的碱侧时，该蛋白质带负电荷，在电场中向正极移动，相反则带正电荷，在电场中向负极移动。只有蛋白质溶液pH在蛋白质的等电点时静电荷是零，在电场中不向任何一极移动。
电泳现象早在1890年就被发现，1907年有人曾在琼脂中电泳，研究白喉毒素；1937年由Tiselius制成界面电泳仪，并开始用于蛋白质的研究。从此，人们才逐渐认 识到电泳技术对于生物科学研究是一种重要工具。然而，界面电泳结构复杂。价格昂贵难于普及。1940年左右。以纸为支持物的电泳问世后，电泳技术得到迅速发展。
电泳技术以支持物分，可分为纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，淀粉凝胶电泳，琼 脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。经凝胶形状分有水平平板电泳，园盘柱 状电泳及垂直平板电泳。各种类型的电泳技术概括如表。
类? 别
名称
用支持体的电泳技术
1.纸上电泳
2.醋酸纤维薄膜电泳
3.薄层电泳
4.非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等)
5.凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂（糖）凝胶
不用支持体的电泳技术
1.Tiselius或微量电泳
2.显微电泳
3.等电点聚焦电泳技术
4.等速电泳技术
5.密度梯度电泳
各类电泳技术已经广泛地用于基础理论研究，临床诊断及工业制造等方面。例如用醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白；用琼脂对流免疫电泳分析病人血清，为早期诊断原发性肝癌提供资料；用高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构；用高压电泳和层析结 合研究核酸的一级结构。凝胶电泳技术在分离分析酶。蛋白质，核酸等生物大分子方 面具有较高的分辩力，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。
?影响电泳的因素
不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度（或迁移率）来表 示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。影响泳动度的主要因素有,
1、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。
一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反 之则慢。泳动度还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，泳动度与颗表面电 荷成正比，与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有 相反电荷的离子吸引在其周围，形成一离子扩散层。加以电场时，颗粒向符号相反的 电极移动即带阳电荷颗粒移向负极，带阴电荷颗粒移向正移；离子扩散层由于带有过 剩的与颗粒符号相反的电荷，可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢，另外，高分了颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗 粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。
2、电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降，它对 泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特,则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。
一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分 为常压电泳和高压电泳，前者的电压在100-500伏特，电场强度一般是2-10伏特/厘 米；后者电压可高达500-1000伏特，电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时至数天，高压电泳时间短，有时仅几分钟即可，高压电泳主要用于分离 氨基酸，肽，核苷酸，由于电压升高，电压也随之增大，故需冷却装置。
3、溶液的pH值
溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于 蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电 泳速度越快；反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白等 电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06，β球蛋白等电点是5.1，γ球蛋白等电点是7.1。 当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度是白蛋 白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。同 时，为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。
4、溶液的离子强度
溶液的离子强度是另一个重要选择的条件，在保持足够缓冲能力前提下，离子强 度要最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离 子强度选择在0.05 - 0.1M之间。浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。如果这种额外的热可以驱散,高浓度的缓冲液扩散常数较低，可以产生较窄细的电泳区带。离子强度很高时要用低 电压，避免过多产热，这样又导致长的电泳时间，以致增加变性和区带分离困难。
5、电渗作用
在支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在 电场中液体对固体支持物的相对移动，例如在pH8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时,γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动,这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以 吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向反向阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由 于γ球蛋白分子颗粒大，净电荷较少，移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的 力，结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质，因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。
琼脂糖凝胶电泳
在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：
（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附 极微。
（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。
（3）电泳速度快。
（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。
（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。
然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。而琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多 糖，含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。
琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。 为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内的缓冲液，混匀后再用。
琼脂糖电泳可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5μg/ml溴化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至1ng的DNA。
DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：
①DNA分子的大小：线奖双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。
②琼脂糖浓度：给定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段。
③DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型），开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。
④应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V/cm。
不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围浓度<%（w/v）
分离线状DNA分子的有关范围（Kb)
0.3
5-60
0.6
1-20
0.7
0.8-10
0.9
0.5-7
1.2
0.4-6
1.5
0.2-3
2.0
0.1-2
丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
① 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子，是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③ 在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④ 丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。
在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表,
引 发 剂
加 速 剂
（NH4)2S2O8? （过硫酸胺）
TEMED （四甲基乙二胺）
（NH4)2S2O8? （过硫酸胺）
DMAPN （β－二甲基胺基丙晴）
核 黄 素
TEMED （四甲基乙二胺）
用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液,称光聚合反应。
聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响,
1、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。
2、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。
3、某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。
4、温度高聚合快，温度低聚合慢。
以上几点在制备凝胶时必须加以注意。 凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示。
交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。 聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三 度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯 的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本 身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。
有人测定了总浓度为20%的丙烯酰胺液，在六种不同比例的双丙烯酰胺存在下，聚合后的网孔大小。发现孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械 强度增强，与总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis)的浓度在5%时孔径最小，高于或 低于此值时，聚合体孔径都相对变大。凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它 往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践，得到了如表3所示的经验值，在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7.5%浓 度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝 胶”。对那些用于重要研究的凝胶，最好是通过采用10%的一系列凝胶浓度梯进行预先试验，以选出最适凝胶浓度。
物 质
分子量范围
适用的凝胶浓度（%）
蛋白质
<104
1-4×104
4×104 -1×105
1-5×105
>5×105
20-30
15-20
10-15
5-10
2-5
核酸
<104
104-105
105-2×106
10-20
5-10
2-3.6
聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类，前者指整个电泳系统中所用缓冲 液，pH值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨 能力。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂 十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙 醇，SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白 质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改 变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物 的短轴长度都不一样，约为18A，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不 再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜是由醋酸纤维素加工制成的。醋酸纤维素薄膜作为是电泳支持体 有以下优点：
①电泳后区带界限清晰；
②通电时间较短（20分钟至1小时）；
③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象；
④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。
它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素薄膜吸 水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
醋酸纤维素薄膜电泳已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出 发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。
选择的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响。若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓冲液。例如血清蛋白 电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。
电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做 上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不 同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多 物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
溶液中带电粒子（离子）在电场中移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。1937?年瑞典学者?A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪?，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。
在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数，是该带电粒子的物化特征性常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。
按分离原理的不同，电泳分为?4类：移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳（见图）。
①移动界面电泳是将被分离的离子（如阴离子）混合物置于电泳槽的一端（如负极），在电泳开始前，样品与载体电解质有清晰的界面。电泳开始后，带电粒子向另一极（正极）移动，泳动速度最快的离子走在最前面，其他离子依电泳速度快慢顺序排列，形成不同的区带。只有第一个区带的界面是清晰的，达到完全分离，其中含有电泳速度最快的离子，其他大部分区带重叠（图a）。
②区带电泳是在一定的支持物上，于均一的载体电解质中，将样品加在中部位置，在电场作用下，样品中带正或负电荷的离子分别向负或正极以不同速度移动，分离成一个个彼此隔开的区带（?图b?）。区带电泳按支持物的物理性状不同，又可分为纸和其他纤维膜电泳、粉末电泳、凝胶电泳与丝线电泳。
③等电聚焦电泳是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置?，形成一个个清晰的区带（?图c?），分辨率极高。
④等速电泳是在样品中加有领先离子（其迁移率比所有被分离离子的大）和终末离子（其迁移率比所有被分离离子的小），样品加在领先离子和终末离子之间，在外电场作用下，各离子进行移动，经过一段时间电泳后，达到完全分离。被分离的各离子的区带按迁移率大小依序排列在领先离子与终末离子的区带之间。由于没有加入适当的支持电解质来载带电流?，所得到的区带是相互连接的（图d），且因“?自身校正”效应，界面是清晰的，这是与区带电泳不同之处。
电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。
等电聚焦
等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。
两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基－多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH＝3～10，也有各种较窄的范围如pH＝7～8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。
等电聚焦多采用水平平板电泳，也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2 mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带做为玻璃板间隔，可以形成厚度仅0.15 mm的薄层凝胶，大大降低成本，所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移，通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4％）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其是对于分子量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合，加入到带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板橇开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电极液（阳极为酸性如磷酸溶液，阴极为碱性如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH值由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值，等电点在pH值以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH＝pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH＝pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000V，0.5mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1小时），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意，由于两性电解质也会被染色，使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色，要首先经过10％的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。
等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点，将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.5～10之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。
等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性，例如一种蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的，所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析，但也可以用于纯化制备。虽然成本较高，但操作简单、纯化效率很高。除了通常的方法，制备性等电聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶如Sephadex G-75中进行。
毛细管电泳技术发展及应用前景
毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis,CE）又称高效毛细管电泳（HPCE）或毛细管分离法（CESM），毛细管电泳方法虽新工艺，但历史悠久，它是在电泳技术的基础上发展的一种分离技术。电泳作为一种技术出现，已有近百年的历史，但真正被视为一种在生物化学中有重要意义的技术，是由1937年A,Tiselius 首先提出。传统电泳最大的局限是难以克服由高电压引起的焦耳热，1967年Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis,CZE）。但他没有完全克服传统电泳的弊端。现在所说的毛细管电泳技术（CE）是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支：胶束电动毛细管色谱（MEKC）。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
当电泳从凝胶板上移到毛细管中以后，发生了奇迹般的变化：分析灵敏度提高到能检测一个碱基的变化，分离效率达百万理论塔片数；分析片段能大能小，小到分辨单个核苷酸的序列，大到分离Mb到DNA；分析时间由原来的以小时计算缩减到以分、秒计算。CE可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。长期困扰我们的生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。
毛细管电泳技术是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术，迅速发展于80年代中后期，它实际上包含电泳技术和色谱技术及其交叉内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能。是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，是近几年来分析化学中发展最为迅速的领域之一。
毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以两个电解槽和与之相连的内径为20～100μm的毛细管为工具，毛细管电泳所用的石英毛细管柱，在 pH>3的情况下，其内表面带负电，和缓冲液接触时形成双电层，在高压电场的作用下，形成双电层一侧的缓冲液由于带正电荷而向负极方向移动形成电渗流。同时，在缓冲液中，带电粒子在电场的作用下，以不同的速度向其所带电荷极性相反方向移动，形成电泳，电泳流速度即电泳淌度。在高压电场的作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，带正电荷的分子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，带电粒子在毛细管缓冲液中的迁移速度等于电泳淌度和电渗流的矢量和，各种粒子由于所带电荷多少、质量、体积以及形状不同等因素引起迁移速度不同而实现分离；在毛细管靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器。目前已有多种灵敏度很高的检测器为毛细管电泳提供质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。由于毛细管的管径细小、散热快，即使是高的电场和温度，都不会向常规凝胶电泳那样使胶变性，影响分辨率。
毛细管电泳技术的分离模式和检测模式的发展同样也是多方面的，经典的分离模式有毛细管区带电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管凝胶电泳等；新方法的发展研究难度大，但近年来却有不小的进展，其中建立新的分离模式和联用技术最为突出。比如建立了阵列毛细管电泳（CAE），亲和毛细管电泳技术（ACE），芯片毛细管电泳（CCE），非水毛细管电泳技术（NACE）；本文作者尝试将分子信标技术与毛细管电泳技术相结合进行基因检测，取得较满意效果；国外已开始探索利用CE对PCR产物作DNA单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析筛查点突变。毛细管电泳技术发展迅速，是色谱最活跃的领域之一。毛细管电泳技术分离模式主要有以下几种。
（1）毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis,CZE）用以分析带电溶质。为了降低电渗流和吸附现象，可将毛细管内壁涂层。CZE是最基本也是最常见的一种操作模式，应用范围最广，可用于多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。
（2）胶束电动毛细管色谱（Micellar? Electrokinetic Capillary Chromatography,MECC）在缓冲液中加入离子型表面活性剂如十二烷基硫酸纳，形成胶束，被分离物质在水和胶束相（准固定相）之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。MECC是唯一一种既能用于中性物质的分离又能分离带电组分的CE模式。
（3）毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis,CGE）在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶。CGE分凝胶和无胶筛分两类，主要用于DNA、RNA片段分离和顺序、PCR产物分析及蛋白质等大分子化合物的检测。
（4）亲和毛细管电泳，在毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离。可用于研究抗原-抗体或配体-受体等特异性相互作用。
（5）毛细管电色谱，（Capillary Electrochromatography,CEC）是将高效液相色谱（HPLC）的固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂布固定相，以电渗流为流动相驱动力的色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。
（6）毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing,CIEF）是通过内壁涂层使电渗流减到最小，在两个电极槽分别装酸和碱，加高电压后，在毛细管内壁建立pH梯度，溶质在毛细管中迁移至各自的等电点，形成明显区带。聚焦后，用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值使溶质通过检测器。CIEF已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。
（7）毛细管等速电泳，（Capillary isotachophoresis,CITP）采用先导电解质和后继电解质，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。
（8）CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品，尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。可提供分子量及结构信息，适于目标化合物分析或窄质量范围内扫描分析，如多环芳香碳氢化合物（PAH）、寡聚核苷酸分析等。
毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是：
（1）所需样品量少、仪器简单、操作简便。
（2）分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高。
（3）操作模式多，开发分析方法容易。
（4）实验成本低，消耗少。
（5）应用范围极广。
毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织及其实验动物活体实验；且可分离分析多种组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序列分析和DNA合成中产物纯度测定等，甚至可用于碱性药物分子及其代谢产物、无机及有机离子/有机酸、单细胞分析、药物与细胞的相互作用和病毒的分析，如在缓冲液中加入表面活性剂则可用于手性分离中性化合物。
毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床医学等领域的应用也有较多应用。如临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片段及序列分析等。随着人类基因组计划的实施，人类基因组计划的完成比预期时间一再提前，其主要工具是毛细管电泳仪。但是人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。在医学研究中毛细管电泳技术越来越受到重视，但其临床应用尚属起步阶段，随着毛细管电泳技术的不断发展和完善，CE将在临床研究和基础研究领域发挥更重要的作用.
毛细管等速电泳 isotachophoresis 毛细管电泳分离模式之一。是基于样品中各组分电泳迁移率的差异，但是与毛细管区带电泳不同的是，等速电泳采用的是非连续的电解质溶液－前导电解质溶液充满整个毛细管，其淌度高于任何样品组分；终结电解质溶液置于一端的电泳槽中，其淌度低于任何样品组分。被分离组分按其不同的淌度夹在中间，所有组分按相同的电泳迁移速度一次流过检测窗口。
第七章 气相色谱法相色谱工作原理：是利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，?因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。
气相色谱种类很多，性能也各有差别。主要包括两个系统。即气路系统和电路系统。气路系统主要有压力表、净化器、稳压阀、稳流阀、转子流量计、六通进样阀、进样器、色谱柱、检测器等；电子系统包括各用电部件的稳压电源、温控装置、放大线路、自动进样和收集装置、数据处理机和记录仪等电子器件。 按照功能单元分有：
（1）载气系统。包括气源、气体净化、气体流速控制和测量
（2）进样系统。包括进样器、汽化室——将液体样品瞬间汽化为蒸气
（3）色谱柱和柱温。包括恒温控制装置——将多组分样品分离为单个
（4）检测系统。包括检测器，控温装置
（5）记录系统。包括放大器、记录仪、有的仪器还有数据处理装置
为便于准确快速检测，GC-MS 和GC-FTIR 也是常用的联合检测组成。
另外，中心专家强度，在购置色谱仪时，不仅要注重主机的配置，对辅助配套设备也应该引起足够的重视，防止在性能和资金上的损失。
§5 气相色谱法原理（Gas Chromatography）
1,概述
1.1 色谱法:一种分离技术由俄国植物学家Tsweett创立
1.2原理
使混合物中各组分在两相间进行分配,其中一相是不动的(固定相),另一相(流动相)携带混合物流过此固定相,与固定相发生作用,在同一推动力下,不同组分在固定相中滞留的时间不同,依次从固定相中流出,又称色层法,层析法
1.3 分类
(1)气相色谱和液相色谱(流动相)
(2)柱色谱,纸(PC)色谱,薄层色谱(TLC)(固定相)
(3)吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,排阻色谱(物理化学原理)
(4)洗脱法,顶替法,迎头法
1.4 基本概念
4.死体积VM,VM = tM.F0(流动相体积流速)
5.保留体积VR,VR= tR,F0(流动相体积流速)
6.调整保留体积VR’,VR’= VR- VM
7.相对保留值r21,r21= VR’(2)/ VR’(1)
= tR’(2)/ tR’(1)
r21只与柱温,固定相性质有关,是色谱定性分析的重要参数,可用来表示固定相的选择性分配比k(partition ratio):
分配过程分配系数K=CS/CM
分配比k:在一定温度,压力下,在两相间达到平衡时,组分在两相之中的质量比
k=nS/nM k=KVS/VM (why?)
r21=k2/k1=K2/K1 k= tR’/ tM
色谱峰高区域宽度(Peak width):色谱峰宽度
1．标准偏差（σ）
即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。
2．半峰宽（Y1/2）
峰高一半处色谱峰的宽度 Y1/2=2.354σ
3．基线宽度（Y） Y=4σ
从色谱图得到的信息:
1.样品中所含组分数(峰个数)
2.定性分析(色谱峰的保留值)
3.定量分析(色谱峰面积或峰高)
4,评价色谱柱分离性能(区域宽度)
2,色谱分离法基本理论
涉及到试样中各组分在两相间的分配情况和各组分在色谱柱中的运动情况
2.1 踏板理论
1.假定:
(1)在每小段,气相平均组成与液相平均组成可以很快达到平衡,每小段高度称为理论踏板高度
(2)载气进入色谱柱是脉动似的,每次进气为一个板体积
(3)试样开始均加在第0号板上
(4)分配系数在各踏板上是常数(线性色谱)
2.内容
(1) 理论踏板数n>50(n=L/H)时,可得到基本对称的峰型曲线
(2)样品进入色谱柱后,可得到良好分离
(3)n与半峰宽及峰底宽的关系式当tR一定时,如果色谱峰越窄,则n越大,H越小,柱效能越高
(4)有效踏板数踏板理论只能定性给出板高的概念例题:p366 例1,例2
2.2 速率理论(rate theory)
1956年,Van Deemter等人提出的色谱过程的动力学理论,吸取了踏板理论中板高的概念,考虑影响板高的动力学因素,导出方程速率理论(rate theory)
H=A+B/u+u
1.涡流扩散项A(eddy diffusion term)
A=2(dp
使用适当细粒度和颗粒均匀的担体,尽量填充均匀,是减少涡流扩散,提高柱效的有效途径
2.分子扩散项(纵向扩散项)B(molecular diffusion term)
B=2 (Dg
采用相对分子质量较大的载气;担体填充均匀,可减少分子扩散
采用较高的载气流速,控制较低的柱温
3.传质项Cu)(resistance to mass transfer)
采用粒度小的填充物和分子量小的气体作载气可提高柱效固定相的液膜厚度薄,组分在液相的扩散系数大,则液相传质阻力就小
板高方程对选择色谱分离条件具有实际指导意义,它指出了色谱柱填充的均匀程度,填料粒度的大小,流动相的种类与流速,固定相的液膜厚度对柱效的影响
4.载气流速u对理论踏板高度的影响
3,色谱分离条件的选择
3.1 柱效和选择性衡量柱效的指标:理论踏板数n有效衡量色谱柱的选择性:色谱图上两峰间的距离,主要取决于组分在固定相上的热力学性质
3.2 分离度(resolution)
R<1时,两峰不能分离
R=1时,两峰能分离
R=1.5时,两峰能完全分离要增大分离度需
1.增加踏板数n
2.加大容量因子(
3.增大选择性参数k
3.3色谱柱的选择与制备
1．固定相的选择
根据“相似相溶”的原则选择固定液,对于常见物质的分析，也可参阅色谱手册来确定合适的固定液。
固定液种类繁多，色谱手册中通常给出十几种优选固定液，能满足大部分色谱分析需要，对新试样要判别试样是否完全分离，需在不同分离柱上进行实验。
2．柱长和柱内径的选择已知分离度R正比于柱长的平方根，增加柱长对分离度有利，但会使组分的保留时间增加，且柱阻力增加，不便操作。柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱。填充色谱柱的柱长通常为1~3 m，内径3~4 cm。柱内径增加，柱效下降。
3．柱的制备
柱的制备包括固定液的涂渍和柱的填装。当选定固定液和担体后，还需确定固定液用量，原则是固定液应能均匀覆盖担体表面形成薄的液膜，固定液的用量通常用配比来表示（固定液与担体的质量比），一般在5%~25%之间。低配比，柱效较高。分析速度快，但允许的进样量低。
固定液的涂渍是将选定的固定液用合适的溶剂溶解后（溶剂用量以能完全浸没单体为宜），加入担体，缓慢蒸发溶剂至干燥。
螺旋形柱的填充通常采用真空填充法，应注意填充均匀，致密，但又不可使柱压太大。
4．色谱柱的老化制备好的色谱柱在使用前要进行老化处理，即将柱子在比其工作过程中的最高使用温度高25℃的情况下通载气加热几小时。为防止污染检测器，需将柱出口与检测器脱离直接引至室外。在老化过程中，填料中残存的溶剂以及固定相中可能存在的低沸点组分随载气流出。此外，还有助于使担体上的固定液分布的更加均匀。
3.4分离条件的选择
1．载气种类和流速的选择
由速率理论方程式：H = A + B / u + Cu可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，故必有一最佳载气流速能使色谱柱的理论塔板高度最小，柱效最高。当载气流速较小时，分子扩散项对柱效的影响较大，此时选用摩尔质量较大的气体如（N2，Ar）作为载气，可抑制试样的纵向扩散，提高柱效。当载气流速较大时，传质阻力项起主要作用，采用较小摩尔质量的载气（如H2，He），可减小传质阻力，提高柱效，载气的选择还应考虑检测器的种类。
２．柱温的选择
当柱子确定后，组分的分离程度还与柱温有关，因此，柱温的选择是十分重要的。首先应使柱温在固定液的最高至最低使用范围内。柱温升高，分离度下降，保留时间缩短，色谱峰变窄变高；柱温下降，分离度增加，分析时间延长。一般选择接近或略低于组分平均沸点的温度为柱温。对于组分复杂，沸程很宽的试样应采用程序升温的方法
３．进样方式和进样量的选择
液体试样采用色谱微量进样进样，进样器规格有1μL，10μL，100μL。
填充柱一般使用10μL进样器，进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样动作要快，时间要短。气体试样应采用气体进样阀进样。
４．气化温度的选择在色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，需要在此瞬间气化，气化温度一般较柱温高30~70℃。应防止气化温度太高而造成试样分解。
4.气相色谱
4.1气相色谱固定相
1.气固色谱固定相气固色谱固定相通常是具有一定活性的固体吸附剂细小颗粒，常见的有：活性炭，三氧化二铝，硅胶，分子筛，高分子多孔微球（GDX系列）等。
二、气液色谱固定相气液色谱固定相是以一种惰性固体微粒作支持剂（称其为担体或载体），在其表面涂敷上一高沸点的物质（其在色谱分离操作温度下呈液态，称其为固定液）而构成。
（一）担体
化学惰性的多孔固体微粒，具有较大的比表面积，固定液能均匀地分布在其表面。担体应能满足一定的要求。常见担体有硅藻土型和非硅藻土型两类。硅藻土型担体应用较广泛，它又分为红色担体和白色担体两种，它们都是由天然硅藻土煅烧而成。白色担体在煅烧前加入了少量助溶剂，如碳酸钠等。
红色担体：孔径较小，比表面积较大，具有较好的机械强度，适宜分离非极性或弱极性组分的试样。
白色担体：孔径较大，比表面积较小，机械强度较差，吸附性小适宜分离极性组分的试样。
担体使用前需要经过预处理（经酸洗、碱洗、硅烷化及釉化等处理，使担体表面钝化）。
（二）固定液
1．固定液通常是高沸点的有机化合物，使用时注意其使用温度。固定液应能满足一定的要求。
2．固定液的极性相对极性。
麦氏常数。
3．固定液的选择在掌握了固定液的相对极性和麦氏常数的基础上，根据试样的性质，参照“相似相溶”的原则，初步选择适当的固定液。
固定液的选择大致可分为以下五种情况：
（1）分离非极性组分一般选用非极性固定液。
（2）分离极性组分一般选用极性固定液。
（3） 分离非极性和极性（或易被极化的）组分的混合物一般选用极性固定液。
（4）分离能形成氢键的组分（如：醇，胺，水等）一般选用极性的或氢键型的固定液。
（5）对于复杂的难分离组分的分离通常采用特殊的固定液或混合固定液。
4.2气相色谱仪
1.气路系统(carrier gas)
(1)载气(2)气路结构(3)净化器(4)稳压恒流装置
2.进样系统(sample injection)
(1)进样器(2)气化室
3.分离系统色谱柱(capillary column)
4.温控系统
5.检测器(detector)
浓度型微分检测器:热导池检测器(thermal-conductivity detector TCD),
电子捕获检测器(electron-capture detector ECD)
质量型微分检测器:氢氧焰离子化检测器(hydrogen-flame ionization detector FID)
1.热导池检测器检测原理:不同的物质具有不同的热导系数 ECD FID
思考题:
1.进行色谱分析时,载气流速时高一些好,还是低一些好?
2.选择固定相时,应遵循什么原则?
3.热导池检测器的工作原理如何?
5,气相色谱分析方法及应用
5.5.1试样的预处理
1.化学衍生化2.裂解技术3.分离与富集 蒸馏,萃取,吸收,冷冻
5.5.1定性方法
1.利用保留值与已知物对照
(1)保留时间(2)峰高增量(3)双色谱系统
2.利用保留值经验规律定性碳数规律:一定温度下,同系物保留值的对数值与其分子中碳原子数成正比：lgtR’=A1n+C1
沸点规律:在一定色谱条件下,同族具有相同碳数的碳链异构体,其保留值的对数与其沸点成正比：
lgtR’=A2Tb+C2
3.根据文献保留值定性
(1)相对保留值定性法(2)保留指数定性法
5.5.2色谱定量方法
定量分析的依据:mi=fi’.Ai
fi’:相对校正因子
fi’=fi/fs=miAs/msAi
需要:
(1)准确测量峰面积(2)准确求出比例常数(3)正确选用定量分析方法
1.峰面积测量法
(1)Ai=1.065.hi.Y1/2(2)作图求峰面积(3)自动积分仪
2.定量方法
(1)外标法(external standard method)
6,高效液相色谱 HPLC（High Performance Liquid Chromatography）
6.1特点
1.高压2.高速3.高效4.高灵敏度对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的有机物原则上都可用HPLC进行分离、分析
6.2 仪器
6.7 检测器溶质性检测器/紫外,电化学检测器/总体检测器:介电常数检测器
