蛋白质的一级结构（共价结构）
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
蛋白质结构层次
一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
二级结构
↓
超二级结构
↓
构象（高级结构） 结构域
↓
三级结构(球状结构)
↓
四级结构(多亚基聚集体)
一级结构的要点
,
蛋白质测序的一般步骤祥见 P116
测定蛋白质分子中多肽链的数目。
拆分蛋白质分子中的多肽链。
测定多肽链的氨基酸组成。
断裂链内二硫键。
分析多肽链的N末端和C末端。
多肽链部分裂解成肽段。
测定各个肽段的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的顺序。
确定多肽链中二硫键的位置。
蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
N C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4
B 法裂解 B1 B2 B3 B4
用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
测序前的准备工作蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法：凝胶过滤法、沉降系数法确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化：
—S—S—+HCOOOH → SO3H
β巯基乙醇还原：
举例:,血红蛋白 (α2β2)
（注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
分子量,M
拆亚基,M1,M2 两条带
拆二硫键,M1,M2 两条带
分子量关系,M = 2M1 + 2M2
测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
②Cys 测定
5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB,412nm
端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
A-NHNH2,B-NHNH2,C-NHNH2,D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
肽链的部分裂解和肽段的分离纯化化学裂解法
①溴化氰 —Met—X— 产率85%
②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100%
③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
④羟胺NH2OH —Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys X
(X ≠ Pro)
Arg—— X
②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X
(X ≠ Pro)
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp,Try,Leu)——Phe(Trp,Try,Leu)
③Glu蛋白酶 Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶 Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys
⑥Pro蛋白酶 Pro——X
肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
肽段的序列测定及肽链的拼接
Edman法一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9,40℃ PTC——A-B-C-D……
（2）裂解
PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D
（3）转化
ATZ—A PTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
耦联：得PTC肽
一次循环 裂解：ATZ-?a.a
转化：PTH-a.a
反应产率 99％ 循环次数 120
(偶联、降 98% 60
解两步） 90% 40
DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图有色Edman法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
用Polybrene反应器。
（聚阳离子）四级铵盐聚合物
液相：5nmol 20-40肽 97%
气相：5pmol 60 肽 98%
肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷脂类：Ser,Thr、Cys
磷酸：Ser,Thr、His
经验性序列,Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
蛋白质的一级结构与生物功能蛋白质的一级结构决定高级结构和功能蛋白质一级结构举例：
牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128 图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7
A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）
P128 图3-39
分子量：12600
124个a.a残基
4个链内二硫键。
牛胰RNase变性一复性实验：
P164 图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。
（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构
P129 图3-40
同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130，图3-41
分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩 0
人与猴 1
人与狗 10
人与酵母 44
胰岛素祥见 P175 胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
蛋白质一级结构的个体差异—分子病分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的(链和两条相同的(链组成(2(2，镰刀形红细胞中，血红蛋白(链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血 β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10 Glu-
疏水 亲水人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
一级结构的部分切除与蛋白质的激活一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
血液凝固的机理
凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原 凝血酶
纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶凝血酶原
P133 图3-43 凝血酶原的结构
糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
A链49 a.a
B链259 a.a
纤维蛋白原
P133 图3-44 纤维蛋白原的结构
α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。
P133 纤维肽A,B的结构
A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。
P134上
在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
胰岛素原的激活
P134图3-45
胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
多肽与蛋白质的人工合成在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。
P139图3-46 多肽的固相合成
C端 N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合
蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
肽链的构象多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P144表3-12 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
P145 拉氏构象图（Gly除外）
⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二级结构的基本类型驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
α螺旋
α螺旋及其特征在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°,Ψ= - 48°，是一种右手螺旋回忆 P143图3-52
② 每圈螺旋：3.6个a.a残基,高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
图这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。
2.27螺旋（n=1）
310 螺旋（n=2，Φ= -49°,Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
2.27 310 3.613 4.316
n=1 n=2 n=3 n=4
α-螺旋 π-螺旋
R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
pH对α—螺旋的影响多聚L-Glu和多聚L-Lys
P149 图3-57
右手α-螺旋与左手α-螺旋
图 P148
右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。
α-螺旋结构的旋光性由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。
β-折叠
P149 图3—58 P150 图3—59
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同平行式：φ=-119° Ψ=+113°
反平行式：φ=-139° Ψ=+135°
从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。
在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。
β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）
β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
无规卷曲
没有规律的多肽链主链骨架构象。
球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。
α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。
超二级结构由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
αα结构（复绕α-螺旋）
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。
p153 图3-61 A
存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
βxβ结构两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。
①βcβ
x为无规卷曲
p153 图3-61 B
②βαβ
x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
p153 图3-61 C
β曲折（β-meander）
由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。
P153图3-61 D
回形拓扑结构（希腊钥匙）
P153图3-61 E
β-折叠桶由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。
超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。
α-螺旋-β转角-α-螺旋两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。
λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。
纤维状蛋白质纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。
角蛋白源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。
α-角蛋白
P155 图3-63，P156 图3-64
主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。
？(-角蛋白((-Keratin)中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一个II型多肽链形成一个卷曲螺旋二聚体(Coiled coil dimmer)。一对卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋结构称原纤维(Protofilament，4股右手(-螺旋)，原纤维的亚基间以氢键和二硫键相连。4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将纤维(fiber)含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？
β-角蛋白
P157 图3-65
含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主。
丝心蛋白取片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
胶原蛋白弹性蛋白肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白球状蛋白质的高级结构与功能前面讲了蛋白质结构的两个较低级的组织水平：一级结构和二级结构（包括超二级结构），本节讲述蛋白质（主要是球蛋白）的高级结构：结构域、三级结构、四级结构，及其与生物功能。
蛋白质的一级结构决定高级结构蛋白质功能的复杂性和多样性是建立在结构多样性的基础上。
多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当的顺序时，能自发形成α-螺旋和β-折叠，并处于稳定状态。
而多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。
同源蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。
RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我装配”。
P164 图3-69 RNase的变性与复性示意图球状蛋白质的结构域、三级结构与功能结构域结构域(domain)，又称motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。
对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，就是说这些蛋白质是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基，结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
每个结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是活性部位，也是反应物的出入口。一般情况下，酶的活性部位位于两个结构域的裂缝中。
EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn
亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，
图5.19
三级结构：
三级结构：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。
或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。
三级结构有以下特点：
( 许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。
( 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。
( 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体，典型情况下常常含有特定的功能(如结合离子和小分子)
维持三级结构的作用力：
P164 图3-70
（1）氢键大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋、β-折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）
包括三种弱的作用力：
定向效应 极性基团间诱导效应 极性与非极性基团间分散效应 非极性基团间
（3）疏水相互作用蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。
（4）离子键（盐键）
是正电贺和负电荷之间的一种静电作用。
生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Ｌys、Arg、His离解成正离子。多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相反电荷的测链在分子的疏水内部形成盐键。
（5）共价健，主要的是二硫键，
在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。
6、静电相互作用最强的静电作用就是带相反电何的离子基因间的静电作用，又称盐桥。盐桥和较弱的静电相互作用(离子-偶级、偶级-偶级、范德华力)也是维持亚基间以及蛋白质与配体间的作用力。
球状蛋白蛋在行使功能时，通常与小的配体或大分子(如核酸，其它蛋白质)精密结合。球状蛋白的表面通常有一个凹穴其结构与配体互补，当配体结合上去后，引起球状蛋白的构象变化，触发后续反应。
肌红蛋白的三级结构与功能：
肌红蛋白的三级结构肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，由一条多肽链和一个血红素辅基组成，分子量16.7Kd，含153个氨基酸。
P172 图3—76 图5.27 肌红蛋白的O2结合部位
多肽主链由8段直的α-螺旋组成，最长的α-螺旋有23个氨基酸残基，最短的α-螺旋有7个氨基酸残基。分子中几乎80%的氨基酸残基处在α-螺旋区内。连接两个相邻α-螺旋的是 松散肽段，由1~8个氨基酸组成。
8段螺旋分别命名为A、B、C…H。相邻的非螺旋区肽段为NA、AB、BC…GH、HC。
4个Pro残基各自处在一个拐弯处，Ser、Thr、Asn、Ile也处在拐弯处。
肌红蛋白多肽链绕曲成球状分子，球体内充满非极性氨基酸残基：Val、Leu、Met、Phe等，亲水的基团几乎全部分布在球状分子的外表面。整个分子单结构域。
辅基：血红素（铁卟啉），扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。
P173
卟啉环中心的Fe2+有六个配位键，其中4个与平面卟啉分子的N结合，另外两个与卟啉平面垂直，1个与93位His(F8)的咪唑N结合，另一个处于开放状态，可结合O2。
蛋白质为血红素提供一个疏水环境，避免Fe2+被氧化而失去氧合能力。
CO与血红素结合能力比O2的大200倍，CO中毒原理肌红蛋白的氧合曲线肌红蛋白：Mb 氧合肌红蛋白：MbO2。
解离平衡常数,
氧浓度与氧分压成正比
给定氧压下肌红蛋白氧饱和度
（4）式代入（3）式，
K= （1-Y）PO2
Y
以肌红蛋白的氧饱和度Y和氧分压PO2作图。
P174 图3-77 氧合曲线
当Y=1时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白被氧饱和K=0
Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K，解离常数K称为P50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。
Hill曲线和Hill系数
Y PO2 Log Y = Log PO2 — Log K
1-Y K 1-Y
P174 图3-78Hill曲线蛋白质四级结构与功能形成四级结构的亚基间必需构象互补和电荷（或极性）互补。
蛋白质的四级结构具有三级结构的亚单位，通过离子键、范德华力、氢键等聚集而成的特定构象寡聚蛋白由几条肽链组成。每一条肽键称为一个亚基（或单体）。亚基间的互补界面的是疏水性的。
有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。
维持四级结构的作用有：氢键、疏水作用、静电作用、共价健共价键也维持四级结构：( 免疫球蛋白的二硫键；( 弹性蛋白中的锁链素(由4个Lys侧链形成的交联体desmosine)；( Lysinonorleucine(赖氨硫正亮氨酸)，见于弹性蛋白和胶原蛋白。
球状蛋白聚集成四级结构具有下列优势
①结构更复杂，以便行使更复杂的功能。
②通过协同作用，实现对酶活性的调节。
③把中间代谢途径中各种酶分子聚体在一起，提高催化效率。
④形成一定的几何形状，细菌鞭毛。
⑤适当降低溶液渗透压。
寡聚蛋白与别构效应别构蛋白：多是寡聚蛋白，每个亚基除了有活性部位（结合抵牾）外，还有别构部位（结合调节物），有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。
别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位的影响。
同位效应（同种效应）：别构蛋白与一种配基的的结合对于和后续同种配基结合能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应，也可能指别构部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成`是对同位效应的一种修饰异位效应（异种效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。
协同效应：一种配基的结合促进后续配基的结合，S型结合曲线。
负协同效应：一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。
正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。
负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。
血红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构：
成人,HbA α2β2 98%
HbA2 α2δ2 2%
胎儿 HbF α2γ2
早期胚胎,α2ε2
α：141a.a,β、γ、δ：146a.a
α、β间大量的盐键，2.3—二磷酸甘油酸。
血红蛋白分子接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。
血红蛋白的α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似，但这三种多肽链的氨基酸顺序有较大不同，141个氨基酸残基中有20多个相同，似乎不同的a.a顺序也能形成非常相似的高级结构。
P129 图3-40 血红蛋白α、β链的氨基酸序列 P181 图3-86 β亚基的三级结构血红蛋白的氧合曲线（与肌红蛋白比较）
血红蛋白由4个亚基组成，每个亚基都与肌红蛋白类似，含有一个血红素，都能结合一分子O2,四个亚基之间具有协同效应，第一个配基的结合能提高其它亚基对O2的亲和力。因此，它的氧合曲线是S型曲线
P185图3—93、3—93
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气，。
PO2 n
血红蛋白P50=26 torr，n=2.8，Y= K+ PO2 n
肺泡氧压：Po2 =100 torr 肌肉毛细血管：Po2 =20 torr
在肺泡中,Y=0.97
在毛细血管中 Y=0.25
释放氧 △Y=0.97—0.25=0.72
若无协同效应，血红蛋白的氧合曲线与肌红蛋白的相同，当Po2从 100→20 torr时，△Y不足0.1。
波耳效应及其生理意义血红蛋白上有CO2和DPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2 。
波耳效应：增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+ 和CO2 。
P187 图3-95 pH对血红蛋白氧合的影响
DPG的别构效应血红蛋白是一个别构蛋白，DPG是它的效应物。DPG（二磷酸甘油酸）通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。
P189 图3-96 DPG对血红蛋白氧合曲线的影响
无DPG时，P50=1 torr,DPG=4.5mM时，P50=26 torr
DPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有DPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，DPG能降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。
（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；DPG升高。
（2）血库储血时加入肌苷可防止DPG的降解。
协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率免疫球蛋白的结构与功能免疫球蛋白是糖蛋白，它是脊椎动物体内合成的抗体。
抗原与抗体抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。
抗原性包括免疫原性和抗原特异性。
免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。
抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。
抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。
抗原决定簇的作用：
①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。
②与相应抗体的Fab结合。
抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。
抗体具有两个特点：
①高度特异性
②多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。
抗原抗体反应抗体是2价的，抗原是多价的。
抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。
抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。
抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。
图
抗原抗体反应的条件：
①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。
②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键
等）
免疫球蛋白的一级结构
P193 图3-99
蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
P197 表3-16
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）
等电点：
P198表3-17 3-18
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
SDS-PAGE（荷质比相同，分子量不同）
离子交换层析分离蛋白质与氨基酸分离原理相似蛋白质的大小与形状测分子量的方法：
化学组成法凝胶过滤法
SDS-PAGE法胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）
透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素
①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。
沉淀蛋白质的方法
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。
②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数
③重金属盐沉淀
pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+,Pb2+,Cu2+ 等）结成不溶性沉淀
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法
pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。
生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。
酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。
⑤加热变性沉淀。
往往是不可逆的。
蛋白质的变性变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其它理化常数改变。
（1）变性的因素：
( 强酸和强碱；( 有机溶剂，破坏疏水作用；( 去污剂、去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；( 还原性试剂：尿素、(-硫基乙醇；( 盐浓度、盐析、盐溶；( 重金属离子，Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。( 温度；( 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。
（2）变性的实质：
次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。
（3）蛋白质变性后，往往出现下列现象：
①结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
②硫水侧链基团外露。
③理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。
④生理化学性质改变。分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。
实际应用：
A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。
B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
（4）变性机理
①热变性（往往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。
②酸碱变性：破坏了盐链。
③有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。
（5）可逆变性与不可逆变性有人认为：二级、三级或四级结构遭受被破坏即为变性，三级（或四级）结构被破坏时引起可逆变性，而二级及三级（或四级）结构一并遭破坏时引起不可逆变性。
分离纯化蛋白质的主要方法实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开原理：
1,溶解度差异
PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法
2,热稳定性差异热处理沉淀法铜锌SOD（65℃、15分钟、稳定）
3,电荷性质差异离子交换层析法电泳法
4,分子大小和形状差异凝胶过滤、超滤法透析法、离心法
5,亲和力的差异亲和层析法某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。
配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。
分离原理：
P224 图3-124
蛋白质毒素一些致病生物产生的毒素中有很多是蛋白质。毒性机理有：( 破坏细胞膜；( 干扰细胞内机能；( 抑制神经细胞突触的功能。
直接作用于细胞膜的毒素称溶细胞毒素，可以由细菌、真菌、植物、鱼、蛇等产生。链球菌属(Streptoccus)Pyogene产生的链球菌溶血素(包括0.5等)，能使精细胞产生孔洞，Na+等离子外渗，细胞死亡。链球菌溶血素O是产生风湿热的原因之一(rheiematie fever)。此外，一些有毒的酶点，如蛇的磷酯酶在A2也能破坏细胞膜。
破坏细胞内机能的毒素也很多，如白候杆菌(Corynebacteriadiphtheriae)产生的白候毒素(diphtheria toxin)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生的霍乱毒素(cholera toxin)。它们均由A、B两个亚基组成，B亚基与靶细胞结合，A亚基致毒。白候毒素分子一旦进入靶细胞，AB亚在就分开，A亚基是一种酶能阻止蛋白质的合成，寄主的心、肾和神经组织都会被破坏。
霍乱毒素的B亚基由5个相同亚基组成，B亚基与肠细胞膜结合，A亚基就被送入这些细胞中，A亚基激活一种酶使cAMP大量产生，cAMP打开细胞膜的CL通道，由于CL-外泄引起渗适压的改变，水分也大量丧失，结果导致腹泻(diarrhoea)，不加治疗的话，严重的脱水可使病人48小时内死亡。
神经突触连接两个神经元或一个神经元与一个肌肉细胞。一种毒蜕的产生的毒素(-Latrotoxin(125KD)是一条多肽链，能剌激神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)的广谱性释放酶。肉毒杆菌(Lostrldium botulinum)产生的肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)能抑制Ach释放酶肉毒中毒(botulism)为是由于受了被污染的罐袋食物引起的。
蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。
蛋白质结构层次
一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构）
↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序
二级结构
↓
超二级结构
↓
构象（高级结构） 结构域
↓
三级结构(球状结构)
↓
四级结构(多亚基聚集体)
一级结构的要点
,
蛋白质测序的一般步骤祥见 P116
测定蛋白质分子中多肽链的数目。
拆分蛋白质分子中的多肽链。
测定多肽链的氨基酸组成。
断裂链内二硫键。
分析多肽链的N末端和C末端。
多肽链部分裂解成肽段。
测定各个肽段的氨基酸顺序确定肽段在多肽链中的顺序。
确定多肽链中二硫键的位置。
蛋白质测序的基本策略对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。
直接法（测蛋白质的序列）
两种以上特异性裂解法
N C
A 法裂解 A1 A2 A3 A4
B 法裂解 B1 B2 B3 B4
用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。
间接法（测核酸序列推断氨基酸序列）
核酸测序，一次可测600-800bp
测序前的准备工作蛋白质的纯度鉴定纯度要求，97%以上，且均一，纯度鉴定方法。（两种以上才可靠）
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
测定分子量
用于估算氨基酸残基n=
方法：凝胶过滤法、沉降系数法确定亚基种类及数目多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式：
⑴非共价键结合
8mol/L尿素，SDS SDS-PAGE测分子量
⑵二硫键结合
过甲酸氧化：
—S—S—+HCOOOH → SO3H
β巯基乙醇还原：
举例:,血红蛋白 (α2β2)
（注意，人的血红蛋白α和β的N端相同。）
分子量,M
拆亚基,M1,M2 两条带
拆二硫键,M1,M2 两条带
分子量关系,M = 2M1 + 2M2
测定氨基酸组成主要是酸水解，同时辅以碱水解。氨基酸分析仪自动进行。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。
①Trp测定
对二甲基氨基苯甲醛 590nm。
②Cys 测定
5、5/一二硫代双（—2—硝基苯甲酸）DTNB,412nm
端基分析
①N端分析
DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
②C端分析
A．肼解法
H2N-A-B-C-D-COOH 无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
A-NHNH2,B-NHNH2,C-NHNH2,D-COOH
氨基酸的酰肼，用苯甲醛沉淀，C端在上清中，Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
B．羧肽酶法（Pro不能测）
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys
N H2N… … … … …Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
肽链的部分裂解和肽段的分离纯化化学裂解法
①溴化氰 —Met—X— 产率85%
②亚碘酰基苯甲酸 —Trp—X— 产率70-100%
③NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸）—X—Cys—
④羟胺NH2OH —Asn—Gly—
约150个氨基酸出现一次酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys X
(X ≠ Pro)
Arg—— X
②胰凝乳蛋白酶 Tyr——X
(X ≠ Pro)
Trp——X
Phe——X
胃蛋白酶
Phe(Trp,Try,Leu)——Phe(Trp,Try,Leu)
③Glu蛋白酶 Glu——X
（V8蛋白酶）
④Arg蛋白酶 Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys
⑥Pro蛋白酶 Pro——X
肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）
根据肽段的电荷特性分离
③反相ＨＰＬＣ法
根据肽段的极性分离
④凝胶过滤肽段纯度鉴定分离得到的每一个肽段，需分别鉴定纯度，常用ＤＮＳ－c l法要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、ＨＰＬＣ单峰、Ｎ端单一。
肽段的序列测定及肽链的拼接
Edman法一次水解一个Ｎ端a.a
（1）耦联
PITC ＋ H２N—A-B-C-D…… pH8—9,40℃ PTC——A-B-C-D……
（2）裂解
PTC—A-B-C-D……TFA无水三氟乙酸 ATZ—A + H2N—B-C-D
（3）转化
ATZ—A PTH—A
用GC或HPLC测定PTH-A
PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）
PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
耦联：得PTC肽
一次循环 裂解：ATZ-?a.a
转化：PTH-a.a
反应产率 99％ 循环次数 120
(偶联、降 98% 60
解两步） 90% 40
DNS-Edman法用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。
Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ肽
图有色Edman法荧光基团或有色试剂标记的PITC试剂。
用自动序列分析仪测序仪器原理：Edman法，可测60肽。
1967液相测序仪
自旋反应器，适于大肽段。
1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。
1981气相测序仪
用Polybrene反应器。
（聚阳离子）四级铵盐聚合物
液相：5nmol 20-40肽 97%
气相：5pmol 60 肽 98%
肽段拼接成肽链
16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT
Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO
重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS
二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定二硫键的确定（双向电泳法）
碘乙酰胺封闭-SH
胃蛋白酶酶解蛋白质第一向电泳过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H
第二向电泳分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。
酰胺的确定
Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn
举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。
糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，-N-糖苷 -0-糖苷脂类：Ser,Thr、Cys
磷酸：Ser,Thr、His
经验性序列,Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)
Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)
Lys(Arg) –Ala-Ser(PO4)
蛋白质的一级结构与生物功能蛋白质的一级结构决定高级结构和功能蛋白质一级结构举例：
牛胰岛素
Sanger于1953年首次完成测序工作。
P128 图3-38
分子量：5700 dalton
51个a.a残基，A链21个残基，B链30个残基，
A链内有一个二硫键 Cys 6—Cys 11
A.B链间有二个二硫键 A.Cys 7 — B Cys 7
A.Cys 20—B Cys 19
（2）核糖核酸酶（RNase）
P128 图3-39
分子量：12600
124个a.a残基
4个链内二硫键。
牛胰RNase变性一复性实验：
P164 图3-69。
(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析，透析后构象恢复，
活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。
（3）人血红蛋白α和β链及肌红蛋白的一级结构
P129 图3-40
同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内具有同一功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。
同源蛋白质的特点：
①多肽链长度相同或相近
②同源蛋白质的氨基酸顺序中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
③除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化，亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。
细胞色素C
存在于线粒体膜内，在真核细胞的生物氧化过程中传递电子。
P130，图3-41
分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。
25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。
60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。
亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。
亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。
人与黑猩猩 0
人与猴 1
人与狗 10
人与酵母 44
胰岛素祥见 P175 胰岛素的结构与功能
不同生物的胰岛素a.a序列中，有24个氨基酸残基位置始终不变，
A．B链上6个Cys 不变（重要性），其余18（24-6）个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。
其它氨基酸 对稳定蛋白质的空间结构作用不大，但对免疫反应起作用，猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。
蛋白质一级结构的个体差异—分子病分子病：基因突变引起某个功能蛋白的某个（些）氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，致使其功能部分或全部丧失。
Linus Pauling首先发现镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的，成人的血红蛋白是由两条相同的(链和两条相同的(链组成(2(2，镰刀形红细胞中，血红蛋白(链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val。因此，当血红蛋白没有携带O2时就由正常的球形变成了刚性的棍棒形，病人的红细胞变成镰刀形，容易发生溶血作用(血细胞溶解)导致病血，棍棒形的血红蛋白对O2的结合力比正常的低。
以血红蛋白为例：α2β2寡聚蛋白正常人血红蛋白，β.N......Glu 6
镰刀型贫血 β.N......Val 6
生理条件下电荷：
Va10 Glu-
疏水 亲水人的血红蛋白分子的四条肽链中（574个氨基酸残基）只有两个Glu分子变化成Va1分子，就能发生镰刀状细胞贫血病。
一级结构的部分切除与蛋白质的激活一些蛋白质、酶、多肽激素在刚合成时是以无活性的前体形式存在，只有切除部分多肽后才呈现生物活性，如血液凝固系统的血纤维蛋白原和凝血酶原，消化系统的蛋白酶原、激素前体等。
血液凝固的机理
凝血因子（凝血酶原致活因子）
凝血酶原 凝血酶
纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶凝血酶原
P133 图3-43 凝血酶原的结构
糖蛋白，分子量66000，582个a.a残基，单链。
在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274—Thr275和Arg323—Ile324断裂，释放出274个a.a，产生活性凝血酶。
A链49 a.a
B链259 a.a
纤维蛋白原
P133 图3-44 纤维蛋白原的结构
α2β2r2
α肽：600个氨基酸，β肽：461氨基酸，r肽：410个氨基酸在凝血酶作用下，从二条α链和二条β链的N端各断裂一个特定的肽键-Arg—Gly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。
P133 纤维肽A,B的结构
A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。
P134上
在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。
胰岛素原的激活
P134图3-45
胰岛素在胰岛的β细胞内质网的核糖体上合成，称前胰岛素原，含信号肽。前胰岛素原在信号肽的引导下，进入内质网腔，进入后，信号肽被信号肽酶切除，生成胰岛素原，被运至高尔基体贮存。并在特异的肽酶作用下，切除C肽，得到活性胰岛素。
多肽与蛋白质的人工合成在医药和研究方面意义重大
1958年，北大生物系合成催产素8肽。
1965年，中国科学院生化所、有机所、北大化学系人工合成牛胰岛素。
1969年，美国Merrifield用自动化的固相多肽合成仪合成第一个酶——牛胰RNase（124aa—）。
P139图3-46 多肽的固相合成
C端 N端。
挂接→去保护→中和→缩合→去保护→中和→缩合
蛋白质的二级结构和纤维状蛋白质二级结构是指多肽链中有规则重复的构象。
肽链的构象多肽链的共价主链上所有的α--碳原子都参与形成单键，因此，从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，目前已知，一个蛋白质的多肽链在生物体内只有一种或很少几种构象，且相当稳定，这种构象称天然构象，此时蛋白质具有生物活性，这一事实说明：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转。
肽链的二面角
P143图3-51、图3-52
多肽主链上只有α碳原子连接的两个键（Cα—N1和Cα-C2）是单键，能自由旋转。
环绕Cα—N键旋转的角度为Φ
环绕Cα—C2键旋转的角度称Ψ
多肽链的所有可能构象都能用Φ和Ψ这两个构象角来描述，称二面角。
当Φ的旋转键Cα-N1两侧的N1-C1和Cα-C2呈顺式时，规定Φ=0°。
当Ψ的旋转键Cα-C2两侧的Cα-N1和C2-N2呈顺式时，规定Ψ=0°。
从Cα向N1看，顺时针旋转Cα-N1键形成的Φ角为正值，反之为负值。
从Cα向C2看，顺时针旋转Cα- C2键形成的Ψ角为正值，反之为负值。
多肽链折叠的空间限制
Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在，因为两个相邻肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接触距离比其范德华半经之和小，空间位阻。
因此二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P144表3-12 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。
拉氏构象图：Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。
P145 拉氏构象图（Gly除外）
⑴实线封闭区域一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。
⑵虚线封闭区域是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，但构象不够稳定。
⑶虚线外区域是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
Gly的Φ、Ψ角允许范围很大。
总之，由于原子基因之间不利的空间相互作用，肽链构象的范围是很有限的，对非Gly 氨基酸残基一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％。
二级结构的基本类型驱使蛋白质折叠的主要动力：
(1)暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度。
(2)要保持处于伸展状态的多肽链和周围水分子间形成的氢键相互作用的有利能量状态。
α螺旋
α螺旋及其特征在α螺旋中，多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，相邻的螺圈之间形成链内氢键，构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征：
① 二面角：Φ= -57°,Ψ= - 48°，是一种右手螺旋回忆 P143图3-52
② 每圈螺旋：3.6个a.a残基,高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm
④ 氨基酸残基侧链向外
⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上N-H氢与它后面（N端）第四个残基上的C=0氧间形成氢键。
图这种典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基，13表示氢键封闭的环包括13个原子。
2.27螺旋（n=1）
310 螺旋（n=2，Φ= -49°,Ψ= - 26°）
613螺旋（n=3）
4.316螺旋（n=4）
封闭环原子数3n+4（n=1、2、.....）
2.27 310 3.613 4.316
n=1 n=2 n=3 n=4
α-螺旋 π-螺旋
R侧链对α—螺旋的影响
R侧链的大小和带电性决定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的稳定性。
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，则由于静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而当这些残基分散存在时，不影响α—螺旋稳定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小，不易形成α—螺旋。丝心蛋白含50%Gly，不形成α—螺旋。
③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
pH对α—螺旋的影响多聚L-Glu和多聚L-Lys
P149 图3-57
右手α-螺旋与左手α-螺旋
图 P148
右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。
α-螺旋结构的旋光性由于α-螺旋结构是一种不对称的分子结构，因而具有旋光性，原因：（1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋，利用α—螺旋的旋光性，可测定蛋白质或多肽中α—螺旋的相对含量，也可用于研究影响α—螺旋与无规卷曲这两种构象之间互变的因素。
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
α-螺旋（包括其它二级结构）形成中的协同性一旦形成一圈α-螺旋后，随后逐个残基的加入就会变的更加容易而迅速。
β-折叠
P149 图3—58 P150 图3—59
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。β-折叠中所有的肽链都参于链间氢键的形成，氢键与肽链的长轴接近垂直。多肽主链呈锯齿状折叠构象，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同平行式：φ=-119° Ψ=+113°
反平行式：φ=-139° Ψ=+135°
从能量上看，反平β-折叠比平行的更稳定，前者的氢键NH---O几乎在一条直线上，此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β-折叠主要是反平行式，而在球状蛋白质中反平行和平行两种方式都存在。
在纤维状蛋白质的β-折叠中，氢键主要是在肽链之间形式，而在球状蛋白质中，β-折叠既可在不同肽链间形成，也可在同一肽链的不同部分间形成。
β-转角（β-turn）
β-转角也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend）、发夹结构（hair-pin structure）
β-转角是球状蛋白质分子中出现的180°回折，有人称之为发夹结构，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。
目前发现的β转角多数在球状蛋白质分子表面，β转角在球状蛋白质中含量十分丰富，占全部残基的1/4。
β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。
②主链骨架以180°返回折叠。
③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm
⑤多数由亲水氨基酸残基组成。
无规卷曲
没有规律的多肽链主链骨架构象。
球状蛋白中含量较高，对外界理化因子敏感，与生物活性有关。
α-螺旋，β-转角，β-折叠在拉氏图上有固定位置，而无规卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允许区域内。
超二级结构由若干个相邻的二级结构单元（α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。
αα结构（复绕α-螺旋）
由两股或三股右手α-螺旋彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离140A。
p153 图3-61 A
存在于α-角蛋白，肌球蛋白，原肌球蛋白和纤维蛋白原中。
βxβ结构两段平行式的β-链（或单股的β-折叠）通过一段连接链（x结构）连接而形成的超二级结构。
①βcβ
x为无规卷曲
p153 图3-61 B
②βαβ
x为α-螺旋，最常见的是βαβαβ，称Rossmann折叠，存在于苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶中。
p153 图3-61 C
β曲折（β-meander）
由三条（以上）相邻的反平行式的β-折叠链通过紧凑的β-转角连接而形成的超二级结构。
P153图3-61 D
回形拓扑结构（希腊钥匙）
P153图3-61 E
β-折叠桶由多条β-折叠股构成的β-折叠层，卷成一个筒状结构，筒上β折叠可以是平行的或反平行的，一般由5-15条β-折叠股组成。
超氧化物歧化酶的β-折叠筒由8条β-折叠股组成。筒中心由疏水氨基酸残基组成。
α-螺旋-β转角-α-螺旋两个α-螺旋通过一个β转角连接在一起。
λ噬菌体的λ阻遏蛋白含此结构。在蛋白质与DNA的相互作用中，此种结构占有极为重要的地位。
纤维状蛋白质纤维状蛋白质的氨基酸序列很有规律，它们形成比较单一的、有规律的二级结构，结果整个分子形成有规律的线形结构，呈现纤维状或细棒状，分子轴比（轴比：长轴/短轴）大于10，轴比小于10是的球状蛋白质。
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，占脊椎动物体内蛋白质总量的50%以上，起支架和保护作用。
角蛋白源于外胚层细胞，包括皮肤及皮肤的衍生物（发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、丝）可分为α-角蛋白和β角蛋白。
α-角蛋白
P155 图3-63，P156 图3-64
主要由α-螺旋结构组成，三股右手α-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤微结构稳定性由二硫键保证，α-角蛋白在湿热条件下可伸展转变成β-构象，烫发的化学机理Cys含量较高。
？(-角蛋白((-Keratin)中有两种类型的多肽链：I型和II型。每一个I型多肽型和一个II型多肽链形成一个卷曲螺旋二聚体(Coiled coil dimmer)。一对卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋结构称原纤维(Protofilament，4股右手(-螺旋)，原纤维的亚基间以氢键和二硫键相连。4个原纤维形成微纤维，成百根微纤维形成大纤维，每一个头发细胸，也将纤维(fiber)含有数个大纤维，一根头发就是由无数的死细胞相互间以角蛋白相连组成的。？
β-角蛋白
P157 图3-65
含大量的Gly、Ala、Ser，以β-折叠结构为主。
丝心蛋白取片层结构，即反平行式β-折叠片以平行的方式堆积成多层结构。链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。
胶原蛋白弹性蛋白肌球蛋白、肌动蛋白和微管蛋白球状蛋白质的高级结构与功能前面讲了蛋白质结构的两个较低级的组织水平：一级结构和二级结构（包括超二级结构），本节讲述蛋白质（主要是球蛋白）的高级结构：结构域、三级结构、四级结构，及其与生物功能。
蛋白质的一级结构决定高级结构蛋白质功能的复杂性和多样性是建立在结构多样性的基础上。
多肽链的二级结构由R基的短程顺序决定，当一组在肽链上相邻的氨基酸残基具有适当的顺序时，能自发形成α-螺旋和β-折叠，并处于稳定状态。
而多肽链的三级结构由氨基酸的长程顺序决定，如产生特异转弯的氨基酸残基（Pro、Thr、Ser）的精确位置决定多肽链转弯形成的方向和角度。
同源蛋白质的不变残基决定蛋白质的高级结构。
RNase的变性、复性实验，证明蛋白质的三维构象归根结底是复杂生物大分子的“自我装配”。
P164 图3-69 RNase的变性与复性示意图球状蛋白质的结构域、三级结构与功能结构域结构域(domain)，又称motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。结构域是球状蛋白的折叠单位，多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。
对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构往往是一个意思，就是说这些蛋白质是单结构域的。
结构域一般有１００－２００氨基酸残基，结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
每个结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是活性部位，也是反应物的出入口。一般情况下，酶的活性部位位于两个结构域的裂缝中。
EF手：钙结合蛋白中，含有Helix-Loop-Lelix结构锌指：DNA结合蛋白中，2个His、2个Cys结合一个Zn
亮氨酸拉链：DNA结合蛋白中，由亮氨酸倒链形成的拉链式结构，
图5.19
三级结构：
三级结构：整个多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上盘旋、折叠，形成的特定的整个空间结构。
或者说，三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。
三级结构有以下特点：
( 许多在一级结权上相差很远的aa碱基在三级结构上相距很近。
( 球形蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球形蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互用成为可能。
( 大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有几个结构域，结构域是一种密实的结构体，典型情况下常常含有特定的功能(如结合离子和小分子)
维持三级结构的作用力：
P164 图3-70
（1）氢键大多数蛋白质采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋、β-折叠），同时保持大部分能成氢键的侧链处于蛋白质分子表面，与水相互作用。
（2）范德华力（分子间及基团间作用力）
包括三种弱的作用力：
定向效应 极性基团间诱导效应 极性与非极性基团间分散效应 非极性基团间
（3）疏水相互作用蛋白质中的疏水残基避开水分子而聚集在分子内部的趋向力。它在维持蛋白质的三级结构方面占有突出的地位。
（4）离子键（盐键）
是正电贺和负电荷之间的一种静电作用。
生理pH下，Asp、Glu侧链解离成负离子，Ｌys、Arg、His离解成正离子。多数情况下，这些基团分布在球状蛋白质分子的表面，与水分子形成排列有序的水化层。偶尔有少数带相反电荷的测链在分子的疏水内部形成盐键。
（5）共价健，主要的是二硫键，
在二硫键形成之前，蛋白质分子已形成三级结构，二硫键不指导多肽链的折叠，三级结构形成后，二硫键可稳定此构象。
主要存在于体外蛋白中，在细胞内，由于有高浓度的还原性物质，所以没有二硫键。
6、静电相互作用最强的静电作用就是带相反电何的离子基因间的静电作用，又称盐桥。盐桥和较弱的静电相互作用(离子-偶级、偶级-偶级、范德华力)也是维持亚基间以及蛋白质与配体间的作用力。
球状蛋白蛋在行使功能时，通常与小的配体或大分子(如核酸，其它蛋白质)精密结合。球状蛋白的表面通常有一个凹穴其结构与配体互补，当配体结合上去后，引起球状蛋白的构象变化，触发后续反应。
肌红蛋白的三级结构与功能：
肌红蛋白的三级结构肌红蛋白是哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质，由一条多肽链和一个血红素辅基组成，分子量16.7Kd，含153个氨基酸。
P172 图3—76 图5.27 肌红蛋白的O2结合部位
多肽主链由8段直的α-螺旋组成，最长的α-螺旋有23个氨基酸残基，最短的α-螺旋有7个氨基酸残基。分子中几乎80%的氨基酸残基处在α-螺旋区内。连接两个相邻α-螺旋的是 松散肽段，由1~8个氨基酸组成。
8段螺旋分别命名为A、B、C…H。相邻的非螺旋区肽段为NA、AB、BC…GH、HC。
4个Pro残基各自处在一个拐弯处，Ser、Thr、Asn、Ile也处在拐弯处。
肌红蛋白多肽链绕曲成球状分子，球体内充满非极性氨基酸残基：Val、Leu、Met、Phe等，亲水的基团几乎全部分布在球状分子的外表面。整个分子单结构域。
辅基：血红素（铁卟啉），扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。
P173
卟啉环中心的Fe2+有六个配位键，其中4个与平面卟啉分子的N结合，另外两个与卟啉平面垂直，1个与93位His(F8)的咪唑N结合，另一个处于开放状态，可结合O2。
蛋白质为血红素提供一个疏水环境，避免Fe2+被氧化而失去氧合能力。
CO与血红素结合能力比O2的大200倍，CO中毒原理肌红蛋白的氧合曲线肌红蛋白：Mb 氧合肌红蛋白：MbO2。
解离平衡常数,
氧浓度与氧分压成正比
给定氧压下肌红蛋白氧饱和度
（4）式代入（3）式，
K= （1-Y）PO2
Y
以肌红蛋白的氧饱和度Y和氧分压PO2作图。
P174 图3-77 氧合曲线
当Y=1时，所有肌红蛋白的氧合位置均被占据，即肌红蛋白被氧饱和K=0
Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO2=K，解离常数K称为P50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。
Hill曲线和Hill系数
Y PO2 Log Y = Log PO2 — Log K
1-Y K 1-Y
P174 图3-78Hill曲线蛋白质四级结构与功能形成四级结构的亚基间必需构象互补和电荷（或极性）互补。
蛋白质的四级结构具有三级结构的亚单位，通过离子键、范德华力、氢键等聚集而成的特定构象寡聚蛋白由几条肽链组成。每一条肽键称为一个亚基（或单体）。亚基间的互补界面的是疏水性的。
有些对称的寡聚蛋白是由两个或多个不对称的等同结构成分组成，这种等同的结构成分称为原体。如血红蛋白α2β2就是由两个原体αβ组成。
维持四级结构的作用有：氢键、疏水作用、静电作用、共价健共价键也维持四级结构：( 免疫球蛋白的二硫键；( 弹性蛋白中的锁链素(由4个Lys侧链形成的交联体desmosine)；( Lysinonorleucine(赖氨硫正亮氨酸)，见于弹性蛋白和胶原蛋白。
球状蛋白聚集成四级结构具有下列优势
①结构更复杂，以便行使更复杂的功能。
②通过协同作用，实现对酶活性的调节。
③把中间代谢途径中各种酶分子聚体在一起，提高催化效率。
④形成一定的几何形状，细菌鞭毛。
⑤适当降低溶液渗透压。
寡聚蛋白与别构效应别构蛋白：多是寡聚蛋白，每个亚基除了有活性部位（结合抵牾）外，还有别构部位（结合调节物），有时活性部位和别构部位分属不同的亚基（活性亚基和调节亚基），活性部位之间以及活性部位和调节部位之间通过蛋白质构象的变化而相互作用。
别构效应：别构蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象，从而对活性部位的影响。
同位效应（同种效应）：别构蛋白与一种配基的的结合对于和后续同种配基结合能力的影响，包括（正）协同效应和负协同效应。同位效应一般是指活性部位之间的效应，也可能指别构部位之间的效应。同位效应是别构效应的基础，别构效应可以看成`是对同位效应的一种修饰异位效应（异种效应）：就是别构效应，别构部位与效应物的结合对活性部位的影响。
协同效应：一种配基的结合促进后续配基的结合，S型结合曲线。
负协同效应：一种配基的结合抑制促进后续配基的结合。
正效应物：促进活性部位与配基结合的别构效应物。
负效应物：抑制活性部位与配基结合的别构效应物。
血红蛋白的结构与功能血红蛋白的结构：
成人,HbA α2β2 98%
HbA2 α2δ2 2%
胎儿 HbF α2γ2
早期胚胎,α2ε2
α：141a.a,β、γ、δ：146a.a
α、β间大量的盐键，2.3—二磷酸甘油酸。
血红蛋白分子接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。
血红蛋白的α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似，但这三种多肽链的氨基酸顺序有较大不同，141个氨基酸残基中有20多个相同，似乎不同的a.a顺序也能形成非常相似的高级结构。
P129 图3-40 血红蛋白α、β链的氨基酸序列 P181 图3-86 β亚基的三级结构血红蛋白的氧合曲线（与肌红蛋白比较）
血红蛋白由4个亚基组成，每个亚基都与肌红蛋白类似，含有一个血红素，都能结合一分子O2,四个亚基之间具有协同效应，第一个配基的结合能提高其它亚基对O2的亲和力。因此，它的氧合曲线是S型曲线
P185图3—93、3—93
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气，。
PO2 n
血红蛋白P50=26 torr，n=2.8，Y= K+ PO2 n
肺泡氧压：Po2 =100 torr 肌肉毛细血管：Po2 =20 torr
在肺泡中,Y=0.97
在毛细血管中 Y=0.25
释放氧 △Y=0.97—0.25=0.72
若无协同效应，血红蛋白的氧合曲线与肌红蛋白的相同，当Po2从 100→20 torr时，△Y不足0.1。
波耳效应及其生理意义血红蛋白上有CO2和DPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2 。
波耳效应：增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+ 和CO2 。
P187 图3-95 pH对血红蛋白氧合的影响
DPG的别构效应血红蛋白是一个别构蛋白，DPG是它的效应物。DPG（二磷酸甘油酸）通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。
P189 图3-96 DPG对血红蛋白氧合曲线的影响
无DPG时，P50=1 torr,DPG=4.5mM时，P50=26 torr
DPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有DPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，DPG能降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。
（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；DPG升高。
（2）血库储血时加入肌苷可防止DPG的降解。
协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率免疫球蛋白的结构与功能免疫球蛋白是糖蛋白，它是脊椎动物体内合成的抗体。
抗原与抗体抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。
抗原性包括免疫原性和抗原特异性。
免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。
抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。
抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。
抗原决定簇的作用：
①被免疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。
②与相应抗体的Fab结合。
抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。
抗体具有两个特点：
①高度特异性
②多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。
抗原抗体反应抗体是2价的，抗原是多价的。
抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。
抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原—抗体复合物，不可溶。
抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。
图
抗原抗体反应的条件：
①抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。
②二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子键、氢键
等）
免疫球蛋白的一级结构
P193 图3-99
蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。
在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。
P197 表3-16
天然球状蛋白质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。
等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）
等电点：
P198表3-17 3-18
蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。
等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。
在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
蛋白质的电泳分离聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
SDS-PAGE（荷质比相同，分子量不同）
离子交换层析分离蛋白质与氨基酸分离原理相似蛋白质的大小与形状测分子量的方法：
化学组成法凝胶过滤法
SDS-PAGE法胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）
透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。
蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。
稳定蛋白质胶体溶液的主要因素
①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。
②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。
一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶液中析出沉淀。
沉淀蛋白质的方法
①盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。
②有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数
③重金属盐沉淀
pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+,Pb2+,Cu2+ 等）结成不溶性沉淀
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法
pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。
生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。
酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。
⑤加热变性沉淀。
往往是不可逆的。
蛋白质的变性变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其它理化常数改变。
（1）变性的因素：
( 强酸和强碱；( 有机溶剂，破坏疏水作用；( 去污剂、去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用；( 还原性试剂：尿素、(-硫基乙醇；( 盐浓度、盐析、盐溶；( 重金属离子，Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。( 温度；( 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。
（2）变性的实质：
次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不汲及一级结构的破坏。
（3）蛋白质变性后，往往出现下列现象：
①结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
②硫水侧链基团外露。
③理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。
④生理化学性质改变。分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。
实际应用：
A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。
B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
（4）变性机理
①热变性（往往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。
②酸碱变性：破坏了盐链。
③有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。
（5）可逆变性与不可逆变性有人认为：二级、三级或四级结构遭受被破坏即为变性，三级（或四级）结构被破坏时引起可逆变性，而二级及三级（或四级）结构一并遭破坏时引起不可逆变性。
分离纯化蛋白质的主要方法实质：①蛋白与非蛋白分开，②蛋白质之间分开原理：
1,溶解度差异
PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法
2,热稳定性差异热处理沉淀法铜锌SOD（65℃、15分钟、稳定）
3,电荷性质差异离子交换层析法电泳法
4,分子大小和形状差异凝胶过滤、超滤法透析法、离心法
5,亲和力的差异亲和层析法某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。
配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。
分离原理：
P224 图3-124
蛋白质毒素一些致病生物产生的毒素中有很多是蛋白质。毒性机理有：( 破坏细胞膜；( 干扰细胞内机能；( 抑制神经细胞突触的功能。
直接作用于细胞膜的毒素称溶细胞毒素，可以由细菌、真菌、植物、鱼、蛇等产生。链球菌属(Streptoccus)Pyogene产生的链球菌溶血素(包括0.5等)，能使精细胞产生孔洞，Na+等离子外渗，细胞死亡。链球菌溶血素O是产生风湿热的原因之一(rheiematie fever)。此外，一些有毒的酶点，如蛇的磷酯酶在A2也能破坏细胞膜。
破坏细胞内机能的毒素也很多，如白候杆菌(Corynebacteriadiphtheriae)产生的白候毒素(diphtheria toxin)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)产生的霍乱毒素(cholera toxin)。它们均由A、B两个亚基组成，B亚基与靶细胞结合，A亚基致毒。白候毒素分子一旦进入靶细胞，AB亚在就分开，A亚基是一种酶能阻止蛋白质的合成，寄主的心、肾和神经组织都会被破坏。
霍乱毒素的B亚基由5个相同亚基组成，B亚基与肠细胞膜结合，A亚基就被送入这些细胞中，A亚基激活一种酶使cAMP大量产生，cAMP打开细胞膜的CL通道，由于CL-外泄引起渗适压的改变，水分也大量丧失，结果导致腹泻(diarrhoea)，不加治疗的话，严重的脱水可使病人48小时内死亡。
神经突触连接两个神经元或一个神经元与一个肌肉细胞。一种毒蜕的产生的毒素(-Latrotoxin(125KD)是一条多肽链，能剌激神经递质乙酰胆碱(acetylcholine,ACH)的广谱性释放酶。肉毒杆菌(Lostrldium botulinum)产生的肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)能抑制Ach释放酶肉毒中毒(botulism)为是由于受了被污染的罐袋食物引起的。
