1
第九章 细胞增殖及其调控( 2学时)
● 细胞增殖 (cell proliferation)的意义
● 细胞周期与细胞分裂
● 细胞周期调控
2
第一节 细胞增殖的意义
细胞增殖 (cell proliferation)是细胞生命活动的重要特
征之一,是生物繁育的基础。
单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。
多细胞生物由一个单细胞 (受精卵 )分裂发育而来,细胞
增殖是多细胞生物繁殖基础。
成体生物仍然需要细胞增殖,主要取代衰老死亡的细胞,
维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。
机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等,都要依赖
细胞增殖 。
3
第二节 细胞周期与细胞分裂
细胞周期 (cell cycle)概述
有丝分裂 (mitosis)
胞质分裂 (Cytokinesis)
减数分裂 (Meiosis)
4
一、细胞周期 (cell cycle)概述
细胞周期
细胞周期中各个不同时相及其主要事件
细胞周期长短测定
细胞周期同步化
5
二、有丝分裂 (mitosis)
● 前期 (prophase)
● 前中期 (prometaphase)
● 中期 (metaphase)
● 后期 (anaphase)
● 末期 (telophase)
6
三、胞质分裂 (Cytokinesis)
动物细胞胞质分裂
胞质分裂 (cytokinesis)开始于细胞分裂后期,在赤道板
周围细胞表面下陷,形成环形缢缩,称为 分裂沟
(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓
度升高的变化有关。
胞质分裂开始时,大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组
装成微丝并相互组成微丝束,环绕细胞,称为 收缩环
( contractile ring)。收缩环收缩、收缩环处细胞膜融
合并形成两个子细胞。
7
四、减数分裂 (Meiosis)
减数分裂概念与过程:
概念:减数分裂是细胞仅进行一次 DNA复制,随后进行两次分裂,染色体数目减
半的一种特殊的有丝分裂
减数分裂 过程
减数分裂的意义
确保世代间遗传的稳定性;
增加变异机会,确保生物的多样性,增强生物适应环境变化的能力。
减数分裂是生物有性生殖的基础,是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要
基础保证。
减数分裂特点
遗传物质只复制一次,细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半。
前期 I分为细线期,偶线期,粗线期,双线期,终变期等 五个阶段 ; S期持续时
间较长 。
同源染色体在减数分裂期 I(MeiosisI)配对联会,形成 联会复合体
(Synaptonemal Complex,SC),同源染色体间遗传物质重组,产生新的基因组合 。
减数分裂同源染色体配对 排列在中期板 上,第一次分列时,同源染色体分
开。
脊椎动物配子发生过程
8
细胞周期
细胞增殖是通过细胞周期( cell cycle)来实现的,而细胞周
期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。
细胞无限制增长对个体来说意味着癌症,个体无限制繁殖对
地球来说意味着灾难。一个大肠杆菌若按 20分钟分裂一次,
并保持这一速度,则两天即可超过地球的重量。
概念,细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的
一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞 。
细胞周期时相组成
细胞周期时间
根据增殖状况,细胞分类三类
9
细胞周期时相组成
间期 (interphase),G1 phase,S phase,G2 phase
M phase,有丝分裂期 (Mitosis),胞质分裂期 (Cytokinesis)
细胞沿着 G1→S→G2→M→G1 周期性运转,在间期细胞体积增大 (生
长 ),在 M 期细胞先是核分裂,接着胞质分裂,完成一个 细胞周期
细胞周期时间
不同细胞的细胞 周期时间差异 很大
S+G2+M 的时间变化教小,细胞周期时间长短主要差别在
G1期
有些分裂增殖的细胞缺乏 G1,G2期
10
根据增殖状况,细胞分类三类
连续分裂细胞 (cycling cell)
在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞,如表皮生发
层细胞、部分骨髓细胞
休眠细胞 (Go细胞 )
休眠细胞暂不分裂,但在适当的刺激下可重新进入细胞周
期,称 G0期细胞,如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
终末分化细胞
是指那些不可逆地脱离细胞周期,丧失分裂能力,保持生
理机能活动的细胞,如神经细胞,肌肉细胞等。
G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分,有的细胞过
去认为属于终末分化细胞,目前可能被认为是 G0期细胞。
11
细胞周期中不同时相及其主要事件
G1期
与 DNA合成启动相关,开始合成细胞生长所需要的多种蛋
白质,RNA、碳水化合物、脂等,同时染色质去凝集。
S 期
DNA复制与组蛋白合成同步,组成核小体串珠结构
S期 DNA合成不同步
G2期
DNA复制完成,在 G2期合成一定数量的蛋白质和 RNA分子
M 期
M期即细胞分裂期,真核细胞的细胞分裂主要包括两种方
式,即有丝分裂 (mitosis)和减数分裂 (meiosis)。遗传物
质和细胞内其他物质分配给子细胞。
12
细胞周期长短测定
脉冲标记 DNA复制和细胞分裂指数观察测定法
对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影
技术显示标记细胞,通过统计标记有丝分裂细胞百分数
的办法来测定细胞周期。
流式细胞仪测定法 (Flow Cytometry)
缩时摄像技术,可以得到准确的细胞周期时间及分
裂间期和分裂期的准确时间。
13
细胞周期同步化
细胞同步化 (synchronization)是指在自然过程中发生
或经人为处理造成的细胞周期同步化,前者称自然同步
化,后者称为人工同步化。
1.自然同步化:
一种粘菌的变形体 plasmodia:如粘菌只进行核分
裂,而不发生胞质分裂,形成多核体。数量众多的核
处于同一细胞质中,进行同步化分裂,使细胞核达 108,
体积达 5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。
2.人工选择同步化
3.药物诱导法
14
人工选择同步化
有丝分裂选择法:
有丝分裂选择法:使单层培养的细胞处于对数增殖期,此
时分裂活跃,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起,与培养皿的
附着性低,此时轻轻振荡,M期细胞脱离器壁,悬浮于培
养液中,收集培养液,再加入新鲜培养液,依法继续收集,
则可获得一定数量的中期细胞。其优点是,操作简单,同
步化程度高,细胞不受药物伤害,缺点是获得的细胞数量
较少。
密度梯度离心法:
不同时期的细胞体积不同,而细胞在给定离心场中沉降的
速度与其半径的平方成正比,因此可用离心的方法分离。
其优点是可用于任何悬浮培养的细胞,缺点是同步化程度
较低。
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药物诱导法
DNA合成阻断法
选用 DNA合成的抑制剂,可逆地抑制 DNA合成,而不影响
其他时期细胞的运转,最终可将细胞群阻断在 S期或 G/S交
界处。 5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、
高浓度 ADR,GDR和 TDR,均可抑制 DNA合成使细胞同
步化。优点是同步化程度高,适用于任何培养体系。可将
几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长,个别细
胞体积增大。
分裂中期阻断法
通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成,将细胞阻断
在细胞分裂中期。优点是操作简便,效率高。缺点是这些
药物的毒性相对较大。
16
前期 (prophase)
标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩 (condensation)
形成有丝分裂染色体 (mitotic chromosome)(这种染色体由
两条染色单体 (chromatid)构成)。
第二个特征细胞骨架解聚,有丝分裂纺锤体 (mitotic spindle)
开始装配。
间期动物细胞含一个 MTOC,即中心体,在 S期末,两个中心
粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒,形成两个中心体。
当前期开始时,2个中心体移向细胞两极,并同时组织微管
生长,由两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相
连,最后形成 有丝分裂纺锤体 。
Golgi体,ER等细胞器解体,形成小的膜泡。
在前期末,染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为 动粒
(kinetochore)。
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前中期 (prometaphase)
核膜破裂成小的膜泡,这一过程是由核纤层蛋白中特异的 Ser
残基磷酸化导致 核纤层解体 。
纺锤体微管与染色体的动粒结合,捕捉住染色体每个已复制
的染色体有两个动粒,朝相反方向,保证与两极的微管结合;
纺锤体微管捕捉住染色体后,形成 三种类型的微管 (着丝点微
管 kinetochore mt,星体微管 astral mt,极体微管 polar mt或
overlap mt)。
不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中期逐
渐向中期运转。
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中期 (metaphase)
所有染色体排列到赤道板 (Metaphase Plate)上,标志着细胞
分裂已进入中期
是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上?
着丝粒微管动态平衡形成的张力
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后期 (anaphase)
排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生
向极运动。
后期 (anaphase)大致可以划分为连续的两个阶段,
即后期 A和后期 B。
后期 A,动粒微管去装配变短,染色体产生两极运动。
后期 B,极间微管长度增加,两极之间的距离逐渐拉长,
介导染色体向极运动。
20
末期 (telophase)
染色单体到达两极,即进入了末期( telophase),
到达两极的染色单体开始去浓缩。
核膜开始重新组装。
Golgi体和 ER重新形成并生长。
核仁也开始重新组装,RNA合成功能逐渐恢复,有丝
分裂结束。
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减 数 分 裂 前 S 期 有 丝 分 裂 前 S 期
蝾螈 10 天 12 小时
小鼠 14 小时 5 ~ 6 小时
小麦 12 小时 3.8 小时
酵母 1.0 小时 0.5 小时
减数分裂前 S期与有丝分裂前 S期长度比较
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第三节 细胞周期的调控 (Cell-Cycle Control)
一,细胞周期研究背景
二,细胞周期蛋白依赖性激酶( CDK)
三,周期蛋白( Cyclin)
四,细胞周期检验点 (Cell Cycle Checkpoint)
五,MPF
六,细胞周期运转的负调控
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Rao和 Johnson(1970,1972,1974)将 Hela细胞同步于不同阶段,然后与 M期细胞混
合,在灭活仙台病毒介导下,诱导细胞融合,发现与 M期细胞融合的间期细胞产生了
形态各异的 早熟凝集染色体 (prematurely condensed chromosome,PCC)。
不同类的 M期细胞也可以诱导 PCC产生,如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果,
这就意味着 M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子,即 成熟促进因子
(maturation promoting factor,MPF)。
1960s,Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂 (GVBD),后
来 Sunkara将 不同时期 Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中,发现 G1和 S期的抽取物
不能诱导 GVBD,而 G2和 M期的则具有促进胚胞破裂的功能,它将这种诱导物质称为
有丝分裂因子 (MF)。
1960s Leland Hartwell以芽殖酵母为实验材料,利用阻断在不同细胞周期阶段的温度
敏感突变株,分离出了几十个与 细胞分裂有关的基因 (cell division cycle gene,
CDC)。
Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性,提出了 checkpoint(细胞周期检
验点) 的概念,意指当 DNA受到损伤时,细胞周期会停下来。
1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母(图 13-17)为实验材料,同样发现了许多细胞周期
调控基因。
1983年 Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后,在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细
胞周期剧烈振荡,在每一轮间期开始合成,G2/M时达到高峰,M结束后突然消失,下
轮间期又重新合成,故命名为 周期蛋白 (cyclin)。
一、细胞周期研究背景
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1988年 M,J,Lohka 纯化了爪蟾的 MPF,经鉴定由 32KD和 45KD两种蛋
白组成,二者结合可使多种蛋白质磷酸化(图 13-19)。后来 Paul Nurse
( 1990)进一步的实验证明 P32实际上是 CDC2的同源物,而 P45是
cyclinB的同源物,从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。 2001年
10月 8日美国人 Leland Hartwell、英国人 Paul Nurse,Timothy Hunt因对
细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。
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二、细胞周期蛋白依赖性激酶( CDK)
CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性,称为 细胞
周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase,CDK),
因此 CDC2又被称为 CDK1,激活的 CDK1可将靶蛋白磷酸化
而产生相应的生理效应,如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层
解体、核膜消失,将 H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些
效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此, CDK激酶和
其调节因子又被称作 细胞周期引擎 。
目前发现的 CDK在动物中有 7种。各种 CDK分子均含有一
段相似的激酶结构域,这一区域有一段保守序列,与周期蛋
白的结合有关。
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三、周期蛋白( Cyclin)
周期蛋白不仅仅起激活 CDK的作用,还决定了 CDK何时、何处、将何种
底物磷酸化,从而推动细胞周期的前进。目前从芽殖酵母、裂殖酵母和
各类动物中分离出的周期蛋白有 30余种,在脊椎动物中为 A1-2,B1-3, C、
D1-3,E1-2,F,G,H等。分为 G1型,G1/S型 S型和 M型 4类。
细胞在生长因子的刺激下,G1期 cyclin D表达,并与 CDK4,CDK6结合,
使下游的蛋白质如 Rb磷酸化,磷酸化的 Rb释放出转录因子 E2F,促进许
多基因的转录,如编码 cyclinE,A和 CDK1的基因。
在 G1-S期,cyclinE与 CDK2结合,促进细胞通过 G1/S限制点而进入 S期。
向细胞内注射 CyclinE的抗体能使细胞停滞于 G1期,说明细胞进入 S期需
要 CyclinE的参与。同样将 CyclinA的抗体注射到细胞内,发现能抑制细
胞的 DNA合成,推测 CyclinA是 DNA复制所必需的。
在 G2-M期,cyclinA,cyclinB与 CDK1结合,CDK1使底物蛋白磷酸化、
如将组蛋白 H1磷酸化导致染色体凝缩,核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等
下游细胞周期事件。
中期当 MPF活性达到最高时,通过一种未知的途径,激活后期促进因子
APC,将泛素连接在 cyclinB上,导致 cyclinB被蛋白酶体( proteasome)
降解,完成一个细胞周期。
27
四、细胞周期检验点 (checkpoint)
细胞要分裂,必须正确复制 DNA和达到一定的体积,在获得足够物质支持
分裂以前,细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行,是在一系列称为 检验点
( check point) 的严格检控下进行的。
主要检验点 包括:
G1/S检验点,在酵母中称 start点,在哺乳动物中称 R点 (restriction point),
控制细胞由静止状态的 G1进入 DNA合成期,相关的事件包括,DNA是否
损伤?细胞外环境是否适宜?细胞体积是否足够大?
S期检验点,DNA复制是否完成?
G2/M检验点,是决定细胞一分为二的控制点,相关的事件包括,DNA是
否损伤?细胞体积是否足够大?
中 -后期检验点(纺锤体组装检验点),任何一个着丝点没有正确连接到
纺锤体上,都会抑制 APC的活性,引起细胞周期中断。
细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制,主要是确保周期每一时相事件
的有序、全部完成并与外界环境因素相联系
28
五,MPF (Maturation-promoting factor,Mitosis-
promoting factor)
MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶;由 M期 Cyclin-
Cdk(Cyclin-dependent protein kinase) 形成的 复合物 。
MPF=CDK1=p34cdc2+cyclinB
Mitotic Cyclin-Cdk复合物的活化与功能
活化
? 随 Cyclin浓度变化而变化
? 激酶与磷酸酶的调节
? 活化的 MPF可使更多的 MPF活化
功能,启动细胞从 G2期进入 M期的相关事件
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六、细胞周期运转的负调控
细胞至少可通过两种不同机制阻遏细胞周期的运转:
Cdk抑制蛋白 (CDI)阻止 Cyclin-Cdk复合物的装配或活性;
CDI包括 CIP/KIP家族和 INK4家族,其作用是抑制 Cyclin-
Cdk复合物的装配或活性,而将细胞阻止在不同的检验点。
如 DNA受损后,细胞将 停留于 G1 Checkpoint 让 DNA修复
或者凋亡 。
周期调控系统组分停止合成,如 G0细胞,大部分 Cyclin和
Cdk都消失,这在多细胞生物尤其明显。
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31
32
Experimental demonstration of the coordinated
Synthesis of DNA and hitones.
33
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35
36
前期两个中心体向两极移动(图片来自
http://www.wadsworth.org/)
37
38
.
MT behavior during formation
of the metaphase plate,
Initially,MT from opposite
poles are different in length.
Experimental demonstration
of the importance of mecha-
nical tension in metaphase
checkpoint control.
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40
41
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43
a,Electron micrograph of SC of human pachytene bivalent.
(K,kinetochore; arrow,recombination nodules);
b,Schematic diagram of SC;
c,Electron micrograph of SC after treatment with DNase to remove chromasomal fibers.
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45
Visible evidence of crossing over
46
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48
人 M期细胞与袋鼠( Ptk) G1,S,G2期细胞融合诱导 PCC:提示 M期细胞存在诱导 PCC
的因子;
49
注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中,含有卵母细胞成熟的因子,
称做 MPF。
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CDK1的调节与活化 ; CAK=CDK1-Activiting Kinase
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Cyclin B的降解途径
第九章 细胞增殖及其调控( 2学时)
● 细胞增殖 (cell proliferation)的意义
● 细胞周期与细胞分裂
● 细胞周期调控
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第一节 细胞增殖的意义
细胞增殖 (cell proliferation)是细胞生命活动的重要特
征之一,是生物繁育的基础。
单细胞生物细胞增殖导致生物个体数量的增加。
多细胞生物由一个单细胞 (受精卵 )分裂发育而来,细胞
增殖是多细胞生物繁殖基础。
成体生物仍然需要细胞增殖,主要取代衰老死亡的细胞,
维持个体细胞数量的相对平衡和机体的正常功能。
机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复等,都要依赖
细胞增殖 。
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第二节 细胞周期与细胞分裂
细胞周期 (cell cycle)概述
有丝分裂 (mitosis)
胞质分裂 (Cytokinesis)
减数分裂 (Meiosis)
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一、细胞周期 (cell cycle)概述
细胞周期
细胞周期中各个不同时相及其主要事件
细胞周期长短测定
细胞周期同步化
5
二、有丝分裂 (mitosis)
● 前期 (prophase)
● 前中期 (prometaphase)
● 中期 (metaphase)
● 后期 (anaphase)
● 末期 (telophase)
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三、胞质分裂 (Cytokinesis)
动物细胞胞质分裂
胞质分裂 (cytokinesis)开始于细胞分裂后期,在赤道板
周围细胞表面下陷,形成环形缢缩,称为 分裂沟
(furrow)。分裂沟的位置与纺锤体极性微管和钙离子浓
度升高的变化有关。
胞质分裂开始时,大量肌动蛋白和肌球蛋白在中体处组
装成微丝并相互组成微丝束,环绕细胞,称为 收缩环
( contractile ring)。收缩环收缩、收缩环处细胞膜融
合并形成两个子细胞。
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四、减数分裂 (Meiosis)
减数分裂概念与过程:
概念:减数分裂是细胞仅进行一次 DNA复制,随后进行两次分裂,染色体数目减
半的一种特殊的有丝分裂
减数分裂 过程
减数分裂的意义
确保世代间遗传的稳定性;
增加变异机会,确保生物的多样性,增强生物适应环境变化的能力。
减数分裂是生物有性生殖的基础,是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要
基础保证。
减数分裂特点
遗传物质只复制一次,细胞连续分裂两次,导致染色体数目减半。
前期 I分为细线期,偶线期,粗线期,双线期,终变期等 五个阶段 ; S期持续时
间较长 。
同源染色体在减数分裂期 I(MeiosisI)配对联会,形成 联会复合体
(Synaptonemal Complex,SC),同源染色体间遗传物质重组,产生新的基因组合 。
减数分裂同源染色体配对 排列在中期板 上,第一次分列时,同源染色体分
开。
脊椎动物配子发生过程
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细胞周期
细胞增殖是通过细胞周期( cell cycle)来实现的,而细胞周
期的有序运行是通过相关基因的严格监视和调控来保证的。
细胞无限制增长对个体来说意味着癌症,个体无限制繁殖对
地球来说意味着灾难。一个大肠杆菌若按 20分钟分裂一次,
并保持这一速度,则两天即可超过地球的重量。
概念,细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的
一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞 。
细胞周期时相组成
细胞周期时间
根据增殖状况,细胞分类三类
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细胞周期时相组成
间期 (interphase),G1 phase,S phase,G2 phase
M phase,有丝分裂期 (Mitosis),胞质分裂期 (Cytokinesis)
细胞沿着 G1→S→G2→M→G1 周期性运转,在间期细胞体积增大 (生
长 ),在 M 期细胞先是核分裂,接着胞质分裂,完成一个 细胞周期
细胞周期时间
不同细胞的细胞 周期时间差异 很大
S+G2+M 的时间变化教小,细胞周期时间长短主要差别在
G1期
有些分裂增殖的细胞缺乏 G1,G2期
10
根据增殖状况,细胞分类三类
连续分裂细胞 (cycling cell)
在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞,如表皮生发
层细胞、部分骨髓细胞
休眠细胞 (Go细胞 )
休眠细胞暂不分裂,但在适当的刺激下可重新进入细胞周
期,称 G0期细胞,如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
终末分化细胞
是指那些不可逆地脱离细胞周期,丧失分裂能力,保持生
理机能活动的细胞,如神经细胞,肌肉细胞等。
G0期细胞和终末分化细胞的界限有时难以划分,有的细胞过
去认为属于终末分化细胞,目前可能被认为是 G0期细胞。
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细胞周期中不同时相及其主要事件
G1期
与 DNA合成启动相关,开始合成细胞生长所需要的多种蛋
白质,RNA、碳水化合物、脂等,同时染色质去凝集。
S 期
DNA复制与组蛋白合成同步,组成核小体串珠结构
S期 DNA合成不同步
G2期
DNA复制完成,在 G2期合成一定数量的蛋白质和 RNA分子
M 期
M期即细胞分裂期,真核细胞的细胞分裂主要包括两种方
式,即有丝分裂 (mitosis)和减数分裂 (meiosis)。遗传物
质和细胞内其他物质分配给子细胞。
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细胞周期长短测定
脉冲标记 DNA复制和细胞分裂指数观察测定法
对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影
技术显示标记细胞,通过统计标记有丝分裂细胞百分数
的办法来测定细胞周期。
流式细胞仪测定法 (Flow Cytometry)
缩时摄像技术,可以得到准确的细胞周期时间及分
裂间期和分裂期的准确时间。
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细胞周期同步化
细胞同步化 (synchronization)是指在自然过程中发生
或经人为处理造成的细胞周期同步化,前者称自然同步
化,后者称为人工同步化。
1.自然同步化:
一种粘菌的变形体 plasmodia:如粘菌只进行核分
裂,而不发生胞质分裂,形成多核体。数量众多的核
处于同一细胞质中,进行同步化分裂,使细胞核达 108,
体积达 5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。
2.人工选择同步化
3.药物诱导法
14
人工选择同步化
有丝分裂选择法:
有丝分裂选择法:使单层培养的细胞处于对数增殖期,此
时分裂活跃,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起,与培养皿的
附着性低,此时轻轻振荡,M期细胞脱离器壁,悬浮于培
养液中,收集培养液,再加入新鲜培养液,依法继续收集,
则可获得一定数量的中期细胞。其优点是,操作简单,同
步化程度高,细胞不受药物伤害,缺点是获得的细胞数量
较少。
密度梯度离心法:
不同时期的细胞体积不同,而细胞在给定离心场中沉降的
速度与其半径的平方成正比,因此可用离心的方法分离。
其优点是可用于任何悬浮培养的细胞,缺点是同步化程度
较低。
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药物诱导法
DNA合成阻断法
选用 DNA合成的抑制剂,可逆地抑制 DNA合成,而不影响
其他时期细胞的运转,最终可将细胞群阻断在 S期或 G/S交
界处。 5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、
高浓度 ADR,GDR和 TDR,均可抑制 DNA合成使细胞同
步化。优点是同步化程度高,适用于任何培养体系。可将
几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长,个别细
胞体积增大。
分裂中期阻断法
通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成,将细胞阻断
在细胞分裂中期。优点是操作简便,效率高。缺点是这些
药物的毒性相对较大。
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前期 (prophase)
标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩 (condensation)
形成有丝分裂染色体 (mitotic chromosome)(这种染色体由
两条染色单体 (chromatid)构成)。
第二个特征细胞骨架解聚,有丝分裂纺锤体 (mitotic spindle)
开始装配。
间期动物细胞含一个 MTOC,即中心体,在 S期末,两个中心
粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒,形成两个中心体。
当前期开始时,2个中心体移向细胞两极,并同时组织微管
生长,由两极形成的微管通过微管结合蛋白在正极末端相
连,最后形成 有丝分裂纺锤体 。
Golgi体,ER等细胞器解体,形成小的膜泡。
在前期末,染色体主缢痕部位形成一种蛋白复合物称为 动粒
(kinetochore)。
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前中期 (prometaphase)
核膜破裂成小的膜泡,这一过程是由核纤层蛋白中特异的 Ser
残基磷酸化导致 核纤层解体 。
纺锤体微管与染色体的动粒结合,捕捉住染色体每个已复制
的染色体有两个动粒,朝相反方向,保证与两极的微管结合;
纺锤体微管捕捉住染色体后,形成 三种类型的微管 (着丝点微
管 kinetochore mt,星体微管 astral mt,极体微管 polar mt或
overlap mt)。
不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中期逐
渐向中期运转。
18
中期 (metaphase)
所有染色体排列到赤道板 (Metaphase Plate)上,标志着细胞
分裂已进入中期
是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上?
着丝粒微管动态平衡形成的张力
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后期 (anaphase)
排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离产生
向极运动。
后期 (anaphase)大致可以划分为连续的两个阶段,
即后期 A和后期 B。
后期 A,动粒微管去装配变短,染色体产生两极运动。
后期 B,极间微管长度增加,两极之间的距离逐渐拉长,
介导染色体向极运动。
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末期 (telophase)
染色单体到达两极,即进入了末期( telophase),
到达两极的染色单体开始去浓缩。
核膜开始重新组装。
Golgi体和 ER重新形成并生长。
核仁也开始重新组装,RNA合成功能逐渐恢复,有丝
分裂结束。
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减 数 分 裂 前 S 期 有 丝 分 裂 前 S 期
蝾螈 10 天 12 小时
小鼠 14 小时 5 ~ 6 小时
小麦 12 小时 3.8 小时
酵母 1.0 小时 0.5 小时
减数分裂前 S期与有丝分裂前 S期长度比较
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第三节 细胞周期的调控 (Cell-Cycle Control)
一,细胞周期研究背景
二,细胞周期蛋白依赖性激酶( CDK)
三,周期蛋白( Cyclin)
四,细胞周期检验点 (Cell Cycle Checkpoint)
五,MPF
六,细胞周期运转的负调控
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Rao和 Johnson(1970,1972,1974)将 Hela细胞同步于不同阶段,然后与 M期细胞混
合,在灭活仙台病毒介导下,诱导细胞融合,发现与 M期细胞融合的间期细胞产生了
形态各异的 早熟凝集染色体 (prematurely condensed chromosome,PCC)。
不同类的 M期细胞也可以诱导 PCC产生,如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果,
这就意味着 M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子,即 成熟促进因子
(maturation promoting factor,MPF)。
1960s,Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂 (GVBD),后
来 Sunkara将 不同时期 Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中,发现 G1和 S期的抽取物
不能诱导 GVBD,而 G2和 M期的则具有促进胚胞破裂的功能,它将这种诱导物质称为
有丝分裂因子 (MF)。
1960s Leland Hartwell以芽殖酵母为实验材料,利用阻断在不同细胞周期阶段的温度
敏感突变株,分离出了几十个与 细胞分裂有关的基因 (cell division cycle gene,
CDC)。
Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性,提出了 checkpoint(细胞周期检
验点) 的概念,意指当 DNA受到损伤时,细胞周期会停下来。
1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母(图 13-17)为实验材料,同样发现了许多细胞周期
调控基因。
1983年 Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后,在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细
胞周期剧烈振荡,在每一轮间期开始合成,G2/M时达到高峰,M结束后突然消失,下
轮间期又重新合成,故命名为 周期蛋白 (cyclin)。
一、细胞周期研究背景
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1988年 M,J,Lohka 纯化了爪蟾的 MPF,经鉴定由 32KD和 45KD两种蛋
白组成,二者结合可使多种蛋白质磷酸化(图 13-19)。后来 Paul Nurse
( 1990)进一步的实验证明 P32实际上是 CDC2的同源物,而 P45是
cyclinB的同源物,从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。 2001年
10月 8日美国人 Leland Hartwell、英国人 Paul Nurse,Timothy Hunt因对
细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖。
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二、细胞周期蛋白依赖性激酶( CDK)
CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性,称为 细胞
周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinase,CDK),
因此 CDC2又被称为 CDK1,激活的 CDK1可将靶蛋白磷酸化
而产生相应的生理效应,如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层
解体、核膜消失,将 H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些
效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此, CDK激酶和
其调节因子又被称作 细胞周期引擎 。
目前发现的 CDK在动物中有 7种。各种 CDK分子均含有一
段相似的激酶结构域,这一区域有一段保守序列,与周期蛋
白的结合有关。
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三、周期蛋白( Cyclin)
周期蛋白不仅仅起激活 CDK的作用,还决定了 CDK何时、何处、将何种
底物磷酸化,从而推动细胞周期的前进。目前从芽殖酵母、裂殖酵母和
各类动物中分离出的周期蛋白有 30余种,在脊椎动物中为 A1-2,B1-3, C、
D1-3,E1-2,F,G,H等。分为 G1型,G1/S型 S型和 M型 4类。
细胞在生长因子的刺激下,G1期 cyclin D表达,并与 CDK4,CDK6结合,
使下游的蛋白质如 Rb磷酸化,磷酸化的 Rb释放出转录因子 E2F,促进许
多基因的转录,如编码 cyclinE,A和 CDK1的基因。
在 G1-S期,cyclinE与 CDK2结合,促进细胞通过 G1/S限制点而进入 S期。
向细胞内注射 CyclinE的抗体能使细胞停滞于 G1期,说明细胞进入 S期需
要 CyclinE的参与。同样将 CyclinA的抗体注射到细胞内,发现能抑制细
胞的 DNA合成,推测 CyclinA是 DNA复制所必需的。
在 G2-M期,cyclinA,cyclinB与 CDK1结合,CDK1使底物蛋白磷酸化、
如将组蛋白 H1磷酸化导致染色体凝缩,核纤层蛋白磷酸化使核膜解体等
下游细胞周期事件。
中期当 MPF活性达到最高时,通过一种未知的途径,激活后期促进因子
APC,将泛素连接在 cyclinB上,导致 cyclinB被蛋白酶体( proteasome)
降解,完成一个细胞周期。
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四、细胞周期检验点 (checkpoint)
细胞要分裂,必须正确复制 DNA和达到一定的体积,在获得足够物质支持
分裂以前,细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行,是在一系列称为 检验点
( check point) 的严格检控下进行的。
主要检验点 包括:
G1/S检验点,在酵母中称 start点,在哺乳动物中称 R点 (restriction point),
控制细胞由静止状态的 G1进入 DNA合成期,相关的事件包括,DNA是否
损伤?细胞外环境是否适宜?细胞体积是否足够大?
S期检验点,DNA复制是否完成?
G2/M检验点,是决定细胞一分为二的控制点,相关的事件包括,DNA是
否损伤?细胞体积是否足够大?
中 -后期检验点(纺锤体组装检验点),任何一个着丝点没有正确连接到
纺锤体上,都会抑制 APC的活性,引起细胞周期中断。
细胞周期检验点是细胞周期调控的一种机制,主要是确保周期每一时相事件
的有序、全部完成并与外界环境因素相联系
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五,MPF (Maturation-promoting factor,Mitosis-
promoting factor)
MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶;由 M期 Cyclin-
Cdk(Cyclin-dependent protein kinase) 形成的 复合物 。
MPF=CDK1=p34cdc2+cyclinB
Mitotic Cyclin-Cdk复合物的活化与功能
活化
? 随 Cyclin浓度变化而变化
? 激酶与磷酸酶的调节
? 活化的 MPF可使更多的 MPF活化
功能,启动细胞从 G2期进入 M期的相关事件
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六、细胞周期运转的负调控
细胞至少可通过两种不同机制阻遏细胞周期的运转:
Cdk抑制蛋白 (CDI)阻止 Cyclin-Cdk复合物的装配或活性;
CDI包括 CIP/KIP家族和 INK4家族,其作用是抑制 Cyclin-
Cdk复合物的装配或活性,而将细胞阻止在不同的检验点。
如 DNA受损后,细胞将 停留于 G1 Checkpoint 让 DNA修复
或者凋亡 。
周期调控系统组分停止合成,如 G0细胞,大部分 Cyclin和
Cdk都消失,这在多细胞生物尤其明显。
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Experimental demonstration of the coordinated
Synthesis of DNA and hitones.
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前期两个中心体向两极移动(图片来自
http://www.wadsworth.org/)
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MT behavior during formation
of the metaphase plate,
Initially,MT from opposite
poles are different in length.
Experimental demonstration
of the importance of mecha-
nical tension in metaphase
checkpoint control.
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a,Electron micrograph of SC of human pachytene bivalent.
(K,kinetochore; arrow,recombination nodules);
b,Schematic diagram of SC;
c,Electron micrograph of SC after treatment with DNase to remove chromasomal fibers.
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Visible evidence of crossing over
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人 M期细胞与袋鼠( Ptk) G1,S,G2期细胞融合诱导 PCC:提示 M期细胞存在诱导 PCC
的因子;
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注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中,含有卵母细胞成熟的因子,
称做 MPF。
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CDK1的调节与活化 ; CAK=CDK1-Activiting Kinase
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Cyclin B的降解途径