微生物生物工程基本理論的探索 張 星 元 （無錫輕工大學生物工程學院 江蘇無錫 214036） 摘要：工業發酵是微生物群體活動的動態過程。此過程靠如下三種流動來維繫，即伴隨能量形式的轉換而發生的電子流動、伴隨異化和同化作用而發生的物質流動以及伴隨不同水平上的代謝調節而發生的資訊流動。在分析以上三種流動的運行規律和工業發酵大量資訊的基礎上，運用歸納邏輯的方法提出了關於微生物生物工程的三個基本假說，即生物能支撐假說、代謝網路假說和細胞經濟假說。如果這些假說成立，就有可能對工業發酵的微生物代謝進行導向。從而形成由三個假說和三個推理組成的微生物生物工程（工業發酵）基本理論。 關鍵字：生物能支撐假說；代謝網路假說；細胞經濟假說；發酵原理；代謝工程；微生物生物工程 Explorations of Basic Theory of Microbial Biotechnology Zhang Xingyuan (School of Biotechnology, Wuxi University of Light Industry, Wuxi 214036, China) Abstract：Industrial fermentation is the processes in which microbial population functions. Those processes are supported and maintained by the three kinds of flows:  the electron flows which operate along with energy-form transformation,  the metabolite flows which operate along with dissimilation and assimilation,  the information flows which operate along with the metabolic regulations in different levels. On the basis of the analysis of the operation rules of above three kinds of flows and the generalization of a great deal of information of industrial fermentation, the three basic hypothesis of industrial fermentation (microbial biotechnology) are developed as follows:  the hypothesis of bioenergy support,  the hypothesis of metabolic network,  the hypothesis of cell economy. If those hypotheses are true, then the results of metabolic guidance for industrial fermentation should be predicted. The theory of industrial fermentation put forward in this paper consists of the three descriptive hypotheses and three predictions. Key words: the hypothesis of bioenergy support； the hypothesis of metabolic network；the hypothesis of cell economy； biological principles of Industrial fermentation；metabolic engineering；microbial biotechnology 0 引言： 隨著生物化學、細胞生物學、應用分子生物學、遺傳工程和代謝工程的發展，工業發酵正在發生一個從技藝到科學的重大變化，正在向微生物生物工程過渡。在生物工程受到廣泛重視的今天，有必要把微生物（菌種選育）、工業微生物學過程（發酵工藝）和工業微生物學體系（生物反應器）作爲一個整體，在科學的水平上對工業發酵進行重新審視。 1 工業發酵的基本模式 1．1 工業發酵理論研究的起點 認真觀察當今發酵工業的現狀，可知：大多數的發酵法工業生産的生産菌種一般均屬於化能異養型微生物 [1]，工業發酵産品大多數是從發酵液中提取的微生物細胞的胞外産物，工業發酵的目的産物和主要原料一般是有機化合物。工業發酵原理的研究是從這個基礎水平上開始的。 1．2 工業發酵的基本模式 爲了研究的方便，必須對複雜而多樣的工業發酵進行合理的簡化。假定工業發酵依靠化能異養型微生物的代謝來獲得微生物代謝的胞外産物，把研究的重點放在含碳架的化合物的代謝（碳代謝）上，經抽象思維，則可爲工業發酵建立以微生物活細胞爲中心的基本模式：培養基中的有機營養物質跨膜進入微生物活細胞，微生物細胞的代謝促成工業發酵的目的産物在細胞內生成，在細胞內生成的目的産物跨膜排放到培養介質中。也就是說，能源化合物進入細胞，經過代謝轉換，以一種變化了的形式輸出。細胞結構與維持行使細胞功能的有序狀態則是靠消耗能量來保證的。 在此基本模式的基礎上，本文作者于1997年提出關於工業發酵的三個基本觀點。 2 工業發酵的三個基本觀點 [2] 2．1 生物能支撐觀點 微生物細胞是工業發酵的目的産物的生産者，微生物細胞的生長和維持需要由其自身的能量轉換機構從其他形式的能量轉化 而形成的可被其自身直接使用的能量—生物能來支撐。因此工業發酵顯示生物學屬性[4]。 2．2 代謝網路觀點( 由細胞內外的生化反應網路和跨膜的輸送系統組成的代謝網路[4]既沒有絕對的起點，也沒有絕對的終點，代謝網路中任何一個中間産物 (包括可與代謝網路“聯網”的任何一種化合物) 都可能被開發成爲工業發酵的目的産物或原料。 2．3 細胞經濟觀點 微生物細胞的經濟性是在自然選擇的過程中逐漸形成的。野生的（未經人工變異的）微生物細胞在自然選擇的過程中逐漸形成競爭型的細胞經濟。而工業發酵往往要以目的産物的生産爲主導，調整代謝網路中的代謝流，構建一種導向型細胞經濟。從競爭型細胞經濟到導向型經濟的轉變取決於遺傳和環境因素的資訊導向，這種導向必須遵循細胞經濟的基本運行規律。 3 微生物生物工程基本理論的探索 [3] 從以上三個基本觀點出發探索微生物生物工程（工業發酵）的基本理論： 3．1 三個基本假說 運用歸納邏輯的方法提出以下三個假說： 能量支撐假說：微生物細胞的生長和維持需要其自身能量轉換機構從其他形式的能量轉化而形成的生物能來支撐。 代謝網路假說：微生物細胞是個遠離平衡狀態的開放體系，微生物細胞的代謝和生長依賴於橫跨細胞內外的代謝網路來實現。 細胞經濟假說：野生的（未經人工變異的）微生物細胞在自然選擇的過程中逐漸形成競爭型的細胞經濟。 3．2 推理 運用演繹邏輯的方法從以上假說做出以下推理： 如果假說1成立，那麽微生物能量代謝的副産物的形成與 分泌將成爲工業發酵工藝控制的重要依據。 如果假說2成立，那麽代謝網路中任何一種中間産物(或者是可借助化學、生物化學或生物學方法而與代謝網路“聯網”的任何一種化合物) 都有可能被開發成爲工業發酵的原料或目的産物。 如果假說1、2、3和推理2成立，那麽就有可能以目的産 物的生産爲主導，借助育種和條件優化等的手段，調整代謝網路中的代謝流，構建一種導向型的細胞經濟，從而使微生物細胞獲得賴以生存的生物能，並且能在細胞外累積目的産物。然而微生物的細胞經濟從競爭型到導向型的轉變取決於遺傳和環境因素的資訊導向，對競爭型細胞經濟的過度偏離將導致細胞經濟的崩潰。 圖2 能量代謝副産物的形成[3] 圖2 細胞組成物質的合成[3] 4 工業發酵的23條基本概念 以上基本假說和預測從化能異養型微生物生物生命活動中的電子流、碳架物質流，以及理化和生物資訊流三個不同的側面審視工業發酵中微生物細胞的生命活動，使七十年代末出現“能量流”、“資訊流”和“資訊流”的說法在工業發酵領域的到了具體化。工業發酵的三個基本觀點對應於微生物生物工程的三個重要學說，即細胞能學、細胞第二解剖學和細胞經濟學。爲了幫助讀者正確理解以上理論，下面分別從細胞能學（4.1—4.4）、細胞第二解剖學（4.5—4.17）和細胞經濟學（4.18—4.23）三個方面構建工業發酵的23條基本概念，從微生物生物工程和代謝工程的角度來支撐工業發酵的基本理論。　 4．1 微生物細胞能爲其自身提供生物能 微生物細胞的生存方式與動物、植物等高等生物的細胞不同，微生物細胞能獨立存在，自主生活[7]。因此每個微生物細胞都具有能量轉換機構，這種機構可把其他形式的能量轉換成能被其自身直接使用的生物動能 （ 如 ATP，GTP ）和生物勢能（儲存在膜上的質子運動勢ΔP），暫且把生物動能和生物勢能一起稱爲生物能。在生物能的直接支撐下，活細胞才能維持其高度有序的狀態。 4．2 細胞能量轉換機構的組成 化能異養型微生物細胞的能量轉換機構包括：需要生物能來啟動的有關酶和這些酶的輔酶、細胞質膜（原核微生物）和線粒體的內膜（真核微生物），以及這些膜上的電子傳遞鏈和ATP酶、涉及底物水平磷酸化的酶和在能量代謝和主動輸送中起輔助作用的有關載體系統。 4．3 微生物代謝中的電子流和電子回路 工業發酵普遍使用的化能異養型微生物靠生物氧化把化學能轉化爲可被微生物直接利用的生物能。微生物細胞的生物氧化過 程必須借助於輔酶, 並且其生物氧化過程和跨膜的主動輸送過程伴隨著電子（或質子）的流動，形成跨膜的質子回路。 生物氧化和輔酶的再生 在微生物活細胞中，參與生物氧化反應的脫氫酶的輔酶本身不能跨過膜，被局限在其所在的細胞空間內。它們必須被再生和回用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細胞的氧化還原反應中接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶又把電子釋放給電子受體，從而實現脫氫酶的輔酶的再生。根據最終電子受體的類型，可把生物氧化分成有氧呼吸、無氧呼吸和發酵（形成能量代謝副産物）三個類型。 e- e- e- e- e- 能源化合物 電子傳遞鏈 外源電子受體 （電子供體） (NADH) (NADH) (NAD+) 圖4 微生物呼吸過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用[3] e- e- e- 能源化合物 內源電子受體（生成發酵産物） （電子供體） (NADH) (NADH) (NAD+) 圖5 微生物發酵過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用[3] 4．5　　生化反應途徑和代謝途徑　　 　　一系列按序進行的生物化學反應構成生化反應途徑；若這條途徑在活細胞裏運行，則爲代謝途徑。 4．6　　生化反應網路和代謝網路 　　生化反應途徑按生物化學規律彙成生化反應網路，代謝途徑與跨膜輸送系統按代謝規律彙成（物質）代謝網路。 4．7 　代謝網路的聯網問題 　　代謝中間化合物都在代謝網路上，有些有機化合物雖然不在代謝網路中但仍有可能與代謝網路聯網。所謂“聯網”就是用化學、生物化學反應把指定的化合物連接到代謝網路上去，從而使它與微生物的代謝建立聯繫。聯網可以用化學、生物化學或生物學方法（含DNA重組技術）來實現。廣義的聯網包含代謝網路細節不同的生命有機體之間接力賽式的代謝聯繫。已在網上或者可以聯網的化合物都可能被開發爲工業發酵的産物或原料。 4．8 　　代謝流和碳架物質流 　　代謝中間化合物在代謝途徑或代謝網路中流動形成代謝流。在代謝分析和代謝工程中，代謝流往往首先是指碳架物質流。 4．9　　代謝主流 　　微生物細胞在一定的培養條件下進行新陳代謝時，代謝中間化合物在代謝網路中流動，流量相對集中的代謝流叫做這種微生物在該培養條件下的代謝主流。代謝主流的流量測定是代謝工程的內容的重要組成部分之一。 4．10　　載流途徑 從字面上講，有代謝物流通過的代謝途徑均爲載流途徑；其中，代謝主流流經的代謝途徑爲主要載流途徑。代謝工程沒有必 要研究所有的載流途徑的物流量，因此在研究物流量時它所謂的載流途徑一般是指主要載流途徑。 4．11　　代謝主流的變動性和選擇性　　　　 微生物的代謝主流處於不斷變化之中，其方向、流量甚至所流經的途徑都可能發生變化。這就是微生物代謝主流的變動性和代謝主流對代謝網路中的途徑的選擇性。這種變動和選擇的根 據在微生物細胞的遺傳物質，選擇的原因是微生物所處的環境條件的變化。 4．12　　理想載流途徑 爲了提高産物對原料的轉化率， 就要求代謝主流（根據代謝分析的結果推定的）經設定的載流途徑流到目的産物。因爲這樣的載流途徑是帶有主觀導向性的虛擬的載流途徑，所以把它們叫做理想載流途徑。 4．13　　微生物生物工程的難題　　　　　 　　既然代謝主流對網路中的途徑有選擇性，而工業發酵的目標又是要微生物的代謝主流經理想載流途徑，流到目的産物，因此就有必要去解決理想載流途徑的設計問題和代謝主流的合理導向問題。[11] 4．14　　代謝的“五段式”[1] 　　在工業發酵生産中，培養器中的微生物細胞的代謝是分步進行的。胞外營養物質（一般要經胞外酶降解後）從培養介質跨膜進入細胞，（一般要）經過“注入途徑”、“中心途徑”和“發散途徑”等三段連續的代謝途徑的代謝，才能在胞內生成目的産物，最後，目的産物跨過細胞質膜排出細胞，回到培養介質。因此典型的理想載流途徑應該由以上五段承擔不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載流途徑上流動的代謝主流對應地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”（圖1）。 4．15　　設計育種和發酵工藝控制的五字策略[1] 在“代謝主流” 和代謝的“五段式”等概念的基礎上，從不同的角度出發，提出能作爲一個整體用於設計育種以及發酵工藝控制的“進、通、節、堵、出”的“五字策略”：①進，促進細胞對碳源等營養物質的吸收；②通，使來自上游和各個注入分支的碳架物質能暢通地流向目的産物；③節，阻塞與目的産物的 形成無關或關係不大的代謝支流，使碳架物質相對集中地流向目的産物；④堵，消除或削弱目的産物進一步代謝的途徑；⑤出，促進目的産物向胞外空間分泌。 4．16 代謝網路的節點及其剛性 [5] 微生物代謝網路中的途徑的交叉點（代謝流的集散處）叫做節點，微生物自動抵制節點處代謝物流量分配比率的改變的特性叫做節點的剛性。節點的剛性建築在微生物代謝的自動調節機制上。因此在應用“五字策略”制訂育種方案時應該設法繞過強剛性節點，否則育種計劃將難以兌現。 4．17 代謝網路的剛性 [5] 微生物自動抵制代謝網路中代謝物流量分佈的改變的特性叫做代謝網路的剛性。代謝網路的剛性與主要剛性節點的剛性大小、分佈及數量密切相關。 4．18　　微生物活細胞和細胞的經濟性 　　微生物活細胞是個遠離平衡狀態的開放體系，是一種靠消耗能量而維持低熵的穩定的動態的特殊結構——耗散結構[20]。從微生物細胞對能量和化學物質的內外交換、增收節支、協調自強等規律的客觀存在出發，把微生物細胞作爲按特殊的經濟規律運行的經濟實體來看待，並且把這種按特殊的經濟規律運行的、有利於生存競爭的新陳代謝特性叫做細胞經濟性。細胞的經濟性可以以生成細胞的重量與消耗基質的重量之比值——細胞經濟係數來衡量。 4．19　　正常代謝和競爭型細胞經濟　　 微生物在生存競爭中進化的方向是發展其自身的適應能力和提高細胞運行的經濟係數。經生存競爭而幸存下來的野生型微生 物在其所棲身的環境中是富有競爭能力的，並且它們的代謝中間物在代謝網路中的分佈及細胞經濟運行狀況有利於細胞生長、繁殖和在競爭中獲勝。在上述條件下，細胞處於正常代謝狀態，細胞經濟體系呈現競爭型經濟的特色。 4．20　　異常代謝和導向型細胞經濟 如果工業生産要求微生物在胞外累積某種代謝中間産物， 則須對微生物的代謝流進行導向。根據已獲得的代謝分析的資訊，應用“五字策略”就有可能設計理想載流途徑和配套的發酵培養工藝條件，進而改造菌種、調整工藝，將代謝主流導向理想載流途徑。在導向成功的情況下，細胞處於異常代謝狀態，細胞經濟體系呈現導向型經濟的特色。 4．21　　細胞經濟受到嚴格的制約 工業發酵依靠細胞群體的代謝來獲得産品，導向型細胞經濟固然有利於特定的代謝産物的生産，但競爭型細胞經濟向導向型細胞經濟的轉化受到能量代謝、還原力的平衡等條件的嚴格制約，表現出代謝網路的剛性。若細胞經濟實體的運行狀態過度偏離競爭型運行狀態，活細胞的高度有序狀態將受到嚴重衝擊，最終導致細胞經濟的崩潰。 4．22　　資訊流指導下的工業發酵 　　在工業發酵生産中，可以把微生物細胞看作是生物機器，它們進行能量代謝和物質代謝；同時又可以把它們看作是資訊處理器，它們複製和傳遞自己的生物資訊[7]，接收細胞內外的物理、化學甚至外源生物資訊，並在對內外資訊流進行綜合處理的基礎上，發出代謝調控的指令，在網路剛性的範圍之內控制微生物細胞自身的生命活動。 限制性遺傳資訊之謎　　 可以推測在每個微生物細胞的遺傳物質中必有其限制性的生死攸關的遺傳資訊，它們規定微生物細胞生命活動的基本的代謝網路及其調節機制。這些遺傳資訊是微生物細胞能夠自主生活與 獨立存在的依據，也是微生物對環境的有限的適應性以及設計育種的計劃往往不能完全兌現的內在原因。 5 結語 多年來國內外在代謝控制發酵、設計育種、代謝工程方面的許多研究（包括本文作者自己進行的研究[8-11]）和有關文獻[12-22]，已爲上述基本觀點和基本理論提供了充足的論據。受篇幅的限制，本文涉及的基本理論的系統的論證將在專著另行發表。期望通過討論和爭鳴逐步建立並不斷完善微生物生物工程（工業發酵）的應用性理論。 參考文獻： 陶文沂，張星元，周婉冰等：工業微生物生理與遺傳育種學，北京：中國輕工業出版社，1997：111-244 Zhang Xingyuan, Three basic viewpoints of industrial fermentation. In Food of 21st Century, China Light Industry Press, 2000：95-100 張星元：發酵原理電子講義，無錫輕工大學生物工程學院研究生教材，2001 張星元，馮品如：工業發酵的生物學屬性對發酵最優控制的制約與對策，食品與發酵工業，1998，24（4）：74-77 張星元，潘中明，牟奕等：代謝網路剛性與代謝工程，生物工程進展，1999, 19（6）：38-42 張星元：發酵工程專業課程設置的思考和實踐，微生物學通報，1999, 26（2）：147-149 Thomas D. Brock, Michael T. Madigan., Biology of Microorganisms (6th ed.), Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1991：1-8 ，39-131，791-829 張星元，王琴：阿舒假囊酵母過量合成核黃素性能的改良，無錫輕工大學學報，1997，16（3 ）：14-19 張星元，王琴：代謝調節理論指導下的核黃素發酵條件，無錫輕工大學學報，1997，16（4）：1-6 張星元，範銘琦，趙敏等：慶大黴素C1a高産菌株的推理育種的研究，中國抗生素雜誌 ，1998，23（6）：410-414 Eggeling, H. Sahm, A. A. de Graaf, Quantifying and Directing Metabolite Flux: Application to Amino Acid Overproduction, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, Vol. 54, 1-30 Albert G. Moat, John W. Foster. Microbial Physiology (3rd ed.), John Wiley & Sons, New York, 1995：1-201，237-409，462-548 Ruth Bernstein, Stephen Bernstein，Biology, WCB Publishers, Oxford, England, 1996：1-104，569-590 Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou, Jens Nielsen. Metabolic Engineering, Academic Press, New York, 1998：1-312，413-463 Sang Yup Lee, Eleftherios T. Papoutsakis (ed.), Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Inc., New York, 1999：1-12，153-202，253-308 Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky et al., Molecular Cell Biology (4th ed.), W. H. Freeman and Company, New York, 2000：1-50，140-180，342-364，579-647 李友榮，馬輝文：發酵生理學，長沙：湖南科學技術出版社， 1989：1-188，236-313 赫胥黎〔英〕.： 進化論與倫理學（舊譯《天演論》），北京：科學出版社，1971：1-61 方宗熙.：生物的進化，北京：科學出版社，1973：1-110，139-141 李如生.：非平衡態熱力學和耗散結構，北京：清華大學出版社，1986：1-49 恩格斯：自然辯證法，北京：人民出版社，1971：271-287 H·哈肯：協同學（戴鳴鍾譯），上海：上海科學普及出版社，1988：1-93, 203-234