微生物生物工程基本理论的探索 张 星 元 （无锡轻工大学生物工程学院 江苏无锡 214036） 摘要：工业发酵是微生物群体活动的动态过程。此过程靠如下三种流动来维系，即伴随能量形式的转换而发生的电子流动、伴随异化和同化作用而发生的物质流动以及伴随不同水平上的代谢调节而发生的信息流动。在分析以上三种流动的运行规律和工业发酵大量信息的基础上，运用归纳逻辑的方法提出了关于微生物生物工程的三个基本假说，即生物能支撑假说、代谢网络假说和细胞经济假说。如果这些假说成立，就有可能对工业发酵的微生物代谢进行导向。从而形成由三个假说和三个推理组成的微生物生物工程（工业发酵）基本理论。 关键词：生物能支撑假说；代谢网络假说；细胞经济假说；发酵原理；代谢工程；微生物生物工程 Explorations of Basic Theory of Microbial Biotechnology Zhang Xingyuan (School of Biotechnology, Wuxi University of Light Industry, Wuxi 214036, China) Abstract：Industrial fermentation is the processes in which microbial population functions. Those processes are supported and maintained by the three kinds of flows:  the electron flows which operate along with energy-form transformation,  the metabolite flows which operate along with dissimilation and assimilation,  the information flows which operate along with the metabolic regulations in different levels. On the basis of the analysis of the operation rules of above three kinds of flows and the generalization of a great deal of information of industrial fermentation, the three basic hypothesis of industrial fermentation (microbial biotechnology) are developed as follows:  the hypothesis of bioenergy support,  the hypothesis of metabolic network,  the hypothesis of cell economy. If those hypotheses are true, then the results of metabolic guidance for industrial fermentation should be predicted. The theory of industrial fermentation put forward in this paper consists of the three descriptive hypotheses and three predictions. Key words: the hypothesis of bioenergy support； the hypothesis of metabolic network；the hypothesis of cell economy； biological principles of Industrial fermentation；metabolic engineering；microbial biotechnology 0 引言： 随着生物化学、细胞生物学、应用分子生物学、遗传工程和代谢工程的发展，工业发酵正在发生一个从技艺到科学的重大变化，正在向微生物生物工程过渡。在生物工程受到广泛重视的今天，有必要把微生物（菌种选育）、工业微生物学过程（发酵工艺）和工业微生物学体系（生物反应器）作为一个整体，在科学的水平上对工业发酵进行重新审视。 1 工业发酵的基本模式 1．1 工业发酵理论研究的起点 认真观察当今发酵工业的现状，可知：大多数的发酵法工业生产的生产菌种一般均属于化能异养型微生物 [1]，工业发酵产品大多数是从发酵液中提取的微生物细胞的胞外产物，工业发酵的目的产物和主要原料一般是有机化合物。工业发酵原理的研究是从这个基础水平上开始的。 1．2 工业发酵的基本模式 为了研究的方便，必须对复杂而多样的工业发酵进行合理的简化。假定工业发酵依靠化能异养型微生物的代谢来获得微生物代谢的胞外产物，把研究的重点放在含碳架的化合物的代谢（碳代谢）上，经抽象思维，则可为工业发酵建立以微生物活细胞为中心的基本模式：培养基中的有机营养物质跨膜进入微生物活细胞，微生物细胞的代谢促成工业发酵的目的产物在细胞内生成，在细胞内生成的目的产物跨膜排放到培养介质中。也就是说，能源化合物进入细胞，经过代谢转换，以一种变化了的形式输出。细胞结构与维持行使细胞功能的有序状态则是靠消耗能量来保证的。 在此基本模式的基础上，本文作者于1997年提出关于工业发酵的三个基本观点。 2 工业发酵的三个基本观点 [2] 2．1 生物能支撑观点 微生物细胞是工业发酵的目的产物的生产者，微生物细胞的生长和维持需要由其自身的能量转换机构从其他形式的能量转化 而形成的可被其自身直接使用的能量—生物能来支撑。因此工业发酵显示生物学属性[4]。 2．2 代谢网络观点( 由细胞内外的生化反应网络和跨膜的输送系统组成的代谢网络[4]既没有绝对的起点，也没有绝对的终点，代谢网络中任何一个中间产物 (包括可与代谢网络“联网”的任何一种化合物) 都可能被开发成为工业发酵的目的产物或原料。 2．3 细胞经济观点 微生物细胞的经济性是在自然选择的过程中逐渐形成的。野生的（未经人工变异的）微生物细胞在自然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济。而工业发酵往往要以目的产物的生产为主导，调整代谢网络中的代谢流，构建一种导向型细胞经济。从竞争型细胞经济到导向型经济的转变取决于遗传和环境因素的信息导向，这种导向必须遵循细胞经济的基本运行规律。 3 微生物生物工程基本理论的探索 [3] 从以上三个基本观点出发探索微生物生物工程（工业发酵）的基本理论： 3．1 三个基本假说 运用归纳逻辑的方法提出以下三个假说： 能量支撑假说：微生物细胞的生长和维持需要其自身能量转换机构从其它形式的能量转化而形成的生物能来支撑。 代谢网络假说：微生物细胞是个远离平衡状态的开放体系，微生物细胞的代谢和生长依赖于横跨细胞内外的代谢网络来实现。 细胞经济假说：野生的（未经人工变异的）微生物细胞在自然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济。 3．2 推理 运用演绎逻辑的方法从以上假说做出以下推理： 如果假说1成立，那么微生物能量代谢的副产物的形成与 分泌将成为工业发酵工艺控制的重要依据。 如果假说2成立，那么代谢网络中任何一种中间产物(或者是可借助化学、生物化学或生物学方法而与代谢网络“联网”的任何一种化合物) 都有可能被开发成为工业发酵的原料或目的产物。 如果假说1、2、3和推理2成立，那么就有可能以目的产物的生产为主导，借助育种和条件优化等的手段，调整代谢网络中的代谢流，构建一种导向型的细胞经济，从而使微生物细胞获得赖以生存的生物能，并且能在细胞外累积目的产物。然而微生物的细胞经济从竞争型到导向型的转变取决于遗传和环境因素的信息导向，对竞争型细胞经济的过度偏离将导致细胞经济的崩溃。 4 工业发酵的23条基本概念 以上基本假说和预测从化能异养型微生物生物生命活动中的电子流、碳架物质流，以及理化和生物信息流三个不同的侧面审视工业发酵中微生物细胞的生命活动，使七十年代末出现“能量流”、“信息流”和“信息流”的说法在工业发酵领域的到了具体化。工业发酵的三个基本观点对应于微生物生物工程的三个重要学说，即细胞能学、细胞第二解剖学和细胞经济学。为了帮助读者正确理解以上理论，下面分别从细胞能学（4.1—4.4）、细胞第二解剖学（4.5—4.17）和细胞经济学（4.18—4.23）三个方面构建工业发酵的23条基本概念，从微生物生物工程和代谢工程的角度来支撑工业发酵的基本理论。　 4．1 微生物细胞能为其自身提供生物能 微生物细胞的生存方式与动物、植物等高等生物的细胞不同，微生物细胞能独立存在，自主生活[7]。因此每个微生物细胞都具有能量转换机构，这种机构可把其它形式的能量转换成能被其自身直接使用的生物动能 （ 如 ATP，GTP ）和生物势能（储存在膜上的质子运动势ΔP）， 暂且把生物动能和生物势能一起称为生物能。在生物能的直接支撑下，活细胞才能维持其高度有序的状态。 4．2 细胞能量转换机构的组成 化能异养型微生物细胞的能量转换机构包括：需要生物能来激活的有关酶和这些酶的辅酶、细胞质膜（原核微生物）和线粒体的内膜（真核微生物），以及这些膜上的电子传递链和ATP酶、涉及底物水平磷酸化的酶和在能量代谢和主动输送中起辅助作用的有关载体系统。 4．3 微生物代谢中的电子流和电子回路 工业发酵普遍使用的化能异养型微生物靠生物氧化把化学能转化为可被微生物直接利用的生物能。微生物细胞的生物氧化过 程必须借助于辅酶, 并且其生物氧化过程和跨膜的主动输送过程伴随着电子（或质子）的流动，形成跨膜的质子回路。 生物氧化和辅酶的再生 在微生物活细胞中，参与生物氧化反应的脱氢酶的辅酶本身不能跨过膜，被局限在其所在的细胞空间内。它们必须被再生和回用，以维持能量代谢。脱氢酶的辅酶在细胞的氧化还原反应中接受电子而被还原成还原型辅酶，还原型辅酶又把电子释放给电子受体，从而实现脱氢酶的辅酶的再生。根据最终电子受体的类型，可把生物氧化分成有氧呼吸、无氧呼吸和发酵（形成能量代谢副产物）三个类型。 e- e- e- e- e- 能源化合物 电子传递链 外源电子受体 （电子供体） (NADH) (NADH) (NAD+) 图4 微生物呼吸过程中的电子传递和脱氢酶辅酶的回用[3] e- e- e- 能源化合物 内源电子受体（生成发酵产物） （电子供体） (NADH) (NADH) (NAD+) 图5 微生物发酵过程中的电子传递和脱氢酶辅酶的回用[3] 4．5　　生化反应途径和代谢途径　　 　　一系列按序进行的生物化学反应构成生化反应途径；若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。 4．6　　生化反应网络和代谢网络 　　生化反应途径按生物化学规律汇成生化反应网络，代谢途径与跨膜输送系统按代谢规律汇成（物质）代谢网络。 4．7 　代谢网络的联网问题 　　代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在代谢网络中但仍有可能与代谢网络联网。所谓“联网”就是用化学、生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立联系。联网可以用化学、生物化学或生物学方法（含DNA重组技术）来实现。广义的联网包含代谢网络细节不同的生命有机体之间接力赛式的代谢联系。已在网上或者可以联网的化合物都可能被开发为工业发酵的产物或原料。 4．8 　　代谢流和碳架物质流 　　代谢中间化合物在代谢途径或代谢网络中流动形成代谢流。在代谢分析和代谢工程中，代谢流往往首先是指碳架物质流。 4．9　　代谢主流 　　微生物细胞在一定的培养条件下进行新陈代谢时，代谢中间化合物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做这种微生物在该培养条件下的代谢主流。代谢主流的流量测定是代谢工程的内容的重要组成部分之一。 4．10　　载流途径 从字面上讲，有代谢物流通过的代谢途径均为载流途径；其中，代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径。代谢工程没有必 要研究所有的载流途径的物流量，因此在研究物流量时它所谓的载流途径一般是指主要载流途径。 4．11　　代谢主流的变动性和选择性　　　　 微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至所流经的途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络中的途径的选择性。这种变动和选择的根 据在微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。 4．12　　理想载流途径 为了提高产物对原料的转化率， 就要求代谢主流（根据代谢分析的结果推定的）经设定的载流途径流到目的产物。因为这样的载流途径是带有主观导向性的虚拟的载流途径，所以把它们叫做理想载流途径。 4．13　　微生物生物工程的难题　　　　　 　　既然代谢主流对网络中的途径有选择性，而工业发酵的目标又是要微生物的代谢主流经理想载流途径，流到目的产物，因此就有必要去解决理想载流途径的设计问题和代谢主流的合理导向问题。[11] 4．14　　代谢的“五段式”[1] 　　在工业发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质（一般要经胞外酶降解后）从培养介质跨膜进入细胞，（一般要）经过“注入途径”、“中心途径”和“发散途径”等三段连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞，回到培养介质。因此典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条载流途径上流动的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流的“五段式”（图1）。 4．15　　设计育种和发酵工艺控制的五字策略[1] 在“代谢主流” 和代谢的“五段式”等概念的基础上，从不同的角度出发，提出能作为一个整体用于设计育种以及发酵工艺控制的“进、通、节、堵、出”的“五字策略”：①进，促进细胞对碳源等营养物质的吸收；②通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；③节，阻塞与目的产物的 形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；④堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。 4．16 代谢网络的节点及其刚性 [5] 微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）叫做节点，微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性建筑在微生物代谢的自动调节机制上。因此在应用“五字策略”制订育种方案时应该设法绕过强刚性节点，否则育种计划将难以兑现。 4．17 代谢网络的刚性 [5] 微生物自动抵制代谢网络中代谢物流量分布的改变的特性叫做代谢网络的刚性。代谢网络的刚性与主要刚性节点的刚性大小、分布及数量密切相关。 4．18　　微生物活细胞和细胞的经济性 　　微生物活细胞是个远离平衡状态的开放体系，是一种靠消耗能量而维持低熵的稳定的动态的特殊结构——耗散结构[20]。从微生物细胞对能量和化学物质的内外交换、增收节支、协调自强等规律的客观存在出发，把微生物细胞作为按特殊的经济规律运行的经济实体来看待，并且把这种按特殊的经济规律运行的、有利于生存竞争的新陈代谢特性叫做细胞经济性。细胞的经济性可以以生成细胞的重量与消耗基质的重量之比值——细胞经济系数来衡量。 4．19　　正常代谢和竞争型细胞经济　　 微生物在生存竞争中进化的方向是发展其自身的适应能力和提高细胞运行的经济系数。经生存竞争而幸存下来的野生型微生 物在其所栖身的环境中是富有竞争能力的，并且它们的代谢中间物在代谢网络中的分布及细胞经济运行状况有利于细胞生长、繁殖和在竞争中获胜。在上述条件下，细胞处于正常代谢状态，细胞经济体系呈现竞争型经济的特色。 4．20　　异常代谢和导向型细胞经济 如果工业生产要求微生物在胞外累积某种代谢中间产物， 则须对微生物的代谢流进行导向。根据已获得的代谢分析的信息，应用“五字策略”就有可能设计理想载流途径和配套的发酵培养工艺条件，进而改造菌种、调整工艺，将代谢主流导向理想载流途径。在导向成功的情况下，细胞处于异常代谢状态，细胞经济体系呈现导向型经济的特色。 4．21　　细胞经济受到严格的制约 工业发酵依靠细胞群体的代谢来获得产品，导向型细胞经济固然有利于特定的代谢产物的生产，但竞争型细胞经济向导向型细胞经济的转化受到能量代谢、还原力的平衡等条件的严格制约，表现出代谢网络的刚性。若细胞经济实体的运行状态过度偏离竞争型运行状态，活细胞的高度有序状态将受到严重冲击，最终导致细胞经济的崩溃。 4．22　　信息流指导下的工业发酵 　　在工业发酵生产中，可以把微生物细胞看作是生物机器，它们进行能量代谢和物质代谢；同时又可以把它们看作是信息处理器，它们复制和传递自己的生物信息[7]，接收细胞内外的物理、化学甚至外源生物信息，并在对内外信息流进行综合处理的基础上，发出代谢调控的指令，在网络刚性的范围之内控制微生物细胞自身的生命活动。 限制性遗传信息之谜　　 可以推测在每个微生物细胞的遗传物质中必有其限制性的生死攸关的遗传信息，它们规定微生物细胞生命活动的基本的代谢网络及其调节机制。这些遗传信息是微生物细胞能够自主生活与 独立存在的依据，也是微生物对环境的有限的适应性以及设计育种的计划往往不能完全兑现的内在原因。 5 结语 多年来国内外在代谢控制发酵、设计育种、代谢工程方面的许多研究（包括本文作者自己进行的研究[8-11]）和有关文献[12-22]，已为上述基本观点和基本理论提供了充足的论据。受篇幅的限制，本文涉及的基本理论的系统的论证将在专著另行发表。期望通过讨论和争鸣逐步建立并不断完善微生物生物工程（工业发酵）的应用性理论。 参考文献： 陶文沂，张星元，周婉冰等：工业微生物生理与遗传育种学，北京：中国轻工业出版社，1997：111-244 Zhang Xingyuan, Three basic viewpoints of industrial fermentation. In Food of 21st Century, China Light Industry Press, 2000：95-100 张星元：发酵原理电子讲义，无锡轻工大学生物工程学院研究生教材，2001 张星元，冯品如：工业发酵的生物学属性对发酵最优控制的制约与对策，食品与发酵工业，1998，24（4）：74-77 张星元，潘中明，牟奕等：代谢网络刚性与代谢工程，生物工程进展，1999, 19（6）：38-42 张星元：发酵工程专业课程设置的思考和实践，微生物学通报，1999, 26（2）：147-149 Thomas D. Brock, Michael T. Madigan., Biology of Microorganisms (6th ed.), Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1991：1-8 ，39-131，791-829 张星元，王琴：阿舒假囊酵母过量合成核黄素性能的改良，无锡轻工大学学报，1997，16（3 ）：14-19 张星元，王琴：代谢调节理论指导下的核黄素发酵条件，无锡轻工大学学报，1997，16（4）：1-6 张星元，范铭琦，赵敏等：庆大霉素C1a高产菌株的推理育种的研究，中国抗生素杂志 ，1998，23（6）：410-414 Eggeling, H. Sahm, A. A. de Graaf, Quantifying and Directing Metabolite Flux: Application to Amino Acid Overproduction, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, Vol. 54, 1-30 Albert G. Moat, John W. Foster. Microbial Physiology (3rd ed.), John Wiley & Sons, New York, 1995：1-201，237-409，462-548 Ruth Bernstein, Stephen Bernstein，Biology, WCB Publishers, Oxford, England, 1996：1-104，569-590 Gregory N. Stephanopoulos, Aristos A. Aristidou, Jens Nielsen. Metabolic Engineering, Academic Press, New York, 1998：1-312，413-463 Sang Yup Lee, Eleftherios T. Papoutsakis (ed.), Metabolic Engineering, Marcel Dekker, Inc., New York, 1999：1-12，153-202，253-308 Harvey Lodish, Arnold Berk, S. Lawrence Zipursky et al., Molecular Cell Biology (4th ed.), W. H. Freeman and Company, New York, 2000：1-50，140-180，342-364，579-647 李友荣，马辉文：发酵生理学，长沙：湖南科学技术出版社， 1989：1-188，236-313 赫胥黎〔英〕.： 进化论与伦理学（旧译《天演论》），北京：科学出版社，1971：1-61 方宗熙.：生物的进化，北京：科学出版社，1973：1-110，139-141 李如生.：非平衡态热力学和耗散结构，北京：清华大学出版社，1986：1-49 恩格斯：自然辩证法，北京：人民出版社，1971：271-287 H·哈肯：协同学（戴鸣钟译），上海：上海科学普及出版社，1988：1-93, 203-234