高效液相色谱法同时测定饮料中的9种食品添加剂 作者：廊坊师范学院化学系2005届毕业生 祁楠 指导教师：孙欣 摘要:研究了等梯度高效液相色谱法直接测定饮料中的防腐剂、甜味剂、色素的方法。采用C18柱以甲醇—乙酸氨（0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L),pH 6.0为流动相,紫外检测波长为230nm,可在15分钟内将山梨酸、苯甲酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红完全分离。 关键词：高效液相色谱、山梨酸、苯甲酸、糖精、VC、咖啡因、日落黄、柠檬黄、胭脂红、苋菜红 前言：高效液相色谱(HPLC)是上世纪60年代末70年代初,发展起来的一种新型分析分离技术,它是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论，采用高压输送流动相和高灵敏度检测器,发展而成的现代化液相色谱分析方法, 具有分离效率高、 选择性好、 分析速度快、 检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广等特点。 近年来，由于消费者对于食品的安全性日益的关注，食品中的各种添加剂越来越受到人们 的 重视。 食品添加剂指为改善食品品质和 色、香、味，而加入食品中的化学合成或天然物质，但在目前所使用的添加剂中，绝大多数为化学合成添加剂，它们是通过氧化、还原、缩合等一系列化学合成反应所得，有的具有一定毒性，有的在食品中起变态反应或转化成其它有毒物质。通过动物实验证明有些物质有致癌、致畸形等作用，如果不加以限制使用，将对人体健康产生危害。 高效液相色谱具备分离效果好、灵敏度高和重现性好等优点,因此是目前食品添加剂定性、定量分析的首选方法,本实验采用甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L)（ 35：65：4，pH6.0）为流动相,能将食品中的食用色素、防腐剂、甜味剂、抗氧化剂、兴奋剂完全分离。 实验部分 1.1仪器与试剂 ACS2000高效毛细管电泳仪液相色谱一体机(北京彩陆科学仪器公司)、紫外可见光检测器(UV DETECTOR VK-2051)、PHS-2F数字pH计（上海精密科学仪器有限公司）、双频超声清洗机型号SK8200LH(上海科导超声仪器有限公司)、氨水溶液(分析纯氨水：原子水=1：9)、醋酸溶液(分析纯醋酸：原子水=1：9) 标准储备液： VC、胭脂红、柠檬黄、日落黄、苋菜红 均为1.0000g/L、苯甲酸、山梨酸 均为5mmol\L，咖啡因0.8000g/L 标准混合液：取各组分标准储备液各1ml，混合均匀后备用。 1.2样品处理 选择市售饮料三种（科力福、醒目、非常甜橙）充分混匀后用虹吸法分层取样，每层各取50ml左右，装入小口瓶中混和均匀后超声波除气15min，用1：9氨水调节pH 6.0,经0.2μm水相滤膜过滤后，备用。科力福:取原样品液用原子水稀释5倍后，进行以上操作。 3色谱条件 C18柱颗粒度10um、柱温16摄氏度、检测波长230nm、流动相甲醇—乙酸氨（0.02mol/L）—溴化四丁铵(0.007mol/L)配比35:65:4 ，pH 6.0，流速1.0ml/min，微量进样器定量进样20μl,实验以保留时间定性，外表物法定量。 结果与讨论 2..1检测波长选择 用紫外—可见光分光光度计检测器,检测9种物质发现其在200nm—300nm范围内敏感波长分别为 山梨酸 糖精 咖啡因 苯甲酸 胭脂红 苋菜红 柠檬黄 VC 日落黄  260nm 202nm 206，273nm 229nm 215nm 216nm 257nm 262nm 234nm  兼顾九种组分在200nm—300nm的紫外吸收值,选择230nm为检测波长。 2..2 流动相选择 实验:以甲醇—乙酸氨作为流动相[1]对[组分进行分离,如图： （1）甲醇—乙酸氨0.02mol/L =30：70  图1添加剂组分拟合图 胭脂红和苯甲酸分离不开，且六种组分（VC、柠檬黄、日落黄、胭脂红、山梨酸、苯甲酸）出峰时间集中在2.7min-5.4min范围内，不易于最终分离测定。 （2）甲醇—乙酸氨0.02mol/L=40：60  图2添加剂组分拟合图 柠檬黄与苋菜红，出峰重叠；胭脂红与日落黄，出峰重叠，分离效果不好，且组分峰比较集中，不易分离测定。 （3）甲醇—乙酸氨0.02mol/L =44：56  图3添加剂组分拟合图 柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄四种物质出峰重叠；苯甲酸、山梨酸出峰干扰，且各 组分出峰时间相对集中，不易于最终分离测定。 结论：由以上三个图形显示，最佳流动相配比，介于甲醇—乙酸氨0.02mol/L [30：70]至甲醇—乙酸氨0.02mol/L [40：60]中间的一个配比，经实验摸索最终选择 甲醇—乙酸氨0.02mol/L[35：65]为最佳配比。 （4）甲醇—乙酸氨0.02mol/L=35：65  图4添加剂组分拟合图 1-柠檬黄 2-苋菜红 3-日落黄 4-VC 5-胭脂红 6-苯甲酸 7-山梨酸 8-咖啡因 由图4可知七种组分（1-柠檬黄 2-苋菜红 3-日落黄 5-胭脂红 6-苯甲酸 7-山梨酸 8-咖啡因）基本分离，但是出峰时间接近，易发生干扰。 拟解决方案：添加改性剂 2..3添加改性剂溴化四丁铵，选择最佳添加量。 （1）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L)配比35：65：4  图5 九种组分分离图 由图5知，加入改性剂后基本上能将九种物质分离。 （2）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.008mol/L)配比35：65：4  图6 九种组分分离图 由图6知，糖精与苋菜红峰重叠，分离效果不佳。 （3）甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.009mol/L)配比35：65：4  图7 九种组分分离图 由图7知，糖精与苋菜红峰重叠且与苯甲酸峰重叠趋势增加 结论：添加改性剂----溴化四丁铵 能初步将九种物质分离，原因[2]:由于中性条件下(pH=6左右)溴化四丁铵带有正电荷,可以促进带负电荷的日落黄、胭脂红出峰时间增长，从而达到分离组分的要求。溴化四丁铵量不宜过多,否则日落黄与胭脂红峰重叠,糖精、苋菜红、苯甲酸峰重叠,因此远择流动相配比为：甲醇-乙酸氨(0.02mol/L)-溴化四丁铵(0.007mol/L)=35:65:4 问题：9种组分，出峰时间相对比较集中。拟解决方案：调节流动相pH值 2..4 流动相pH值选择 pH值主要决定流动相极性,调节9种组分出峰时间,能更好的将9种物质分离 pH=7  图8 九种组分分离图 由图8知，进混合样发现糖精与胭脂红峰重叠且与苯甲酸峰有重叠趋势，日落黄与胭脂红重叠，完全出峰时间13分钟 （2）pH=6.5  图9 九种组分分离图 苋菜红与糖精分离不好,完全出峰时间14分钟 （3）pH=6  图10 九种组分分离图 苋菜红与糖精基本分离,完全出峰时间15分钟 （4）pH=5.5  图11 九种组分分离图 苋菜红与糖精基本分离,胭脂红与咖啡因重叠,完全出峰时间18分钟 （5）pH=5  图12 九种组分分离图 苋菜红与糖精分离不开,苯甲酸与日落黄重叠，完全出峰时间20分钟 结论：考虑到分离效果、检测时间与重现性,选择pH=6.0，为最佳pH值。 对以上三个条件综合考虑，流动相最终确定为： 甲醇—乙酸氨（0.02mol/L）—溴化四丁铵(0.007mol/L)配比为35:65:4， pH=6.0 2..5线性关系考察 将配制好的以下一系列标准溶液，以C（g/L）对相应的(mv)作外标物曲线（表一），得到相应的回归方程及相关系数（表二）： 表一 C （g/L）、（m v）   苯甲酸 山梨酸 日落黄 柠檬黄 VC   C  C  C  C  C   1 0.6106 363411 0.5607 362352 1.000 109753 1.000 212817 1.000 214293  2 0.3503 214830 0.2804 224927 0.500 54592 0.5000 120675 0.5000 113185  3 0.2035 148002 0.1869 157982 0.3333 29547 0.3333 81527 0.3333 78148  4 0.1527 117203 0.1402 115982 0.2000 23535 0.2500 68367 0.2500 61791  5 0.1221 92047 0.1121 92123   0.2000 54423 0.2000 42905  6 0.1018 75741     0.1667 47039 0.1667 37104  7         0.1429 29398   糖精 胭脂红 苋菜红 咖啡因   C  C  C  C   1 0.5000 241437 1.000 112758 0.5000 288726 0.8000 156085  2 0.3333 181938 0.1667 35519 0.3333 218377 0.4000 79184  3 0.2500 137484 0.1000 2400 0.2500 169867 0.2667 55293  4 0.1667 114908   0.2000 145554 0.2000 39093  5 0.1429 79938     0.1600 32471  6       0.1333 27649  7       0.1143 22460   表2 线性回归方程、相关系数 添加剂 线性回归方程LRE 相关系数（r）  咖啡因 Y=1422.5492+1.939e+005X 0.9997  VC Y=3062.8391+2.142e+005X 0.9983  山梨酸 Y=37100.3956+5.991e+005X 0.9918  苯甲酸 Y=26745.0412+5.521e+005X 0.9983  糖精 Y=18685.2031+4.612e+005X 0.9941  苋菜红 Y=51212.8427+4.813e+005x 0.9974  日落黄 Y=-2987.6231+1.128e+005X 0.9954  胭脂红 Y=-630.0775+1.185e+005X 0.9698  柠檬黄 Y=16334.6903+1.987e+005X 0.9988  注：Y：计算机给出的峰高响应值；X:组分质量浓度（g/L） 九种组分线形工作曲线图谱          2..6本方法准确度测试 取 科力福、非常甜橙、醒目、绿茶样品，每个样品精确移取5ml置于10ml离心试管中，按本实验的方法处理及测定(n=3)，以标准样品的测定结果作为本底值，结果见表4 表4 样品中食品添加剂加标回收率（单位g/L） 食品添加剂 非常甜橙   本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)  苯甲酸 0.4500 0.2035 0.6404 93.56 0.635  VC 0.1752 0.1667 0.3327 94.48 0.428  日落黄 0.1123 0.1667 0.2687 93.82 0.21  食品添加剂 科力福(稀释液)   本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)  山梨酸 0.2250 0.1869 0.4201 104.4 0.2  VC 0.1944 0.1667 0.3532 95.26 0.733  柠檬黄 0.4240 0.1667 0.5553 78.76 0.31  食品添加剂 醒目   本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)  苯甲酸 0.1725 0.2035 0.3580 91.15 0.393  VC 0.034 0.0834 0.1071 87.64 0.55   绿茶   本底值(g/L) 加标量(g/L) 测得值(g/L) 回收率(%) RDS (%)  咖啡因 0.125 0.1143 0.2303 92.12 0.847   2..7样品的测定结果 四种饮料按本实验的色谱条件进样分析，得到四种样品的添加剂含量如表5 表5四种样品中添加剂含量测定结果（n=3） 单位（ g / L） 样品 苯甲酸 山梨酸 VC 柠檬黄 日落黄 咖啡因  非常甜橙 0.4500 未检出 0.1752 未检出 0.1123 未检出  科力福原液 未检出 1.125 0.972 2.120 检出 未检出  醒目 0.1725 未检出 0.034 检出 未检出 未检出  绿茶 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 0.125    非常甜橙分离图 科力福浓缩橙汁分离图   醒目分离图 绿茶分离图 3 原因讨论： 实验过程中发现 糖精、咖啡因、胭脂红、苋菜红的峰型有脱尾、前瞻现象，分析原因： （1）：苯甲酸、山梨酸中混有杂质对分离峰型有影响。 （2）：在紫外吸收带（200nm～400nm）以外有最大吸收峰在不加入改性剂溴化四丁铵情况下，对本实验的九种组分出峰情况不产生干扰（附表2）。但加入溴化四丁铵后，造成甲醇吸收峰红移结果导致流动相甲醇—乙酸氨 (0.02mol/L)—溴化四丁铵(0.007mol/L)在205nm处有最大吸收峰值（附表3）其紫外吸收带宽度为200nm～250nm而九种被测组分紫外吸收波长范围均集中203nm～262nm处，其结果导致九种组分尤其是糖精、咖啡因、胭脂红、苋菜红（其最大吸收波长分别为203nm、213nm、215nm、216nm）影响较大，并在分离过程中造成分离峰脱尾、前瞻，造成分离峰形效果不佳。 本实验参考文献，均未考虑改性剂-溴化四丁铵的紫外吸收峰值对被测组分的干扰，因此造成本实验定量部分与实际值有所偏差，由于本人实验水平有限和实验时间的限制，未对本实验条件下最佳波长加以深入研究。经过比较九种被测物质最大吸收波长及流动相吸收波长，得出结论：在本实验条件下最佳波长范围为240nm～245nm处。 4 结论 ：采用HPLC法同时测定饮料中防腐剂、甜味剂、色素、VC、咖啡因含量，其重现性好、准确度较高，同时操作简便、快捷，能在15min 内将九种添加剂基本分离，达到测定饮料样品的要求。 参考文献： [1]反相高效液相色谱法同时快速测定食品中常见的8种食品添加剂：张秀尧（浙江平阳县卫生防疫站） [2]反相高效液相色谱法同时测定果汁中8种添加剂：陈卫东，邵景东，邹建宏（张家港出入境检疫局） [3]高效液相色谱法同时测定多种食品添加剂：陈青川，于文莲，王静（中国进出口商品检验技术研究所② [4]高效液相色谱法测定食品中防腐剂时样液PH值探讨：马越峰（浙江省疾病预防控制中心） [5] 21世纪的分析化学：科学出版社，汪尔康主编 [6] 高效液相色谱方法及应用：化学工业出版社，于世林主编 [7] 高效液相色谱方法：科学出版社，邹汉法等编著 [8] 液相色谱检测方法：化学工业出版社，张晓彤等编 致谢： 本论文是在指导教师孙欣老师悉心指导下完成的，从论文的选题、论文的写作、修改到校正，都得到了孙欣老师的帮助和关心。在论文实验期间，孙欣老师在繁忙的情况下，给了我们无私、无限、无量的关怀和指导。当我们在实验中碰到困难时，孙欣老师耐心与我们反复讨论研究。孙欣老师饱满的工作热情、严谨的治学态度在指导实验过程中给了我们极大的鼓舞，使我们受益、值得我们学习。另外，张兵建和刘铮两位同学也给了我很大帮助，在此一并感谢！ Determination of Nigh Food Additives in Foods by High Performance Liquid Chromatography Simultaneously Author : 2005 Nan Qi The chemical department of Lang fang normal college tutor : Xin Sun Abstract : It is described a simple and rapid method for the determination of nigh food additives by HPLC, They are saccharin ,benzoic acid , sorbic acid , VC, caffeine ,sunset yellow, ponceau tartrazine, and amaranth. The experiments were carried on C18 with methanol –20mmol/LNH4Ac-7mmol tetrabuty lammonium bromide(35:65:4 v/v Ph6.0) as a flow rate of 1.0 ml/min. The UV detection wavelength was fixed at 230nm.The average recoveries of all the nigh additives were between 91.25%-101%,and the RSD were lower than 9%(n=3). The analysis of a single sample required 15min. The method has been successfully applied to the routine analysis of the additives in foods Keyword: high performance liquid chromatography (HPLC)；saccharin ；benzoic acid；sorbic acid ；VC；caffeine ；sunset yellow；ponceau ；tartrazine, and amaranth.