第二十一章 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。
基因诊断基因诊断的含义传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
基因诊断的原理及方法
（一）基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。
对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。
（二）基因诊断的方法
基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。
DNA诊断常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。
⑴ 斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。
⑵ 等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe,ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。
若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。
⑶ 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。
⑷ 限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图21-3所示。如果用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或基因缺失的疾病如α地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。
⑸ 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图21-4，此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。
⑹ DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知）最直接和准确的方法。
RNA诊断
RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。
⑴RNA印迹（Northern blot）RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。
⑵RT-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR产物量进行准确测定。
基因诊断的应用
（一）遗传疾病现知遗传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同民族，不同地区的人群中发病率不同，例如镰状细胞贫血（sickle cell anemia）,非洲黑色人种发病率高，而囊性纤维化症（cystic fibrosis）常见于美国白色人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养不良症（DMD）、葡萄糖-6磷酸脱氢酶（G-6PD）缺乏症、唐氏综合症（Down’s syndrome）等。
根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不同的技术方法进行诊断，不但可对有症状患者进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前（preimplantation）进行诊断是否携带有异常基因，这对婚育具有指导意义。
地中海贫血（地贫）是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病（monogenic disease）,由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致α类与β类珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地贫最常见的有两类：α地贫和β地贫。
α地贫(α-thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于碱基突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测α珠蛋白基因的缺失。
人α珠蛋白基因簇位于16号染色体，长度29 kb，包含7个连锁的α类基因或假基因。α基因（α1及α2编码序列相同，仅非编码序列稍有差别,产物相同），该基因簇上有2个EcoRI识别位点，经EcoRI酶解，进行Southern印迹，用标记的α基因片段作探针，得到一条23 kb的杂交条带，BamHI识别位点有4个，但只有14 kb片段能与mRNA基因探针杂交，见图21-5。
Hb Bart’s胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条16号染色体的4个α珠蛋白基因均缺失，不能合成α链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠30－40周死亡或早产后半小时内死亡。样本DNA经限制性内切酶图谱分析不能显示α珠蛋白基因区带，RNA诊断也测定不出有α珠蛋白基因的mRNA。
缺失型HBH病：由于一条16号染色体上的两个α珠蛋白基因均缺失，另一条16号染色体上则缺失一个α珠蛋白基因，并缺失3.7 kb长度的DNA片段（右侧缺失型）或4.2 kb片段（左侧缺失型），DNA诊断只产生19 kb长度的EcoRI片段，或10kb BamHI片段。
标准型α地贫：一条16号染色体上2个α珠蛋白基因全部缺失。而另一条16号染色体上具有2个正常的α珠蛋白基因，DNA诊断结果，EcoRI和BamHI都出现与正常一样的23 kb或14 kb的条带，但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。
β地贫(β-thalassemias)的基因诊断：β地贫的分子基础不同于α地贫，β珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因点突变部位不尽相同，都有特定的类型谱。
（二）感染性疾病
过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期培养才能获得。血清学对病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体的检查有困难。
对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR技术已广泛应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成ASO探针，对病原体的DNA可用PCR技术直接检查，而对RNA病毒，则采用RT-PCR。现在市场已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。
病毒性感染：
多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的SARS冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定后，便很快建立了RT-PCR的基因诊断法。
细菌性感染：
可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、绿脓杆菌……等。
寄生虫：
恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫……等都有基因诊断的方法其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。
（三）恶性肿瘤分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指导意义。
(四)法医学中的应用对生物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗原(HLA)等，但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对人基因结构的深入研究发现，有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定。
1,DNA指纹分析(DNA fingerprinting)
近年研究发现，人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)。这种VNTR主要存在于基因的非编码区，重复序列是头对尾串联排列着。人类某些?VNTR是由20-50个重复单位组成，每个单位含15-100 bp，DNA的长度为1kb至5kb，较普通卫星DNA（约100 kb）小，所以称为小卫星DNA（minisatellite DNA）。经研究发现VNTR有高度的多态性，在人群中的分布表现高度的个体特异性，甚至同一个体同源染色体的等位VNTR的重复单位数也不同，等位基因按孟德尔方式遗传。VNTR区的重复单位数目不同，所以该区的DNA长度不同。但每一位点VNTR的核心序列却有高度的保守性，因此可认为VNTR是一种判断个体的遗传标记。
1985年,Jeffreys根据VNTR的特点，选择某些核心序列作为探针，并选用核心序列无切割位点的限制性内切酶如Hinf1，对DNA样品进行酶解，然后作Southern印迹。图谱显示不同个体具有不同条带，如同人的指纹具有高度的个体特异性一样，因此把这种Southern印迹图称作DNA指纹图谱(DNA fingerprint)，如图21-6所示。实验证明，除同卵双生子有相同的图谱外，两个人不可能有完全相同的图谱，所以这种方法对个体识别，亲子鉴定，嫌疑罪犯的判断准确可靠。图21-7是引自文献报道的结果。可是Sourthern印迹技术操作繁琐，所需时间长，需要DNA量较大，若DNA降解还会影响对结果的判断。所以，Jeffreys又根据每一VNTR区翼侧保守序列设计引物，用PCR方法对该区进行扩增，因VNTR长度不同，所以产物经琼脂糖凝胶电泳，染色后，根据条带的不同，可以判断结果。这种方法既方便又省时，对部分酶解DNA也适用，对单根毛发，血斑，皮屑和精迹都可进行分析。但有些VNTR重复片断较长，PCR难以扩增。
短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析
90年代初，发现人基因组中存在着数量众多的STR,STR的重复单元较短，核心序列含2-4 bp，DNA片段长度为100-500 bp，故称为微卫星DNA (microsatellite DNA).与VNTR相同,有不少的微卫星DNA存在着个体间重复单元数目不同的多态性,所以是一种应用价值很高的遗传标记。又因为微卫星DNA 较短，易进行PCR操作，也能适用于降解的DNA分析。目前，STR-PCR技术在法医学中的应用已占主导地位。
VNTR和STR除在法医学中的应用外，还用于遗传作图,基因定位及遗传疾病的诊断等。
基因治疗基因治疗的慨念
（一）基因治疗的定义从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。
基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。
（二）基因治疗的方式基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。
（三）导入的方式导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。
外源治疗基因无论是ex vivo或in vivo导入基因的方式，首先要选择合适的能达到治疗或预防用的目的基因。如导入遗传疾病所缺陷的基因或增强机体免疫的细胞因子基因。目前用于临床试验的治疗基因主要为该基因的c DNA。一些临床试验用的基因见表21-1
作为外源治疗基因的条件：基因的大小要根据所用载体（vector）能够运载的容量；若为分泌性产物需含信号肽序列；cDNA序列应正确无误；翻译时要求有起始密码子及终止密码子。
载体系统要有效将治疗基因导入人体细胞内需要靠合适的运送基因的工具，即载体（vector），
载体有两类：一类为病毒载体（viral vector ）,另一类为非病毒载体（non-viral vector）
目前临床636个基因治疗方案所用的载体列于表21-2
目前临床试验用的载体仍然以病毒载体居多，占70%以上，而逆转录病毒载体约占所用全部载体的1/3。非病毒载体以脂质体居多，而裸质粒DNA的应用有逐渐上升的趋势。目前所用的载体尚不尽人意，有些是存在着安全性问题，有些则为效率不高等缺点。下面将讨论几类常用载体的构建极其优点。
（一）逆转录病毒载体逆转录病毒载体的构建逆转录病毒(retrovirus)属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中,详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR基因），该酶能破坏抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长，若含有neoR基因能产生NPT Ⅱ，即能在含有G418的培养液中生长，故便于筛选转导基因的细胞。
另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受逆转录病毒的LTR调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子mRNA，在翻译过程中IRES具有内启动作用，能启动蛋白质的合成，所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质。
如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的3类结构基因已被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如PA317,提供，这种细胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒RNA因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317，可产生供治疗用的含有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。
逆转录病毒载体的优缺点最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中，所携带的外源目的基因及有关序列不会发生重排，因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广，感染率比较高，由于结构基因均被删除，因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因的表达效率，并对之进行调控。
局限性：逆转录病毒只能在核膜尚未形成时，才能进入核内，因此它只能将外源基因转移至增殖分裂的细胞，而对静止细胞转录效果不佳。由于该病毒基因本身不大，故能容纳外源基因的大小有限，应小于8kb。逆转录病毒稳定性较差，难耐受体外的操作，在纯化或浓缩过程常使其感染性降低。病毒颗粒能迅速被补体破坏。因为是随机整合，所以具有插入突变的危险，特别是病毒制剂中污染着RCR。
（二）其他病毒载体腺病毒感染人的腺病毒(adenovirus)有50余种血清型，能感染多种组织器官，产生类似感冒或类似流感症状，目前多数采用无致病性的5型及2型腺病毒作为载体。构建载体时ITR及包装信号应保存，其余的部分有些可删除，供外源基因的插入，插入片段的大小可达８kb。腺病毒载体较稳定，能耐受纯化浓缩等操作，可获得高滴度的病毒颗粒，感染宿主细胞范围较广，感染效率高，既能感染分裂相细胞，也能感染非分裂相细胞，但腺病毒不整合于宿主细胞染色体，故只能短暂表达外源基因，最大的缺点为引起机体的免疫反应和毒副作用。
腺相关病毒属微小病毒科，不致病，为单链DNA约4.7 kb，腺相关病毒(adeno-associated virus)，作为载体最大的优点能感染分裂相和非分裂相细胞，并整合于宿主细胞染色体，能长期稳定表达，无不良反应，适合于一些遗传性疾病如甲型和乙型血友病的基因治疗。但腺相关病毒载体的制备因需要辅助病毒的参与，有污染的可能性。
其他慢病毒（如HIV）、Ｉ型单纯性疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等都被研究发展作为转移基因的载体。
（三）脂质体上述病毒载体最大的特点是能高效转移外源目的基因，但是也存在着许多的局限性，特别是免疫原性强和可能造成细胞突变危险。因此发展非病毒载体倍受基因治疗研究者的注意。借助物理、化学方法或直接将外源基因导入宿主细胞内。
脂质体（liposome）主要是由天然磷脂和胆固醇类衍生物组成类似生物膜的脂质双分子层包围水相形成的闭合囊泡。
脂质体有两类：一类为阳离子脂质体，表面带正电荷，由于DNA带负电，因此借正电荷的作用，可以浓集和缩合DNA，形成脂质体DNA复合物（lipoplex）可携带的基因不受DNA大小的限制，见图２１－9。目前基因治疗所用的脂质体都是阳离子脂质体。另一类为带负电脂质体，表面带负电，DNA或其他药物被包埋在内部水相中。
由于脂质体具有类似生物膜的性质，因此当脂质体DNA复合物与细胞膜接触后，通过胞吞作用（endocytosis）而进入胞内。
脂质体载体除上述介导外源基因转移不受大小限制外，最大的优点为无生物源性，无毒性，更安全可靠。但是转染效率很低，而且是短暂表达。
（四）裸DNA
裸DNA（naked DNA），即将外源基因构建于真核表达质粒，借助物理的或机械方法直接将其导入宿主组织细胞内。横纹肌和心肌摄取裸DNA的效率较高。若外源基因表达产物可激发机体免疫反应，以防治某些疾病，可称为DNA疫苗（DNA vaccine），是一种非常有希望的新型疫苗。
直接注射裸DNA转染效率不高，常借助一些物理方法。
基因枪（gene gun），通过高压放电产生强烈的冲击波（shock wave），作用于被金包埋的DNA微粒，使DNA微粒加速运动，即颗粒轰击（particle bombardment）而穿透组织细胞，此法不但可用于体外转移基因，而且已用于临床将表达IL-12质粒导入浅表肿瘤组织。
矩形波电穿孔仪（square electroporator）这种仪器能产生低电压的矩形波，使细胞穿孔，让DNA进入，因为产生的仅是使细胞穿孔的矩形波，可避免一般电穿孔仪产生的高电压造成细胞损伤的缺点，电压的范围为5-500Ｖ，加压间隔为100毫秒-1秒。这种仪器可用于体外基因转移，也可用于体内组织器官的基因转移，据报道对肌肉组织的转移效率比直接注射DNA高２个数量级以上，是一种很有前景的基因转移方法。
基因治疗的临床试验目前临床基因治疗试验的方案已达9百多个，受治疗的患者已有数千例表21-3可见当前临床基因治疗（gene therapy）或广义地称基因转移（gene transfer）试验，有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。这些方案的临床试验期（trial phases）极大多数为Ｉ期临床试验，Ⅲ期者仅仅４个方案。说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。
（一）基因标记目前常用的基因标记方法是将含neoR基因的重组逆转录病毒载体在体外转导细胞，然后回输至病人体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运，用来研究许多其他方法不能回答的体细胞移植的生物学问题。
美国第一个被批准基因标记的临床研究计划是NIH的Rosenberg等的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）基因标记实验。他将恶性黑色素瘤组织或转移的淋巴结制成单细胞悬液，在IL-2的作用下淋巴细胞可成倍增殖而肿瘤细胞及其他类型细胞则死亡。这种TIL能特异杀伤肿瘤细胞。先在体外将含有neoR基因的逆转录病毒载体转导TIL，该载体能整合至TIL的基因组，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，便于筛选；也可用PCR检测neoR基因是否存在，以跟踪回输体内的TIL的去处。
将这种基因修饰过的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血循环细胞、淋巴结、肿瘤组织的分布情况；特别感兴趣的是观察TIL是否能靶向肿瘤组织；同时也可以研究TIL在体内存活期的长短；以及了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变？注射后对人体是否有害？这些问题的阐明可为基因治疗打基础。结果发现基因修饰过的TIL在体外不会自主增殖，说明没有恶变。在注射后的头3周，用PCR可测出外周血存在着含有neoR基因的单核细胞，有的长至60d尚可测出。在注射后3d活检的肿瘤组织也可测出有基因修饰过的TIL的存在。有人对其他细胞如骨髓细胞、肝细胞和细胞毒淋巴细胞等进行标记研究。
（二）单基因疾病遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，设计治疗方案时应考虑下列几点因素：⑴对造成该疾病有关的基因应有较详细的了解，并能在实验室克隆适合真核细胞表达的有关基因的cDNA序列，供转导用。⑵经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%～10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。血友病B，是由于凝血因子Ⅸ缺乏所致。现知只要因子Ⅸ水平达到正常的10% ～20%就能缓解严重的血友病。对血友病A而言，只要因子Ⅷ达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开始基因治疗临床试验。⑶即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。⑷有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。⑸现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。
目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。
（三） 恶性肿瘤恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。见表21-4。
免疫基因治疗(immunogene theray)
分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如
IL-2、IL-12、IFN-γ等转导肿瘤细胞作为基因工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或MHC I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。
自杀基因系统自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir,GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
抑癌基因 (tumor suppressive gene)
抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型(正常)的p53转导
p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。
裂解肿瘤病毒（oncolytic virus）
利用基因工程改造过的腺病毒突变体，如EIB基因缺失的腺病毒能选择性在p53缺陷的恶性肿瘤细胞中进行复制、繁殖，并最终杀伤肿瘤细胞。而正常细胞能表达p53，使这种病毒不能复制和繁殖。
（四）病毒性感染
目前病毒性感染主要治疗对象为人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治疗的患者约4百余例。主要有二种治疗策略。
增强机体的抗HIV免疫反应抑制HIV的复制有人研究利用反义核酸来封闭HIV的基因，使mRNA不能翻译蛋白质，并发生降解，或制备有关的核酶来破坏HIV的mRNA，使HIV不能复制繁殖，确切的疗效尚不能肯定，许多科学家尚在研究其他更有效的抑制HIV复制的方法。
（五）心血管疾病目前心血管疾病中基因治疗最多的临床方案为外周血管疾病造成的下肢缺血，及心脏冠状动脉阻塞造成的心肌缺血。通过转移血管内皮细胞生长因子（VEGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通过这些因子的表达，以促进新生血管的生成，从而建立侧肢循环，改善血供。
（六）问题及展望基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。 从理论上讲，若能将与疾病发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向。在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向,
基因诊断基因诊断的含义传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
基因诊断的原理及方法
（一）基因诊断的原理疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。
对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。
（二）基因诊断的方法
基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。
DNA诊断常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。
⑴ 斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。
⑵ 等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe,ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，说明一条染色体上的基因发生突变，另一条染色体上为正常基因，为这种突变基因的杂合子；如果只能与正常ASO探针杂交，不能与突变ASO杂交，说明受检者不存在该种突变基因，如图21-1所示。
若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法(PCR/ASO probe hybridization)，是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。此法对一些已知突变类型的遗传病，如地中海贫血、苯丙酮尿症等纯合子和杂合子的诊断很方便。也可分析癌基因如H-ras和抑癌基因如p53的点突变。
⑶ 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析相同长度的单链DNA因其序列不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不尽相同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时速度就不同，若单链DNA用放射性核素标记，显影后即可区分电泳条带。一般先设计引物对突变点所在外显子进行扩增，PCR产物经变性成单链后进行电泳分析。PCR/SSCP方法，能快速、灵敏、有效地检测DNA突变点，如图21-2，此法可用检测点突变的遗传疾病，如苯丙酮尿症、血友病等，以及点突变的癌基因和抑癌基因。
⑷ 限制性内切酶图谱（restriction map）分析，如果DNA突变后改变了某一核酸限制性内切酶的识别位点，使原来某一识别位点消失，或形成了新的识别位点，那么相应限制性内切酶片段的长度和数目会发生改变。一般基因组DNA经该种限制性内切酶水解，再做Southern印迹，根据杂交片段的图谱，可诊断该点突变，如图21-3所示。如果用PCR扩增该突变点的外显子，PCR产物经该种酶消化后，进行琼脂糖电泳，溴乙锭染色后可直接观察片段的大小及数目。此法可用于检测有些限制性内切酶识别位点消失的遗传疾病，如镰状细胞贫血。或基因缺失的疾病如α地中海贫血症，单纯性生长激素缺乏症等。
⑸ 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因，见图21-4，此法可用于诊断甲型血友病、苯丙酮尿症、享延顿舞蹈病等。
⑹ DNA序列分析对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知）最直接和准确的方法。
RNA诊断
RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。
⑴RNA印迹（Northern blot）RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。
⑵RT-PCR是一种检测基因表达产物mRNA灵敏的方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR产物量进行准确测定。
基因诊断的应用
（一）遗传疾病现知遗传疾病有数千种，但多数遗传疾病属少见病例，有些遗传疾病在不同民族，不同地区的人群中发病率不同，例如镰状细胞贫血（sickle cell anemia）,非洲黑色人种发病率高，而囊性纤维化症（cystic fibrosis）常见于美国白色人种，这二种遗传疾病在我国为罕见病例。中国较常见的遗传疾病有地中海贫血、甲型血友病、乙型血友病、苯丙酮尿症、杜氏肌营养不良症（DMD）、葡萄糖-6磷酸脱氢酶（G-6PD）缺乏症、唐氏综合症（Down’s syndrome）等。
根据不同遗传疾病的分子基础，可采用不同的技术方法进行诊断，不但可对有症状患者进行检测，而且对遗传疾病家族中未发病的成员乃至胎儿甚至胚胎着床前（preimplantation）进行诊断是否携带有异常基因，这对婚育具有指导意义。
地中海贫血（地贫）是世界上最常见和发生率最高的一种单基因遗传疾病（monogenic disease）,由于一种或几种珠蛋白合成障碍导致α类与β类珠蛋白不平衡造成的，临床以贫血、黄疸、肝脾肿大及特殊外貌为特征，地贫最常见的有两类：α地贫和β地贫。
α地贫(α-thalassemias)的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失，也有部分病例是由于碱基突变造成的。可采用限制性内切酶图谱方法检测α珠蛋白基因的缺失。
人α珠蛋白基因簇位于16号染色体，长度29 kb，包含7个连锁的α类基因或假基因。α基因（α1及α2编码序列相同，仅非编码序列稍有差别,产物相同），该基因簇上有2个EcoRI识别位点，经EcoRI酶解，进行Southern印迹，用标记的α基因片段作探针，得到一条23 kb的杂交条带，BamHI识别位点有4个，但只有14 kb片段能与mRNA基因探针杂交，见图21-5。
Hb Bart’s胎儿水肿综合征：由于该病患儿二条16号染色体的4个α珠蛋白基因均缺失，不能合成α链，胎儿全身水肿、肝脾肿大、四肢短小，常于妊娠30－40周死亡或早产后半小时内死亡。样本DNA经限制性内切酶图谱分析不能显示α珠蛋白基因区带，RNA诊断也测定不出有α珠蛋白基因的mRNA。
缺失型HBH病：由于一条16号染色体上的两个α珠蛋白基因均缺失，另一条16号染色体上则缺失一个α珠蛋白基因，并缺失3.7 kb长度的DNA片段（右侧缺失型）或4.2 kb片段（左侧缺失型），DNA诊断只产生19 kb长度的EcoRI片段，或10kb BamHI片段。
标准型α地贫：一条16号染色体上2个α珠蛋白基因全部缺失。而另一条16号染色体上具有2个正常的α珠蛋白基因，DNA诊断结果，EcoRI和BamHI都出现与正常一样的23 kb或14 kb的条带，但杂交条带的放射性自显影较正常人浅。
β地贫(β-thalassemias)的基因诊断：β地贫的分子基础不同于α地贫，β珠蛋白基因通常并不缺失，而是由于基因点突变或个别碱基的插入或缺失。每一民族和人群β珠蛋白基因点突变部位不尽相同，都有特定的类型谱。
（二）感染性疾病
过去对感染性疾病(infectious diseases)的诊断，一是直接分离检查病原体，或者对患者血清学或生物化学的分析。有些病原体不容易分离，有些需经过长期培养才能获得。血清学对病原体抗体的检测虽然很方便，但是病原体感染人体后需要间隔一段时间后才出现抗体，并且血清学检查只能确定是否接触过该种病原体，但不能确定是否有现行感染，对潜伏病原体的检查有困难。
对感染性疾病的基因诊断具有快速、灵敏、特异等优点。80年代建立的PCR技术已广泛应用于对病原体的检测。一般根据各病原体特异和保守的序列设计引物，有的还合成ASO探针，对病原体的DNA可用PCR技术直接检查，而对RNA病毒，则采用RT-PCR。现在市场已经有许多种病原体的测定药盒供应，每一盒包含扩增某种病原体的特异引物，所需的酶以及配妥的各种反应试剂，并附有可行的操作方法步骤。
病毒性感染：
多种病毒性感染都可采用基因诊断检测相应的病原体，如甲型、乙型、丙型和丁型肝炎病毒，人免疫缺陷病毒、可萨奇病毒、脊髓灰质类病毒、腺病毒、EB病毒、疱疹病毒、人巨细胞病毒、乳头状病毒……等。最近新发现的SARS冠状病毒，在基因组（RNA）序列确定后，便很快建立了RT-PCR的基因诊断法。
细菌性感染：
可应用基因诊断检测多种致病性的细菌，如结核分枝杆菌、痢疾性大肠杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、绿脓杆菌……等。
寄生虫：
恶性疟原虫、克鲁斯锥虫、利什曼原虫、血吸虫、弓形虫……等都有基因诊断的方法其它:如衣原体、支原体、真菌性感染也均用基因诊断。
（三）恶性肿瘤分析一些原癌基因的点突变、插入突变、基因扩增、染色体易位和抑癌基因的丢失或突变，可以了解恶性肿瘤的分子机制，有助于对恶性肿瘤的诊断，对肿瘤治疗及预后有指导意义。
(四)法医学中的应用对生物个体识别和亲子鉴定传统的方法有血型、血清蛋白型、红细胞酶型和白细胞膜抗原(HLA)等，但这些方法都存在着一些不确定的因素。近年来对人基因结构的深入研究发现，有些具有个体特征的遗传标记可用于个体识别和亲子鉴定。
1,DNA指纹分析(DNA fingerprinting)
近年研究发现，人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)。这种VNTR主要存在于基因的非编码区，重复序列是头对尾串联排列着。人类某些?VNTR是由20-50个重复单位组成，每个单位含15-100 bp，DNA的长度为1kb至5kb，较普通卫星DNA（约100 kb）小，所以称为小卫星DNA（minisatellite DNA）。经研究发现VNTR有高度的多态性，在人群中的分布表现高度的个体特异性，甚至同一个体同源染色体的等位VNTR的重复单位数也不同，等位基因按孟德尔方式遗传。VNTR区的重复单位数目不同，所以该区的DNA长度不同。但每一位点VNTR的核心序列却有高度的保守性，因此可认为VNTR是一种判断个体的遗传标记。
1985年,Jeffreys根据VNTR的特点，选择某些核心序列作为探针，并选用核心序列无切割位点的限制性内切酶如Hinf1，对DNA样品进行酶解，然后作Southern印迹。图谱显示不同个体具有不同条带，如同人的指纹具有高度的个体特异性一样，因此把这种Southern印迹图称作DNA指纹图谱(DNA fingerprint)，如图21-6所示。实验证明，除同卵双生子有相同的图谱外，两个人不可能有完全相同的图谱，所以这种方法对个体识别，亲子鉴定，嫌疑罪犯的判断准确可靠。图21-7是引自文献报道的结果。可是Sourthern印迹技术操作繁琐，所需时间长，需要DNA量较大，若DNA降解还会影响对结果的判断。所以，Jeffreys又根据每一VNTR区翼侧保守序列设计引物，用PCR方法对该区进行扩增，因VNTR长度不同，所以产物经琼脂糖凝胶电泳，染色后，根据条带的不同，可以判断结果。这种方法既方便又省时，对部分酶解DNA也适用，对单根毛发，血斑，皮屑和精迹都可进行分析。但有些VNTR重复片断较长，PCR难以扩增。
短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析
90年代初，发现人基因组中存在着数量众多的STR,STR的重复单元较短，核心序列含2-4 bp，DNA片段长度为100-500 bp，故称为微卫星DNA (microsatellite DNA).与VNTR相同,有不少的微卫星DNA存在着个体间重复单元数目不同的多态性,所以是一种应用价值很高的遗传标记。又因为微卫星DNA 较短，易进行PCR操作，也能适用于降解的DNA分析。目前，STR-PCR技术在法医学中的应用已占主导地位。
VNTR和STR除在法医学中的应用外，还用于遗传作图,基因定位及遗传疾病的诊断等。
基因治疗基因治疗的慨念
（一）基因治疗的定义从基因角度可以理解为对缺陷的基因进行修复或将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法。若从治疗角度可以广义地说是一种基于导入遗传物质以改变患者细胞的基因表达从而达到治疗或预防疾病的目标的新措施。导入的基因可以是与缺陷基因相对应的有功能的同源基因或与缺陷基因无关的治疗基因。
基因治疗有两种形式，一种是改变体细胞的基因表达，即体细胞基因治疗（somatic gene therapy），另一种是改变生殖细胞的基因表达，即种系基因治疗（germline gene therapy），从理论上讲，若对缺陷的生殖细胞进行矫正，不但当代可以得到根治，而且可以将正常的基因传给子代。但生殖的生物学极其复杂，且尚未清楚，一旦发生差错将给人类带来不可想象的后果，涉及一系列伦理学的问题，目前还不能用于人类。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。
（二）基因治疗的方式基因治疗的方式（type of gene therapy）主要有3类，一类为基因矫正或置换，即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变，目前尚无体内成功的报道。另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的导入，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。再有一类为基因封闭，有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵（decoy）转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达。除上述3大类外，近日发展其它多种形式，如导入病毒或细菌来源的所谓“自杀基因”或经过改造的条件性复制病毒，只能在p53缺陷的肿瘤细胞繁殖以达到溶解肿瘤细胞。
（三）导入的方式导入基因有两种方式，一种是体外导入（ex vivo）,即在体外将基因导入细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使这种带有外源基因的细胞在体内表达，从而达到治疗或预防的目的。被用于修饰的细胞可以是自体，同种异体或异种的体细胞。合适的细胞应易于从体内取出和回输，能在体外增殖，经得起体外实验操作，能够高效表达外源基因，且能在体内长期存活。目前常用的细胞有淋巴细胞、骨髓干细胞、内皮细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、肌细胞、角朊细胞（keratinocyte）、多种肿瘤细胞等。另一种是体内导入（in vivo），即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。
外源治疗基因无论是ex vivo或in vivo导入基因的方式，首先要选择合适的能达到治疗或预防用的目的基因。如导入遗传疾病所缺陷的基因或增强机体免疫的细胞因子基因。目前用于临床试验的治疗基因主要为该基因的c DNA。一些临床试验用的基因见表21-1
作为外源治疗基因的条件：基因的大小要根据所用载体（vector）能够运载的容量；若为分泌性产物需含信号肽序列；cDNA序列应正确无误；翻译时要求有起始密码子及终止密码子。
载体系统要有效将治疗基因导入人体细胞内需要靠合适的运送基因的工具，即载体（vector），
载体有两类：一类为病毒载体（viral vector ）,另一类为非病毒载体（non-viral vector）
目前临床636个基因治疗方案所用的载体列于表21-2
目前临床试验用的载体仍然以病毒载体居多，占70%以上，而逆转录病毒载体约占所用全部载体的1/3。非病毒载体以脂质体居多，而裸质粒DNA的应用有逐渐上升的趋势。目前所用的载体尚不尽人意，有些是存在着安全性问题，有些则为效率不高等缺点。下面将讨论几类常用载体的构建极其优点。
（一）逆转录病毒载体逆转录病毒载体的构建逆转录病毒(retrovirus)属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中,详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene）供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR基因），该酶能破坏抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长，若含有neoR基因能产生NPT Ⅱ，即能在含有G418的培养液中生长，故便于筛选转导基因的细胞。
另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受逆转录病毒的LTR调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子mRNA，在翻译过程中IRES具有内启动作用，能启动蛋白质的合成，所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质。
如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的3类结构基因已被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如PA317,提供，这种细胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒RNA因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317，可产生供治疗用的含有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。
逆转录病毒载体的优缺点最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中，所携带的外源目的基因及有关序列不会发生重排，因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广，感染率比较高，由于结构基因均被删除，因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因的表达效率，并对之进行调控。
局限性：逆转录病毒只能在核膜尚未形成时，才能进入核内，因此它只能将外源基因转移至增殖分裂的细胞，而对静止细胞转录效果不佳。由于该病毒基因本身不大，故能容纳外源基因的大小有限，应小于8kb。逆转录病毒稳定性较差，难耐受体外的操作，在纯化或浓缩过程常使其感染性降低。病毒颗粒能迅速被补体破坏。因为是随机整合，所以具有插入突变的危险，特别是病毒制剂中污染着RCR。
（二）其他病毒载体腺病毒感染人的腺病毒(adenovirus)有50余种血清型，能感染多种组织器官，产生类似感冒或类似流感症状，目前多数采用无致病性的5型及2型腺病毒作为载体。构建载体时ITR及包装信号应保存，其余的部分有些可删除，供外源基因的插入，插入片段的大小可达８kb。腺病毒载体较稳定，能耐受纯化浓缩等操作，可获得高滴度的病毒颗粒，感染宿主细胞范围较广，感染效率高，既能感染分裂相细胞，也能感染非分裂相细胞，但腺病毒不整合于宿主细胞染色体，故只能短暂表达外源基因，最大的缺点为引起机体的免疫反应和毒副作用。
腺相关病毒属微小病毒科，不致病，为单链DNA约4.7 kb，腺相关病毒(adeno-associated virus)，作为载体最大的优点能感染分裂相和非分裂相细胞，并整合于宿主细胞染色体，能长期稳定表达，无不良反应，适合于一些遗传性疾病如甲型和乙型血友病的基因治疗。但腺相关病毒载体的制备因需要辅助病毒的参与，有污染的可能性。
其他慢病毒（如HIV）、Ｉ型单纯性疱疹病毒、痘病毒和杆状病毒等都被研究发展作为转移基因的载体。
（三）脂质体上述病毒载体最大的特点是能高效转移外源目的基因，但是也存在着许多的局限性，特别是免疫原性强和可能造成细胞突变危险。因此发展非病毒载体倍受基因治疗研究者的注意。借助物理、化学方法或直接将外源基因导入宿主细胞内。
脂质体（liposome）主要是由天然磷脂和胆固醇类衍生物组成类似生物膜的脂质双分子层包围水相形成的闭合囊泡。
脂质体有两类：一类为阳离子脂质体，表面带正电荷，由于DNA带负电，因此借正电荷的作用，可以浓集和缩合DNA，形成脂质体DNA复合物（lipoplex）可携带的基因不受DNA大小的限制，见图２１－9。目前基因治疗所用的脂质体都是阳离子脂质体。另一类为带负电脂质体，表面带负电，DNA或其他药物被包埋在内部水相中。
由于脂质体具有类似生物膜的性质，因此当脂质体DNA复合物与细胞膜接触后，通过胞吞作用（endocytosis）而进入胞内。
脂质体载体除上述介导外源基因转移不受大小限制外，最大的优点为无生物源性，无毒性，更安全可靠。但是转染效率很低，而且是短暂表达。
（四）裸DNA
裸DNA（naked DNA），即将外源基因构建于真核表达质粒，借助物理的或机械方法直接将其导入宿主组织细胞内。横纹肌和心肌摄取裸DNA的效率较高。若外源基因表达产物可激发机体免疫反应，以防治某些疾病，可称为DNA疫苗（DNA vaccine），是一种非常有希望的新型疫苗。
直接注射裸DNA转染效率不高，常借助一些物理方法。
基因枪（gene gun），通过高压放电产生强烈的冲击波（shock wave），作用于被金包埋的DNA微粒，使DNA微粒加速运动，即颗粒轰击（particle bombardment）而穿透组织细胞，此法不但可用于体外转移基因，而且已用于临床将表达IL-12质粒导入浅表肿瘤组织。
矩形波电穿孔仪（square electroporator）这种仪器能产生低电压的矩形波，使细胞穿孔，让DNA进入，因为产生的仅是使细胞穿孔的矩形波，可避免一般电穿孔仪产生的高电压造成细胞损伤的缺点，电压的范围为5-500Ｖ，加压间隔为100毫秒-1秒。这种仪器可用于体外基因转移，也可用于体内组织器官的基因转移，据报道对肌肉组织的转移效率比直接注射DNA高２个数量级以上，是一种很有前景的基因转移方法。
基因治疗的临床试验目前临床基因治疗试验的方案已达9百多个，受治疗的患者已有数千例表21-3可见当前临床基因治疗（gene therapy）或广义地称基因转移（gene transfer）试验，有三种类型，即治疗性、基因标记及非治疗性试验。后者将腺病毒载体注射于健康自愿者的体内，观察机体对腺病毒载体的反应。这些方案的临床试验期（trial phases）极大多数为Ｉ期临床试验，Ⅲ期者仅仅４个方案。说明基因治疗临床试验尚处于未成熟阶段。
（一）基因标记目前常用的基因标记方法是将含neoR基因的重组逆转录病毒载体在体外转导细胞，然后回输至病人体内，可以很方便地跟踪这种标记细胞的命运，用来研究许多其他方法不能回答的体细胞移植的生物学问题。
美国第一个被批准基因标记的临床研究计划是NIH的Rosenberg等的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）基因标记实验。他将恶性黑色素瘤组织或转移的淋巴结制成单细胞悬液，在IL-2的作用下淋巴细胞可成倍增殖而肿瘤细胞及其他类型细胞则死亡。这种TIL能特异杀伤肿瘤细胞。先在体外将含有neoR基因的逆转录病毒载体转导TIL，该载体能整合至TIL的基因组，故子代的TIL也含有neoR基因，能在含抗生素G418的培养液中生长，便于筛选；也可用PCR检测neoR基因是否存在，以跟踪回输体内的TIL的去处。
将这种基因修饰过的TIL注射于黑色素瘤患者，可以研究TIL在体内各组织器官、血循环细胞、淋巴结、肿瘤组织的分布情况；特别感兴趣的是观察TIL是否能靶向肿瘤组织；同时也可以研究TIL在体内存活期的长短；以及了解这种体外基因修饰过的TIL是否会自主生长和恶变？注射后对人体是否有害？这些问题的阐明可为基因治疗打基础。结果发现基因修饰过的TIL在体外不会自主增殖，说明没有恶变。在注射后的头3周，用PCR可测出外周血存在着含有neoR基因的单核细胞，有的长至60d尚可测出。在注射后3d活检的肿瘤组织也可测出有基因修饰过的TIL的存在。有人对其他细胞如骨髓细胞、肝细胞和细胞毒淋巴细胞等进行标记研究。
（二）单基因疾病遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，设计治疗方案时应考虑下列几点因素：⑴对造成该疾病有关的基因应有较详细的了解，并能在实验室克隆适合真核细胞表达的有关基因的cDNA序列，供转导用。⑵经有功能基因转导的体细胞，只要产生较少量原来缺少的基因产物就能矫正疾病。例如腺苷脱氨酶（ADA）缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%～10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。血友病B，是由于凝血因子Ⅸ缺乏所致。现知只要因子Ⅸ水平达到正常的10% ～20%就能缓解严重的血友病。对血友病A而言，只要因子Ⅷ达正常水平的5%就能缓解症状，血友病已开始基因治疗临床试验。⑶即使导入基因过度表达，对机体应无不良作用。⑷有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。⑸现在采用的以正常有功能的同源基因来增补体内的缺乏基因，因此要求增补的基因在病人寿命期间能稳定表达，或重复治疗，所以应考虑构建能长期持续稳定表达外源基因的载体，并考虑将外源基因转导干细胞，如造血干细胞以望回输体内后其子代细胞也含有外源基因。
目前应用基因治疗的单基因疾病已有二十多种。
（三） 恶性肿瘤恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。见表21-4。
免疫基因治疗(immunogene theray)
分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如
IL-2、IL-12、IFN-γ等转导肿瘤细胞作为基因工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或MHC I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。
自杀基因系统自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir,GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
抑癌基因 (tumor suppressive gene)
抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型(正常)的p53转导
p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。
裂解肿瘤病毒（oncolytic virus）
利用基因工程改造过的腺病毒突变体，如EIB基因缺失的腺病毒能选择性在p53缺陷的恶性肿瘤细胞中进行复制、繁殖，并最终杀伤肿瘤细胞。而正常细胞能表达p53，使这种病毒不能复制和繁殖。
（四）病毒性感染
目前病毒性感染主要治疗对象为人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，接受基因治疗的患者约4百余例。主要有二种治疗策略。
增强机体的抗HIV免疫反应抑制HIV的复制有人研究利用反义核酸来封闭HIV的基因，使mRNA不能翻译蛋白质，并发生降解，或制备有关的核酶来破坏HIV的mRNA，使HIV不能复制繁殖，确切的疗效尚不能肯定，许多科学家尚在研究其他更有效的抑制HIV复制的方法。
（五）心血管疾病目前心血管疾病中基因治疗最多的临床方案为外周血管疾病造成的下肢缺血，及心脏冠状动脉阻塞造成的心肌缺血。通过转移血管内皮细胞生长因子（VEGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）或血小板衍生生长因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通过这些因子的表达，以促进新生血管的生成，从而建立侧肢循环，改善血供。
（六）问题及展望基因治疗无疑是近30年来生命科学发展的一种结果。 从理论上讲，若能将与疾病发生有关的基因进行矫正或修复，应是一种有效的根治方法，可惜目前还不能达到此目的，这应是今后研究的一个重要方向。在这当中，其中最具有挑战性的问题是运送治疗基因的载体系统，理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因；持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向,
