代谢设计育种
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 2
1 代谢 设计育种的策划
2 育种方案的实施
代谢设计育种
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1,代谢设计育种的策划
1.1 目的产物代谢途径的组合
（五段式）
1.2 中心代谢流上节点的分析
1.3 理想载流途径的推定
1.4 五字策略的应用
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1.1 目的产物代谢途径的组合
（五段式）
目的产物合成代谢的“五段式”
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1.2 中心代谢流上节点的分析
代谢网络上的交叉点（代谢中
间化合物）叫做代谢网络的节点。
节点有刚性和挠性之分。挠性节点
处的流量分配容易发生改变，任何
分支可以得到 100% 的流量。刚性
或弱刚性节点的流量分配比例不容
易发生改变。
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S S
P1 P1P2 P2
P1 I P
1 I P2 IP2 IP1 AP2 A
强刚性节点 弱刚性节点
优
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尽管代谢网络包含了大量的节点，
但通常只有几个节点直接影响产物的转
化率，称为主要节点。对赖氨酸生产来
说，有五个分支点处流量的分配率受到
培养条件较大的影响，它们是 G-6-P、
F-6-P,PEP,PYR 及 OAA。 在这些分
支点中，只有 G-6-P 和 PEP / PYR,被
认为是有用的主要节点。通过扰动节点
处代谢流量的方法可以做出判断。
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PEP
PYROAA
G6P
挠性节点
刚性节点
赖氨酸生物合成的网络结构推测试验Lys
AcCoA
PYREXT
F6P
Glc GA6P
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网络刚性是自然选择的结果，是
细胞经济体系的保障作用的体现。刚
性节点是由反馈调节和交叉激活等代
谢自动调节机制来支持的,解除调节
可望改变节点的性质。 然而，代谢自
动调节机制不但包括反馈调节和交叉
激活。 刚性节点的支持背景 尚未弄清
的时候，只好绕过该刚性节点，先解
决其它节点的问题。
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根据文献和实验推测。实验包
括离线推定和在线推定。
1.3 理想载流途径的推定
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N PP
进 出通 节 堵
1.4 五字策略的应用
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节点的刚性取决于微生物代
谢的自动调节机制。因此在应用
,五字策略, 制订育种方案时
必须认真分析代谢网络和节点的
刚性及其形成的机理，尽量采用
协调（如：调节突变株）而不是
一刀切（如：营养缺陷型突变株）
的手段。
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2 育种方案的实施
2.1 出发菌种的选定
2.2 遗传操作方案的制定
2.3 遗传操作方案的实施
2.4 变异株培养条件的优化
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※ 调节机制简单：文献
※ 遗传标记可靠：文献，实验
※ 生长情况良好：实验，观察
※ 有目的产物的生产潜力：哲学思辨
※ 可以获得
※ 经费方面可行
2.1 出发菌种的选定
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※ 物理诱变
※ 化学诱变
※ 复合诱变
※ 定向诱变
※ 插入基因拷贝
※ 插入途径基因组
2.2 遗传操作方案的制定
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※ 缺陷型突变株的获得
※ 结构类似物抗性突变株的获得
※ 结构类似物超敏性突变株的获得
※ 分子生物学方法（略）
2.3 遗传操作方案的实施
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※ 营养因子、酶和功能性蛋白质
※ 营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株
※ 酶缺损突变株
※ 输送体系缺损突变株
※ 条件突变株
突变株的获得
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（ 1）营养因子：氨基酸、维生素、嘌
呤和嘧啶（经离心途径合成）。
（ 2）酶,中心代谢途径的酶 （ 特别
是与生长密切相关的酶 ）,向心途径
的酶、离心途径的酶。
（ 3）功能性蛋白：调节酶、专一性的
输送蛋白、调节蛋白,以及 电子传递
链的多肽成员,ATP 酶等。
营养因子、酶和功能性蛋白质
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（ 1）营养缺陷突变株
（ 2）渗漏营养缺陷突变株
MM MM+F CM
营养缺陷与渗漏营养缺陷突变株检出
无营养缺陷 其他营养缺陷
F营养缺陷
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结构类似物（代谢撷颃物）的选择：
一, 空间结构类似,
二, 对微生物有致死性或毒性 （ 抑
制生长 ） ；绝大多数情况下, 结构类似
物可被其, 真身, 解毒 。
三, 有些抗生素, 药物 （ 包括中
药 ）, 诱变剂本身就是结构类似物 （ 代
谢撷颃物 ）, 但需确证 。
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※ 结构类似物的确定
※ 生长抑制试验和敏感性试验
※,筛子”的设计
※ 剂量的确定
※ 筛选的具体方法的确定
※ 高产株的检出
结构类似物抗性突变株的获得
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结构类似物的确定及其抗性突变株的检出
A’
A
A
对照 实验（纸片法）
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生长抑制试验和敏感性试验
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（ 1）根据反馈调节机制设计
（ 2）同时要考虑协同调节机制等
（ 3）要考虑实验的成本问题
（ 4）根据问题的轻重缓急设计
“筛子”的设计
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（ 1）浓度梯度平板筛选法
（ 2）纸片法
（ 3）液体培养浓缩后涂布的方法
（ 4）其他方法
筛选的具体方法的确定
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（ 1）反馈调节的调节突变株：抗性
（ 2）输送体系突变株：抗性
（ 3）影响与底物的亲和能力的突
变株：超敏性
（ 4）对入围的突变株进行产量形状
的筛选
高产株的检出
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※ 尽量从生物学的角度安排试验
※ 尽量排除培养基消毒、摇瓶培养条
件不一致带来的系统误差
※ 每批摇瓶（生物）试验都要做对照
※ 注重产量与菌体量之间的的微妙
关系（生物机器的特殊性）
2.4 变异株培养条件的优化
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对于发源于农产加工和农业化学的
手工作坊式的发酵生产来说，要摆脱繁
重的体力劳动，就必须走工业化的道路。
于是，发酵生产首先向化学工业靠拢，
通过向化学工程学习，用泵和管道输送
替代了肩挑手提的人力搬运，以机器生
产代替了手工操作，早已把作坊式的发
酵生产成功地推上了工业生产的水平。
发酵生产与化学工程的结合促成了发酵
生产的第一次飞跃 。
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生产实践已经证明工业发酵过程是
一个随着时间变化的（时变的）、非线
性的、多变量输入和输出的动态过程，
按照化学工程的模式处理工业发酵的问
题，微生物细胞屈居于催化剂的地位，
难以发挥其生产潜力。 十多年来，我们
从研究微生物的生命活动规律入手,把
现代生物学关于能量转换的电子流动、
物质流动和信息流动这三个基本观点引
入了工业发酵,重新审视发酵工程。
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用生物学的眼光重新审视发
酵工程，确认了发酵工程的生物
学属性。从生物科学的高度在发
酵工程领域首先提出了 微生物细
胞机器 的新概念和新思路。
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（ 1） 现代发酵工程依靠微生物来完成
发酵工厂生产线上的不可缺少的加工
（ 或转化 ） 步骤, 在这个意义上, 微生
物细胞就是工业发酵生产线上不可缺少
的特殊机器 —— 微生物, 细胞机器, 。
因而, 没有微生物就没有发酵工程, 没
有微生物细胞机器就没有现代发酵工厂 。
微生物是发酵工程的灵魂 。
我们认为：
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（ 2） 微生物细胞机器与普通意
义上的机器不同, 必须在生产线
上完成细胞机器的, 在线制造,
和, 生产运行, 的双重任务, 因
而, 必须兼顾细胞机器的量和细
胞机器的工作效率 。
我们认为：
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（ 3） 微生物细胞机器按其自身
固有的规律运行, 因而, 必须深
入研究微生物细胞机器的工作原
理, 应顺自然规律, 引导微生物
为我们服务 。
我们认为：
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（ 4） 发酵工程具有的生物学属性,
现代发酵工程必须向生物学靠拢 。 发
酵生产与生物学的结合酝酿着发酵工
程的又一次革命性的飞跃 。 发酵工程
将在生物学和化学的支撑下, 进入新
的发展阶段, 成为生物工程的一个重
要的组成部分 。
我们认为：
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我们认为：
必须全面地、历史地研究微
生物的代谢。必须让微生物生理
学家、发酵工程专家和自动控制
专家三种头脑合而为一，互动地
开展研究，才能做出新型发酵的
开创新的工作。
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尊重自然规律，活用自然规律，
为人类造福，为世界消灾。