用遗传学与生理学相结合的方法
研究氨基酸生产
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 2
前 言
对微生物的代谢途径及代谢网络进行
有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然
是现代生物工程学的一个主攻目标。为了
攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完
善的细胞生理学、生物化学、分子生物学
及生物过程工程等学科的基本状况做一番
描述，主要有如下几个话题,
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 3
①与生物工程相关的氨基酸产生
菌的相关途径的研究进展情况，
其中必须包括这些途径的 代谢调
节以及细胞的整个调节网络 的研
究进展情况。
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②对所有的相关途径进行详细的 代谢流
量分析 。这涉及到基质进入细胞的碳架
物流量，流经向心途径、中心代谢途径
和离心途径的碳架物流量，以及代谢中
间产物流出细胞的 碳架物流量 （ the
central and peripheral carbon fluxes）。
还原力的流量 （ redox flux ） 及 能量流
量 （ energy flux）。
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③以协调和调节的方式 对碳架流、氧
化还原反应的电子流、能量流进行导
向,以提高基质的吸收能力, 限制前
体物向支路途径的流量、减少中间产
物的积累及副产物的形成，还要绕过
氧化还原平衡及能量平衡中可能出现
的难题。
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传统的设计育种（ 随机诱变加定
向筛选），以及 DNA重组技术在设计
育种中的应用已经大大提高了 微生物
对氨基酸的生产能力,但人们对于氨
基酸产生菌的 生理学 与 生物化学 等 主
要领域的基础知识还相当匮乏。
目前可从以下几方面理解氨基酸
的代谢基础：
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①具有生物工程学重要性的微生物的
基本代谢途径 及其对应的 酶的性质 ；
②酶及其 调节方式,途径及其调节方
式；
③中心代谢途径及离心途径代谢 流量
的定量分析 ；
④对 跨膜传送 （基质吸收和产物分泌）
的详尽的了解。
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目的产物的合成途径是理解氨基酸
生产的前提和核心内容 。相关的代谢途
径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸
的合成的专用途径，也包括提供前体碳
架物的途径、从专用途径分流最终导致
副产物生成的分支途径、相应氨基酸自
身被降解的途径、以及那些 提供还原力
和代谢能量的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 9
除了以上这些反映代谢途径基本
信息的资料外，代谢流量的相对固定
的分布以及代谢流量的动力学响应同
样是至关重要的。这既涉及到中心代
谢途径（提供碳架物质、还原力及代
谢能）的代谢流的定量分析，又涉及
到特定氨基酸专用的合成途径的代谢
流的定量分析。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 10
此外，基质吸收和目的产物输出等
有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产
也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般
工业微生物基质吸收方面的知识是相当
欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近
年才受到关注。方向性的跨膜反应的机
理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等
方面的知识对于理解氨基酸生产过程也
是相当重要的。
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我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的
代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量
分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生
物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输
送方面为数不多的研究工作，以及这方面
研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。
在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的
微生物代谢设计的新进展和新方法。
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1,氨基酸生产的代谢基础
2,氨基酸生物合成的代谢流量
分析
3,基质的跨膜吸收与氨基酸的
跨膜输出
4,氨基酸生产的代谢设计
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1,氨基酸生产的代谢基础
1.1 氨基酸的生物合成
1.2 代谢产物生产的生理学
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 14
1,1 氨基酸生产的代谢基础
氨基酸的生物合成涉及以下 5个方面：
（ 1）基质吸收；
（ 2）进入中心代谢途径前的准备途径；
（ 3）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨
基酸的前体化合物）、还原力（如 NADPH、
NADH ） 和代谢能（ ATP 和磷酸烯醇式丙
酮酸等）；
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（ 4）通过同化（ 合成） 途径将碳
架化合物转化成目的氨基酸，此过
程涉及到还原力与代谢能的供需平
衡，同时也涉及主要载流途径与分
支途径之间的关系；
（ 5）目的氨基酸的跨膜输出等；
（ 6）目的产物进一步代谢的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 16
谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成
是研究得最为广泛的。 图 2 列出了
谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物
合成相关的途径及重要步骤的代谢
调节情况。
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基质
基质
异化途径
同化途径
氨基酸
副产物
降解途径
氨基酸
全
局
调
节
系
统
跨膜吸收
碳架、还原力、代谢能
跨膜输出 重吸收
反馈
调节
图 1,微生物细胞合成氨基酸的
相关途径及代谢调节示意图
其中，各相关酶及
途径水平上的代谢调节，
以及整个细胞水平上的
全局调节对于代谢流的
导向和改造是至关重要
的。对微生物整个代谢
网络进行有目的的改造
和设计涉及到大范围的
遗传改造。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 18
该同化（合成）途径通过草酰乙酸
（ OAA） 与中心代谢途径相接，天冬氨
酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回
补途径及 TCA 环的草酰乙酸,进入合
成途径并在天冬氨酸 -β- 半醛（ ASA）
处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另
一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸 ）
及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天
冬氨酸激酶（ AK ）,其他重要的酶包
括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸
脱氢酶（ TDH）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 19
再往后的流量控制点是是通往赖
氨酸 DDP合酶（见图中 DHDPS） 以
及赖氨酸的需能输出。要获得令人满
意的结果，必须全面考虑这些方面，
仅仅对于个别反应（即便是最重要的
调控点）进行改造并不是理想的方法，
Broer 等曾将脱敏的 AK 的基因导入
野生菌中进行表达，但并未获得很令
人满意的赖氨酸产量。
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该途径上另一值得关注的
特征是从六氢吡啶二羧酸出发
合成二氨基庚二酸的旁路途径
的出现，借助于 NMR 手段已
经得知，旁路的出现依赖于某
些代谢条件，特别是可利用的
NH4+的存在。
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另一个重要的方面是参与特定
氨基酸合成途径及与之相关的其他
代谢途径的 酶的调节特性,包括酶
活力的调节和酶的表达的调节。特
别是必须详细研究中间产物或终端
产物对途径起点或分支处的关键酶
的调节。
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图 2.天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节,
(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏 )I R
缩写符号：
ASA为天门冬氨酸 -β-半醛,
Hse 为高丝氨酸,
SucAKPA为琥珀酰二氨
基庚二酸； AK为天冬氨
酸激酶, DHDPS为二氢
吡啶二羧酸合酶, HDH
为高丝氨酸脱氢酶, HK
为高丝氨酸激酶, TDH为
苏氨酸脱氢酶, AHAS为
乙酰羟酸合酶； PEPS为
PEP合成酶, PK为丙酮
酸激酶, PC为丙酮酸羧
化酶, OAADC为草酰乙
酸脱羧酶, PEPC为 PEP
羧化酶, PEPCK为 PEP
羧激酶 。
PYR
AcCoA
OAA
TCA
CTA
HDH
hom
DHDPS
dapA
Asp
Asp-P
AK
lysC
ASA Hse
I
Met
DDP
SucAKPA
DAP
Lys
HK
thrB
Ile
Thr
TDH
ilvA
AHASilvBN
I
Thr
Lys
IThr
Met R Met R
Ile,Leu,Val RIle I
Ile I
EMP
PEP
PEPC
PEPCK PCOAADC
PK
PEPS
Glc G6P
PTS奇异三角区
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 23
要想根据细胞粗提取液的测定
结果对这些酶的调控性质做出适当
的解释是靠不住的。 这一方面是因
为它们在这些条件下可能不稳定；
另一方面，对于需要什么样的辅因
子才能保持它们的活性或（和）它
们在缓冲液中的稳定性，也知之甚
少；而且特别是因为在抽提的过程
中，那些参与胞内酶活性调节的必
需因子会丢失。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 24
谷氨酸棒杆菌中存在 α- 酮戊二
酸脱氢酶便是一例。 人们最初认为
这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。
正因为如此，才出现了这样的假设，
即,TCA 环在该处的中断引起 α-
酮戊二酸的, 溢出,,最终导致
谷氨酸的分泌 。 后来才弄清这个酶
在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，
但是它似乎很不稳定 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 25
另外,在关于代谢流的研究中
有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中 α-
酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了
（ dawn-regulated）,但这在细胞
抽提物中至今不能得到证实。进行
详细的代谢流量（包括相关中间产
物的流量）分析，或许是解决这一
问题的唯一办法。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 26
正确描述代谢网络的主要节点的
调控模式是十分必要的，但常常是十
分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和
磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就
是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中 PEP、
PYR和 OAA所构成的, 奇异三角区,
（ magic triangle） 是研究的热点 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 27
Glc
PEP
PYR
AcCoA
OAA
①
②
③ G6P
Glc
④
⑤
⑥
注：
① PK,
② PC,
③ PEPC,
④ PEPCK,
⑤ OAADC,
⑥ PEPS,
⑦ PTS
奇异三角区
⑦
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 28
PEP通过 PYR和 AcCoA向 TCA
环提供 C2单位，同时,PEP,PYR
以及 AcCoA 还通过回补反应 （ 通
过乙醛酸环）为 TCA环提供重要中
间产物，这些回补反应对于以 TCA
环代谢中间产物 为前体的氨基酸的
生产来说是非常必要的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 29
该区包含可能有多达七个酶的参与，
其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ PEPC）、
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、
丙酮酸激酶 （ PK ）,草酰乙酸脱羧
酶 （ OAADC ） 和磷酸烯醇式丙酮酸磷
酸转移酶系统（ PTS） 都已得到鉴定，磷
酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ） 已被
假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ） 的存在
已得到代谢流量分析的实验数据的支持。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 30
合成代谢途径通常受反馈抑制和
反馈阻遏的严格调控，比如 图 2 中的
AK,HDH,TDH,AHAS等。 不过，
相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌
中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途
径的调节还是比较简单的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 31
研究表明，仅仅研究与合成途径直
接相关的酶的调节以及还原力和能量的
供给，以及对“瓶颈”处关键酶的 解调
节 或 过量表达 仍是不够的。中心代谢途
径和合成代谢途径，特别是合成代谢途
径，同全局调控机制密切相关，如紧缩
控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、
渗透压调节及生长阶段调节等。这些问
题对于氨基酸的合成非常重要，但对它
们了解得并不多。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 32
氨基酸的生产中经常用到特定
的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，
在分成两支的氨基酸合成途径中，
一个分支途径的终端产物氨基酸的
营养缺陷，通常对另一分支的终端
产物氨基酸的合成起促进作用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 33
(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏 )
图 3,天冬族氨基酸过量合成的机理
I R
PYR
AcCoA
OAA
TCA
CTA
HDH
hom
DHDPS
dapA
Asp
Asp-P
AK
lysC
ASA Hse
I
Met
DDP
SucAKPA
DAP
Lys
HK
thrB
Ile
Thr
TDH
ilvA
AHASilvBN
I
Thr
Lys
IThr
Met R Met R
Ile,Leu,Val RIle I
Ile I
EMP
PEP
PPC
PCK PCODC
PK
PPS
Glc G6P
PTS比如图 3 中，谷
氨酸棒杆菌中高
丝氨酸缺陷或苏
氨酸缺陷的赖氨
酸生产菌株，大
肠杆菌中甲硫氨
酸缺陷、二氨基
庚二酸缺陷或异
亮氨酸缺陷的苏
氨酸生产菌株。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 34
另一方面，某些化合物 对菌
体生长的限制,不论是氨基酸或
其他化合物（ 比如磷酸盐 ）,都
可能成为有利于特定生物过程的
最优控制的技术条件。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 35
尽管连续培养得到的结果表
明，赖氨酸的生成是与细胞的生
长是相关联的。但 在 有效分泌 的
生理条件下，氨基酸生产菌一般
都处于生长受限制的状态。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 36
然而，对于与生长限制相关的中心
代谢（ central metabolism ） 和外围代
谢（ peripheral metabolism） 的改变如
何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；
这或许与影响到许多不同的基因和操纵
子的调节网络 （ regulatory networks )
的作用有关。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 37
谷氨酸的生产可以建筑在完全
不同的细胞代谢态势下。许多方法
可诱导其分泌，包括生物素饥饿法
（用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌
是生物素缺陷型）、添加胺类表面
活性剂、在菌体生长期添加青霉素、
甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件
下生长等。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 38
很显然，所使用的这些
方法都对细胞质膜或细胞壁
有一定影响，但使细胞膜通
透性发生变化的机理是不完
全一样的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 39
谷氨酸的分泌曾被认为是因为相
对简单和直接的代谢改变（即影响细
胞膜性质）的而引起的，然而最近发
现在没有紧缩效应的大肠杆菌（ rel A
基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可
以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分
泌活性，这表明全局调节机制对分泌
的影响是存在的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 40
1.2 氨基酸生产的微生物生理学
对于经氧化还原过程实现氨基酸
生产的重要性，早有所认识。但对其
中大多数现象（至少在分子水平上）
仍未很好理解。对一般的代谢调节现
象做如下五点概述，可能将有利于我
们从生理学的角度去理解代谢中间产
物的生产。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 41
（ 1） 氨基酸的生产与菌体生长之间
的关系尚未解决（耦合与否？）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 42
（ 2） 限制生长条件下的微生物生理。
在缓慢生长或非生长条件下，有目的
地控制基质的吸收与代谢的速率，能
提高发酵工业生产效率。因此，要用
分子技术或生化技术对此进行深入细
致的研究，以阐明在限制生长条件下，
微生物的生理背景同工业生物过程的
应用必定密切相关的道理。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 43
（ 3）溢出代谢的概念,当这个生
理学的新见识同过量生产的特定代
谢条件，在分子水平上发生相互关
联的时候，溢出代谢（ overflow
metabolism） 的概念是值得关注的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 44
例如，在过量生产某种产物的代谢
条件下，已观察到某些特有的代谢中间
产物，如 丙酮酸,α- 酮戊二酸 等，会
大量分泌。这些特定的代谢中间产物先
在细胞内累积（这取决于碳源的性质和
生长限制），然后分泌到细胞外（如果
细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机
构或有输送系统存在），从而 抵消在碳
架物质、还原当量和代谢能等在代谢中
的不平衡。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 45
（ 4）代谢不平衡,细胞的代谢不平衡指碳
架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量
的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到 溢
流阀 （ overflow valves ） 的功能。事实上，
代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下
（如大量氨基酸的过量合成 ）得以维持，
是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和
代谢能限制的条件下 ） 耦合在一起的代谢
流 脱钩 的灵活性 。 好几个术语，如, 解耦
联,、,代谢能溢出, 等就是用来说明
这种灵活性的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 46
实际上，曾有人这样描述过细
菌的这种行为：,可以推断，细菌
对于代谢能过剩的解决办法是把它
浪费（用）掉,。然而，对特定条
件下（如与不生长发生耦合或耦合
欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢
能耗散的机制，尚待进行深入的研
究。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 47
在细菌中存在很多能够浪费代
谢能的反应和反应组合。如 K+ 离
子或 NH4+ 的无效循环，（在某些
情况下也会发生）质子的无效循环。
这样的代谢能溢出反应表明,合成
代谢与分解代谢之间存在不平衡,
而这正是氨基酸生产菌种所希望得
到满足的条件。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 48
其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨
酸生产的能量溢出问题已有过争论，
赖氨酸生产的最大转化率可能受到过
量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的
高度增加使代谢发生改变，引起代谢
能的过剩。因此，可以认为 高的能量
耗散能力适合于代谢中间产物（如氨
基酸）的过量合成 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 49
（ 5）有关渗透适应性问题：
在分批培养的条件下，醪液中溶
质（碳源和能源）的浓度会发生很大
的变化，那么了解和控制有关渗透适
应性的代谢过程显然就相当重要了。
细胞外部渗透压（实际上是水活度）
的改变不但对细胞的代谢，而且对基
质的吸收、产物的释放都会产生有效
的影响。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 50
关于真细菌这方面的基本机制的
研究，可能促使我们去选育已丧失以
下两种能力的菌株：
一是丧失对不利于生产的渗透保
护物质（如海藻糖）的合成能力；二
是丧失对代谢和输送反应做出渗透压
响应的能力。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 51
2,氨基酸生物合成的代谢流量分析
除了代谢途径及其调节机制和
已知途径的化学计量分析以外，稳
态代谢流量和流量动力学分析对于
理解氨基酸生产的代谢网络也越来
越重要。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 52
这既涉及到提供碳架物质, 氧
化还原当量和代谢能的中心代谢途
径，也涉及到那些通往特定氨基酸
的合成代谢途径。代谢流量分析和
代谢流的动力学分析的一个主要目
的在于鉴定代谢网络中所一般认为
的限速步骤。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 53
CO
2N A D P
+
N A D P H
+
N A D P
+
N A D P H
+
6 - P - G
F - 6 - P
F D P
D H A P G A - 3 - P
1,3 - 2 P - G A
3 - P - G A
2 - P - G A
PEP
PYR
A c C o A
C T A
S C A
O AA
I C A
α - K G
S c C o A
F M A
M L A GOA
G l c
G 6 P
6 - P - G A R u - 5 - P
X - 5 - P R - 5 - P
E - 4 - P
S e d - 7 - P
P R P P
U M P
C T P
d T M P
A M P
G M P
D N A,R N A
A T P
P R - A T P
P R - A M P
BBM Ⅱ
BBM Ⅲ
I G P
P R A I C
I A P
HP
H O L
His
I
G l u
α - K G
H
2
O
Pi
H A L
N A D
+
N A H D
+
N A D
+
N A H D
+
G l n
G l u
G l uα - K G
N A D P H
+
NH
3
A T P
A D P
A D P
A T P
N A D P H
+
N A D P
+
Pi
A T P
A D P
N A D
+
A sp
G l u
A r g
P r o
CHO
T r p
P R P P PPi
S e r
G lu
P R E B T y r
P h e
G lu
G lu
S e rC y s
S
2-
SO
4
2-
A l a
G l u
GOAG l y
A M P
G M P
P R P P
F i g, M e t a b o l i c P a t h y w a y s f o r t h e B i o s y n t h e s i s o f A m i n o A c i d s
F A D H
2
N A D H
+
G T P
CO
2
N A D H
+
N A D H
+
CO
2
His
E
D A H P
G l c
PE PPY R
ASA
A T P
A D P
A sp - P
N A D P H
+
N A D P
+
DDP
N A D P H
+
N A D P
+
H se
T h r
I l e M e t L y s
I
D A PH 4 D
S C A G l u α - K G
N A D P H
+
NH
3
S C A C O
2
L y s
E
O r n
Cit
G lu
A s p
α - A L α - O I V A V a l
G lu
N A D P H
+
N A D P
+
A c C o A
Leu
G lu
H
2
O
pps p y k F
ppc p c k
pc
odc
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 54
主要可通过两种不同的方法定量地、
完整地描述细胞的代谢网络：
（ 1）描述各步反应（酶）的动力学属
性及其他有用数据的方法；
（ 2）直接测定基质、产物及一些代表
性中间产物的方法，如物料平衡 （ 代
谢物平衡）技术。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 55
如果要对代谢网络做出完整描述并
且对各步反应及其代谢物流量的重要程
度做出评价，就要弄清每一个酶的的调
节（包括对酶的活性的调节和对表达水
平的调节）情况，这当然是不容易如愿
的，但已被实践证明，以下简化的策略
也可以用来对代谢流进行定量的描述。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 56
第一种方法，在某些场合下用代谢
控制理论来对有关生物技术学的研究进
行反应动力学的分析。其基本原理就是
分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢
流量及代谢物浓度的影响，进而确定特
定的流量控制系数 （ flux control
coefficients ）,该系数反映特定反应对
复杂途径的影响程度。另一种更常用的
理论是生化系统理论（略）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 57
第二种方法，代谢物平衡技术。
其模式的推导建立在对基质、产物及
某些重要中间产物的直接测定上。这
种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖
氨酸的研究中得到了应用。如果所研
究的代谢网络的途径结构已知，又假
定进行稳态代谢，那么就可通过准确
测得的所有进出细胞代谢流的流量，
推导出特定途径的代谢流量分布。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 58
但用这类方法计算，很难把代谢
环路（ 如 TCA环 ）、重要节点（ 如
PYR,PEP 节点 ）,以及平衡反应
（酶促反应的正向和逆向流量）的特
殊重要性包罗在内。这是这类方法的
局限性。为了弥补这种局限性，近年
已有几种技术用到这种类型的分析中
去了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 59
如采用示踪流量实验（ tracer
flux experiments ） 技术、快速取
样技术及核磁共振（ NMR） 技术
可获得关于代谢流分布的另外一
些信息,如代谢网络的有关组成
部分中的流量分布,胞内不同代
谢产物的累积量,以及它们各自
随时间而变化的情况。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 60
有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长
期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷
氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内
代谢流的不同分布情况（ 下图），它们
以 13C 标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，
然后运用 NMR 测定标记了的代谢物，同
时运用质量平衡法进行计算，得到了图中
的流量分布图，或称 代谢断面 （ sections
of the metabolism ） 图 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 61
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A ACO
2
GOA
B i o m ass
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
1 0 0
59
40 7
33
85
21
7
1
35
18
10
( 6 0 )
14
￡ ? 1
54
36
133
A,?? êy éú 3¤?ú
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A A
CO
2
GOA
B i om a s s
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
10 0
52
47 8
39
89
8
2
1
34
18
16
( 80 )
6
￡? 1
53
35
21
5
L y s
CO
2
12
16
24
4
B, àμ °±?á éú 3é ?ú
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A ACO
2
GOA
B i o m ass
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
1 0 0
83
17 3
14
97
0
0
0
32
21
33
( 2 5 )
0
￡ ? 1
64
43
4411
C, 1è °±?á éú 3é ?ú
G l u
55
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 62
由图可见，在不同条件下，
流量发生了显著的变化。酵解途径
的 HMP 旁路的流量分布在赖氨酸
生成时增加，而在谷氨酸生成时则
下降。在氨基酸分泌的情况下，回
补反应变得更重要一些。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 63
另一个长期以来不能确定的
问题也在研究中得到了解决，也
就是氨基酸生成条件下 GOA 环
活力的问题，在氨基酸生成条件
下,GOA 环的活力实测是非常
低的。
下图为在 不同转化率时的理
论流量分布图 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 64
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
15
11
83
79
8
2
100
5
15
30
33
17
3
3
115
85
20
A, 平衡生长
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
6
94
99
10063
35
128
128
35
B,Y
Ly s / Glc
= 3 5 %
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
150
-5 0
75
100-2 5
75
0
0
75
C, Y
Ly s / Glc
= 7 5 %
CO2 CO2 CO2
5 125
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 65
课外学习参考资料：
Metabolic Pathway Synthesis (p288)
Metabolic Flux Analysis (p309)
in Metabolic Engineering,1998
Metabolic Flux Balance Analysis (p13)
in Metabolic Engineering,1999
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 66
3,基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出
基质的吸收和产物的输出对于氨基
酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，
特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制
已作了详尽的研究，但对于其它生物工
程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗
糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关
于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细
胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 67
近年的研究表明，在氨基酸生产
的条件下,,氨基酸被动扩散跨过
细胞质膜, 这一设想是武断的。谷
氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、
异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中
谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的
输送过程，而且不纯粹是被动的。而
运动发酵单胞菌（ Zymomonas mobilis）
的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单
扩散机制来分泌。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 68
详细了解特定氨基酸跨过细胞质
膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过
程的效率和转化率也非常重要。尽管
采用细菌来生产氨基酸往往可以获得
极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未
意识到这至少部分是由于细胞向载体
系统所催化的分泌反应提供了代谢能
的结果。这一点已被有关赖氨酸和异
亮氨酸分泌的研究所证实 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 69
下图显示了谷氨酸棒杆菌在
异亮氨酸生产过程中发生的不同
流量。所观察到的异亮氨酸的净
产量实际上是借助于载体而形成
的向外分泌的流量、向内吸纳的
流量及扩散流量的代数和。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 70
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 71
在分批发酵的开始阶段，异
亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随
着胞外异亮氨酸浓度的增加，其
扩散方向也发生改变，并越来越
多地抵消异亮氨酸载体系统的分
泌作用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 72
这一方面解释了所能获得的最
大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜
的透性常数，以及分泌和吸收载体
的活力；另一方面，由此可看出在
生产条件下可能发生 由代谢能驱动
的分泌与被动回流构成的无效循环
是浪费代谢能的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 73
一般说来，抵消氨基酸的产量的
氨基酸的吸收系统对于整个过程并不
重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，
吸收系统的活力非常低。最近发现，
芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的
结果是相应氨基酸的吸收的增加，实
际上产物的转化率降低了。总之，深
入了解氨基酸吸收和分泌的能学及调
控的机理对于定量地理解氨基酸的生
产过程是极为重要的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 74
在进行包括输送途径的代谢流
量的详细分析时，特别是在比较野
生株和生产菌株，或特定菌株在生
产或非生产条件下的性质时，已引
出了几个重要的概念。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 75
单靠,瓶颈, 酶的过量表达并不
能获得理想的高产结果,在通常情况下，
仅仅是从基质到产物整条途径的某
,瓶颈, 酶的过量表达并不能获得理
想的高产结果。对生产菌株的分析表明，
为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地
分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。
只有当一系列酶发生了协调的改变，才
能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或
积压，避免代谢不平衡或不必要的副反
应 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 76
用谷氨酸棒杆菌、大肠
杆菌和酵母菌进行了有关芳
香族氨基酸的成功的研究。
关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆
菌的代谢途径工程研究的成
果已见发表 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 77
为提高色氨酸的产量, 已对谷氨
酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的
遗传调节, 包括：色氨酸操纵子 （ 已
被解除调节的 ） 的基因的过量表达,
去除调节子及弱化序列的控制；切断
通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路, 增加
前体物如 PEP,E-4-P和丝氨酸等的供
应, 破坏色氨酸酶的降解色氨酸的活
性等等 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 78
HMP
EMP
PEP E4P
DAHP
莽草酸
分支酸
预苯酸邻氨基苯甲酸
Phe Tyr
Trp
PRPP
Ser
降解产物
大肠杆菌中色
氨酸合成途径
的简图
该图略去了酶活
力及基因表达水
平上的调控机制，
实际上在生产菌
株中，这些调控
机制都已被解除。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 79
虽然一般用于芳香族氨基酸生产
的微生物并不是酿酒酵母，但在概念
探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物
合成的研究是引人关注的。实验结果
表明，即使在无分支的途径中，想靠
单个酶,上调（ up-modulation）,，
增加整条途径的流量往往是无济于事
的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 80
正如基于流量控制理论的理
论解释, 只有几种酶活性协同地提
高, 才有可能大幅度增加流向色氨
酸的全程的流量 。 这个发现为许多
途径中的关于, 分摊式的代谢控制
（ distributive metabolic control）,
的更加笼统的描述提供了支持；同
时也 对仍在广泛使用的代谢途径的
所谓, 瓶颈, 识别方法做出了一个
重要的限制 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 81
4,氨基酸生产的代谢设计
氨基酸生产上广泛使用棒状
杆菌, 这一方面有历史的原因；
另一方面, 与其他微生物如大
肠杆菌相比较, 棒状杆菌在工
业生产上具有明显的优势 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 82
棒状杆菌的代谢调节相对简单。
肠道细菌中特定反应的酶及特定基质
的载体系统具有多重性，而棒状杆菌
中则没有；棒状杆菌的代谢调控模式
也比大肠杆菌要简单得多。然而，利
用肠道细菌进行氨基酸菌种的育种的
优势则在于可以方便地应用成熟的现
代 DNA 重组技术，有效地进行氨基
酸生产菌种的改造。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 83
针对于不同的目的和不同水平的复
杂性，在考虑代谢设计的策略时应区别
对待。
代谢设计的目标在于：
（ 1）提高已建立的途径或过程的效率；
（ 2）将代谢流导向至新插入的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 84
第一个目标可通过多种手段来实现：
①扩展基质利用的范围
②改善生长条件；
③增大通往特定氨基酸合成途径的代谢流；
④调大通往目的产物的支路和调小通往副
产物的支路。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 85
这些对关键酶的活性或
调节机制的改良可大大增加
最终要被分泌的终端产物氨
基酸的胞内浓度。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 86
第二个目标即引入新的途径，
以便在不同的代谢期合成新的产
物。可通过类似但不同的方法来
实现：
①延长特定的代谢途径；
②引入新的代谢分支途径；
③从特定生物引入的全新的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 87
尽管谷氨酸棒杆菌中通往赖
氨酸的流量控制点主要分布在天
冬氨酸激酶,DDP合成酶和赖氨
酸分泌系统，但如果考虑到通往
苏氨酸和异亮氨酸的途径，情况
就更加复杂了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 88
十多年前，曾有人做过把谷氨
酸棒杆菌中碳架流导向苏氨酸的开
创性研究，其方法是扩增苏氨酸合
成途径起始端的两个酶高丝氨酸脱
氢酶和高丝氨酸激酶的基因（ hom
和 thrB ）,以及解除对高丝氨酸
脱氢酶的反馈调节。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 89
最近有一项有启发性的研究将一株
赖氨酸的生产菌株（出发菌株）逐步转
变为苏氨酸生产菌株，其方法是将突变
株的 hom - thrB 操纵子（指为已解除
调节的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶
编码的操纵子）不同拷贝数整合到出发
菌株的染色体 DNA上。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 90
尽管出发菌株可有效地分泌
赖氨酸及少量的甘氨酸，但当整
合到染色体 DNA 上的 hom-thrB
操纵子的拷贝数为 1～ 3时，苏氨
酸的分泌量则显著增加，同时赖
氨酸的产量则下降了原来的四分
之一。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 91
如果以该苏氨酸生产菌株作
为出发株, 也同样可采用类似
的策略将解除调节的苏氨酸脱
水酶和乙酰羟酸合成酶 （ 从苏
氨酸到异亮氨酸的合成途径的
第一和第二个酶 ） 引入异亮氨
酸的合成途径 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 92
以前，此类研究的主要目标就是鉴
别被认为必须改变或绕过的所谓的
,瓶颈反应,。对于第一步反应受到
反馈调节的某些合成途径，这一方法的
确有效。并且，这一方法是运用代谢撷
颃物（如合成途径的终端产物氨基酸的
结构类似物）成功地实现育种策略的基
础。这些代谢撷颃物的抗性突变株的突
变，常常是发生在一个反馈调节的主要
反应步骤（一般被叫做“代谢瓶颈”）
所对应的基因上。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 93
最典型的例子当属针对谷氨
酸棒杆菌赖氨酸合成途径中的天
门冬氨酸激酶的工作。赖氨酸生
产菌种一般是赖氨酸的结构类似
物 AEC（ aminoethyl cystein） 的
抗性突变株。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 94
然而分子水平的实验证实，即便是
在这种情况下，这种简单的方法仍不能
导致赖氨酸的高效合成。显然,通过随
机诱变和筛选所得到的高产菌株，其代
谢网络已发生了许多改变 。从很多例子
都可推断,单单改变某一, 重要的,
步骤（“瓶颈”）并不一定能实现氨基
酸的过量合成。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 95
因为对于长而复杂的代谢途径
而言, 绝对的单个限速步骤几乎是
不存在的 。 换言之, 整条途径在代
谢网络范围内已经是调整好了的,
,分摊式的代谢调控, （ 整条途径
上的代谢调控实际上是由许多个步
骤共同分担 ） 的发现也说明了这个
问题 。 这对于有目的的代谢设计是
有重要意义的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 96
仅仅提高合成途径的流量
往往并不足以将代谢流导向特
定氨基酸，实现特定氨基酸的
过量合成。为了增加氨基酸的
生产,增加关键前体物的供应
量也是十分重要的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 97
关键前体物的供应 可通过中间代
谢的反应 （如 TCA 环的回补反应支
持 TCA 环中间产物的供应,EMP 途
径和 HMP 途径分别为芳香族氨基酸
的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和 4 - 磷
酸赤藓糖 ）, 或者在培养基中额外
添加特定前体物供微生物细胞吸收和
利用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 98
当对合成途径进行修饰或导向时，
中心代谢途径的反应出乎意料地成了限
制因素；这一点再次强调了细胞代谢通
常已得到有效的调节，这也就意味着 许
多不同反应之间的最佳平衡和秩序井然
的分摊式控制覆盖了代谢网络的大部分。
只有当合理延伸的代谢网络片段以一种
协调的方式得到有目的的改变时，代谢
流大规模的导向才能最终导致最优的结
果。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 99
总体来说，副产物的形成
可以通过两种策略来避免：
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 100
最有利的方法是充分地调动所研究
的途径，这样就不会形成大量通往副产
物的中间产物了；另一种方法是使从目
的氨基酸的合成途径分出通往副产物合
成的分支的第一个酶失活。前文所述的
在生产色氨酸的大肠杆菌菌株中，去除
色氨酸酶，就是这一策略的一个成功应
用；这样就堵死了色氨酸过量合成条件
下色氨酸的主要消耗。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 101
当引入新的途径或者改变
已建立的代谢途径上代谢流的
流向时，除了要考虑碳架流，
还考虑氧化还原平衡和代谢能
平衡。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 102
对氨基酸产生菌的代谢途径的大
规模导向会出现一些问题。实际上，
一般氨基酸的分泌，特别是 谷氨酸棒
杆菌中谷氨酸的分泌被解释为氧化还
原作用失去平衡的结果,谷氨酸的分
泌在供氧条件的试验过程中，观察到
一个明显最佳状态。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 103
在谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸
或谷氨酸的条件下，不仅碳架流
会发生较大的变化，糖酵解途径
（产生 NADH） 和磷酸戊糖途径
（产生 NADPH） 间的 流量分配
也必定会发生巨大的变化 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 104
此外,从理论上推测谷氨酸棒
杆菌赖氨酸最大产量的获得在很大
程度上依赖于细胞的 NADPH 的水
平。 然而，曾尝试过确定赖氨酸生
产条件下 NADPH 的真实化学计
量，并尝试将其同其他合成反应进
行比较，结果惊奇地发现 NADPH
是大大过量的，这一点至今还无法
解释。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 105
这些结果再次强调还原
力定量分析的重要性，其对
于氨基酸生产菌株总体流量
的进一步优化，也具有潜在
的重要性。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 106
关于代谢能平衡的量化问题，
就目前而言，几乎还是空白。在
氨基酸生产方面，因为关于还原
力平衡的问题已有一些讨论，能
量平衡问题就常常被忽略。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 107
除了 ATP 的形成过程和已知的
ATP消耗过程之间的不平衡，氨基酸
过量合成显然远非仅仅与能量的输入
和输出的“偶联”或“赢利”。如上
所述,代谢能的重大消耗一般都能观
察到，这种损耗一方面甚至会限制产
物对基质的转化率，另一方面也可能
是增加特定产物分泌的基础。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 108
氨基酸的过量生产可由两种不同
的代谢状态引起。诸如赖氨酸、异亮
氨酸、苏氨酸及芳香族氨基酸等可通
过解除合成途径的调节来实现过量分
泌；而谷氨酸的分泌在许多细菌中则
是对环境压力的响应。因此，如上所
述，这两种情况下的研究策略也是不
同的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 109
要改善氨基酸的生产，除
了碳架流方面以外，在还原力
控制和能量代谢方面还有很多
工作等待着我们去做。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 110
目前的研究越来越多地把兴
趣放在跨膜输送反应上，包括对
可能限制氨基酸生产的营养因子
的吸收，以及作为工艺控制中重
要一步的终端产物的分泌。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 111
氨基酸分泌系统的存在，以及
其生理重要性，直到最近才得到阐
明。这为氨基酸生产菌株的改良开
创了一块全新的领域。 这一研究方
向可纳入目前的研究热点，也就是
对各种反应进行流量分析，包括底
物吸收、中心代谢途径、合成途径，
以及产物输出。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 112
在这些分析中，我们将实现概念
上的转变，也就是从描述性数据 ——
例如细胞抽提物中有关酶的活力或底
物、产物和副产物浓度的测定 —— 到
稳态流量数据的分析和动力学性质的
描绘的转变。这就意味着 要研究流量
的分布、指定的网络、被微调的酶在
代谢网络中活性的微妙的变化。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 113
为了了解原始生理背景下的
代谢反应，以及在正常条件下这
些反应对细胞的重要性，还要求
实现另一个转变，也就是 由对微
生物细胞输入和输出的平衡数据
的测定和采集（测定细胞外培养
基中的浓度），转变为获取胞内
的定量信息。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 114
当然，这同时也意味着需要
有新的分析方法。胞外和胞内代
谢物浓度的区别应该是可靠的，
这需要靠有效的终止步骤来实现
胞内外组分快速和定量的分离,
也需要灵敏的分析方法来测定尽
可能多的 胞内代谢物 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 115
目前研究的另一方面是,将大
肠杆菌和酿酒酵母中已经非常成熟
的分子生物学工具,应用到工业微
生物尤其是格兰氏阳性菌中,如谷
氨酸棒杆菌。 遗传的成功改造通常
会受到异种 DNA引起的重排和丢失
的限制,以及细胞的有效的制约系
统的限制。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 116
近年谷氨酸棒杆菌基因工
程的一些主要工具已经构建。
前几年开始研究一种可靠的转
座子诱变，这种重要的工具在
谷氨酸棒杆菌中仍未建立起来。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 117
传统的菌种改良方法同现代,代
谢设计,方法相比较，在许多方面仍
具有竞争力。但随着我们对代谢及分
子遗传学工具等方面认识的加深，有
目的的代谢设计必然成为菌种改良的
主要方法。 在详细地了解细胞的代谢
网络及代谢调控的基础上，代谢途径
的构建和代谢流的导向都将成为现实。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 118
从以下三个方面分析：
1.麦汁成分； 2.菌种； 3.生产工艺。
根据细胞经济假设灵活应用五字策略
AAs
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 119
啤酒酵母酿造啤酒的代谢亚网络
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 120
与其愁，不如做。
做中学，学中做。
勤总结，常修正。
心要平，步要稳。
目标明，事必成。
研究氨基酸生产
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 2
前 言
对微生物的代谢途径及代谢网络进行
有目的的改造从而提高氨基酸的产量仍然
是现代生物工程学的一个主攻目标。为了
攻克这个目标，就有必要对尚待进一步完
善的细胞生理学、生物化学、分子生物学
及生物过程工程等学科的基本状况做一番
描述，主要有如下几个话题,
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 3
①与生物工程相关的氨基酸产生
菌的相关途径的研究进展情况，
其中必须包括这些途径的 代谢调
节以及细胞的整个调节网络 的研
究进展情况。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 4
②对所有的相关途径进行详细的 代谢流
量分析 。这涉及到基质进入细胞的碳架
物流量，流经向心途径、中心代谢途径
和离心途径的碳架物流量，以及代谢中
间产物流出细胞的 碳架物流量 （ the
central and peripheral carbon fluxes）。
还原力的流量 （ redox flux ） 及 能量流
量 （ energy flux）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 5
③以协调和调节的方式 对碳架流、氧
化还原反应的电子流、能量流进行导
向,以提高基质的吸收能力, 限制前
体物向支路途径的流量、减少中间产
物的积累及副产物的形成，还要绕过
氧化还原平衡及能量平衡中可能出现
的难题。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 6
传统的设计育种（ 随机诱变加定
向筛选），以及 DNA重组技术在设计
育种中的应用已经大大提高了 微生物
对氨基酸的生产能力,但人们对于氨
基酸产生菌的 生理学 与 生物化学 等 主
要领域的基础知识还相当匮乏。
目前可从以下几方面理解氨基酸
的代谢基础：
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 7
①具有生物工程学重要性的微生物的
基本代谢途径 及其对应的 酶的性质 ；
②酶及其 调节方式,途径及其调节方
式；
③中心代谢途径及离心途径代谢 流量
的定量分析 ；
④对 跨膜传送 （基质吸收和产物分泌）
的详尽的了解。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 8
目的产物的合成途径是理解氨基酸
生产的前提和核心内容 。相关的代谢途
径不仅包括那些直接导致某特定氨基酸
的合成的专用途径，也包括提供前体碳
架物的途径、从专用途径分流最终导致
副产物生成的分支途径、相应氨基酸自
身被降解的途径、以及那些 提供还原力
和代谢能量的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 9
除了以上这些反映代谢途径基本
信息的资料外，代谢流量的相对固定
的分布以及代谢流量的动力学响应同
样是至关重要的。这既涉及到中心代
谢途径（提供碳架物质、还原力及代
谢能）的代谢流的定量分析，又涉及
到特定氨基酸专用的合成途径的代谢
流的定量分析。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 10
此外，基质吸收和目的产物输出等
有方向性的跨膜反应对于氨基酸的生产
也是极其重要的。除大肠杆菌外，一般
工业微生物基质吸收方面的知识是相当
欠缺的。氨基酸跨膜输出的研究领域近
年才受到关注。方向性的跨膜反应的机
理、微生物能学及氨基酸分泌的调节等
方面的知识对于理解氨基酸生产过程也
是相当重要的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 11
我们将一起回顾发酵法生产氨基酸的
代谢基础的建立过程，一起讨论代谢流量
分析对于了解细胞生理的意义和氨基酸生
物合成的代谢工程，还将一起讨论跨膜输
送方面为数不多的研究工作，以及这方面
研究对于微生物过量合成氨基酸的意义。
在此基础上，讨论以氨基酸为目的产物的
微生物代谢设计的新进展和新方法。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 12
1,氨基酸生产的代谢基础
2,氨基酸生物合成的代谢流量
分析
3,基质的跨膜吸收与氨基酸的
跨膜输出
4,氨基酸生产的代谢设计
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 13
1,氨基酸生产的代谢基础
1.1 氨基酸的生物合成
1.2 代谢产物生产的生理学
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 14
1,1 氨基酸生产的代谢基础
氨基酸的生物合成涉及以下 5个方面：
（ 1）基质吸收；
（ 2）进入中心代谢途径前的准备途径；
（ 3）经中心代谢途径产生碳架化合物（氨
基酸的前体化合物）、还原力（如 NADPH、
NADH ） 和代谢能（ ATP 和磷酸烯醇式丙
酮酸等）；
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 15
（ 4）通过同化（ 合成） 途径将碳
架化合物转化成目的氨基酸，此过
程涉及到还原力与代谢能的供需平
衡，同时也涉及主要载流途径与分
支途径之间的关系；
（ 5）目的氨基酸的跨膜输出等；
（ 6）目的产物进一步代谢的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 16
谷氨酸棒杆菌中赖氨酸的合成
是研究得最为广泛的。 图 2 列出了
谷氨酸棒杆菌中天冬族氨基酸生物
合成相关的途径及重要步骤的代谢
调节情况。
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基质
基质
异化途径
同化途径
氨基酸
副产物
降解途径
氨基酸
全
局
调
节
系
统
跨膜吸收
碳架、还原力、代谢能
跨膜输出 重吸收
反馈
调节
图 1,微生物细胞合成氨基酸的
相关途径及代谢调节示意图
其中，各相关酶及
途径水平上的代谢调节，
以及整个细胞水平上的
全局调节对于代谢流的
导向和改造是至关重要
的。对微生物整个代谢
网络进行有目的的改造
和设计涉及到大范围的
遗传改造。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 18
该同化（合成）途径通过草酰乙酸
（ OAA） 与中心代谢途径相接，天冬氨
酸是该族氨基酸的共同前体物。 来自回
补途径及 TCA 环的草酰乙酸,进入合
成途径并在天冬氨酸 -β- 半醛（ ASA）
处分为两条支路，一条通往赖氨酸，另
一条通往苏氨酸、蛋氨酸（ 甲硫氨酸 ）
及异亮氨酸。该途径上主要调控点是天
冬氨酸激酶（ AK ）,其他重要的酶包
括高丝氨酸脱氢酶（ HDH ） 和苏氨酸
脱氢酶（ TDH）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 19
再往后的流量控制点是是通往赖
氨酸 DDP合酶（见图中 DHDPS） 以
及赖氨酸的需能输出。要获得令人满
意的结果，必须全面考虑这些方面，
仅仅对于个别反应（即便是最重要的
调控点）进行改造并不是理想的方法，
Broer 等曾将脱敏的 AK 的基因导入
野生菌中进行表达，但并未获得很令
人满意的赖氨酸产量。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 20
该途径上另一值得关注的
特征是从六氢吡啶二羧酸出发
合成二氨基庚二酸的旁路途径
的出现，借助于 NMR 手段已
经得知，旁路的出现依赖于某
些代谢条件，特别是可利用的
NH4+的存在。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 21
另一个重要的方面是参与特定
氨基酸合成途径及与之相关的其他
代谢途径的 酶的调节特性,包括酶
活力的调节和酶的表达的调节。特
别是必须详细研究中间产物或终端
产物对途径起点或分支处的关键酶
的调节。
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图 2.天冬族氨基酸的生物合成及代谢调节,
(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏 )I R
缩写符号：
ASA为天门冬氨酸 -β-半醛,
Hse 为高丝氨酸,
SucAKPA为琥珀酰二氨
基庚二酸； AK为天冬氨
酸激酶, DHDPS为二氢
吡啶二羧酸合酶, HDH
为高丝氨酸脱氢酶, HK
为高丝氨酸激酶, TDH为
苏氨酸脱氢酶, AHAS为
乙酰羟酸合酶； PEPS为
PEP合成酶, PK为丙酮
酸激酶, PC为丙酮酸羧
化酶, OAADC为草酰乙
酸脱羧酶, PEPC为 PEP
羧化酶, PEPCK为 PEP
羧激酶 。
PYR
AcCoA
OAA
TCA
CTA
HDH
hom
DHDPS
dapA
Asp
Asp-P
AK
lysC
ASA Hse
I
Met
DDP
SucAKPA
DAP
Lys
HK
thrB
Ile
Thr
TDH
ilvA
AHASilvBN
I
Thr
Lys
IThr
Met R Met R
Ile,Leu,Val RIle I
Ile I
EMP
PEP
PEPC
PEPCK PCOAADC
PK
PEPS
Glc G6P
PTS奇异三角区
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 23
要想根据细胞粗提取液的测定
结果对这些酶的调控性质做出适当
的解释是靠不住的。 这一方面是因
为它们在这些条件下可能不稳定；
另一方面，对于需要什么样的辅因
子才能保持它们的活性或（和）它
们在缓冲液中的稳定性，也知之甚
少；而且特别是因为在抽提的过程
中，那些参与胞内酶活性调节的必
需因子会丢失。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 24
谷氨酸棒杆菌中存在 α- 酮戊二
酸脱氢酶便是一例。 人们最初认为
这个酶在谷氨酸棒杆菌中并不存在。
正因为如此，才出现了这样的假设，
即,TCA 环在该处的中断引起 α-
酮戊二酸的, 溢出,,最终导致
谷氨酸的分泌 。 后来才弄清这个酶
在谷氨酸棒杆菌中实际上是存在的，
但是它似乎很不稳定 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 25
另外,在关于代谢流的研究中
有迹象表明，在谷氨酸棒杆菌中 α-
酮戊二酸脱氢酶的活性已被调低了
（ dawn-regulated）,但这在细胞
抽提物中至今不能得到证实。进行
详细的代谢流量（包括相关中间产
物的流量）分析，或许是解决这一
问题的唯一办法。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 26
正确描述代谢网络的主要节点的
调控模式是十分必要的，但常常是十
分困难的。谷氨酸棒杆菌中丙酮酸和
磷酸烯醇式丙酮酸节点的复合模式就
是最好的例子。谷氨酸棒杆菌中 PEP、
PYR和 OAA所构成的, 奇异三角区,
（ magic triangle） 是研究的热点 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 27
Glc
PEP
PYR
AcCoA
OAA
①
②
③ G6P
Glc
④
⑤
⑥
注：
① PK,
② PC,
③ PEPC,
④ PEPCK,
⑤ OAADC,
⑥ PEPS,
⑦ PTS
奇异三角区
⑦
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 28
PEP通过 PYR和 AcCoA向 TCA
环提供 C2单位，同时,PEP,PYR
以及 AcCoA 还通过回补反应 （ 通
过乙醛酸环）为 TCA环提供重要中
间产物，这些回补反应对于以 TCA
环代谢中间产物 为前体的氨基酸的
生产来说是非常必要的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 29
该区包含可能有多达七个酶的参与，
其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ PEPC）、
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ PEPCK ）、
丙酮酸激酶 （ PK ）,草酰乙酸脱羧
酶 （ OAADC ） 和磷酸烯醇式丙酮酸磷
酸转移酶系统（ PTS） 都已得到鉴定，磷
酸烯醇式丙酮酸合成酶（ PEPS ） 已被
假定存在。丙酮酸羧化酶（ PC ） 的存在
已得到代谢流量分析的实验数据的支持。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 30
合成代谢途径通常受反馈抑制和
反馈阻遏的严格调控，比如 图 2 中的
AK,HDH,TDH,AHAS等。 不过，
相对于大肠杆菌而言，谷氨酸棒杆菌
中的调节尤其是天冬族氨基酸合成途
径的调节还是比较简单的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 31
研究表明，仅仅研究与合成途径直
接相关的酶的调节以及还原力和能量的
供给，以及对“瓶颈”处关键酶的 解调
节 或 过量表达 仍是不够的。中心代谢途
径和合成代谢途径，特别是合成代谢途
径，同全局调控机制密切相关，如紧缩
控制、营养阻遏、供氧控制、氮源调节、
渗透压调节及生长阶段调节等。这些问
题对于氨基酸的合成非常重要，但对它
们了解得并不多。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 32
氨基酸的生产中经常用到特定
的氨基酸营养缺陷型菌株。一方面，
在分成两支的氨基酸合成途径中，
一个分支途径的终端产物氨基酸的
营养缺陷，通常对另一分支的终端
产物氨基酸的合成起促进作用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 33
(其中 表示反馈抑制； 表示反馈阻遏 )
图 3,天冬族氨基酸过量合成的机理
I R
PYR
AcCoA
OAA
TCA
CTA
HDH
hom
DHDPS
dapA
Asp
Asp-P
AK
lysC
ASA Hse
I
Met
DDP
SucAKPA
DAP
Lys
HK
thrB
Ile
Thr
TDH
ilvA
AHASilvBN
I
Thr
Lys
IThr
Met R Met R
Ile,Leu,Val RIle I
Ile I
EMP
PEP
PPC
PCK PCODC
PK
PPS
Glc G6P
PTS比如图 3 中，谷
氨酸棒杆菌中高
丝氨酸缺陷或苏
氨酸缺陷的赖氨
酸生产菌株，大
肠杆菌中甲硫氨
酸缺陷、二氨基
庚二酸缺陷或异
亮氨酸缺陷的苏
氨酸生产菌株。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 34
另一方面，某些化合物 对菌
体生长的限制,不论是氨基酸或
其他化合物（ 比如磷酸盐 ）,都
可能成为有利于特定生物过程的
最优控制的技术条件。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 35
尽管连续培养得到的结果表
明，赖氨酸的生成是与细胞的生
长是相关联的。但 在 有效分泌 的
生理条件下，氨基酸生产菌一般
都处于生长受限制的状态。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 36
然而，对于与生长限制相关的中心
代谢（ central metabolism ） 和外围代
谢（ peripheral metabolism） 的改变如
何影响氨基酸的有效生成，还不很清楚；
这或许与影响到许多不同的基因和操纵
子的调节网络 （ regulatory networks )
的作用有关。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 37
谷氨酸的生产可以建筑在完全
不同的细胞代谢态势下。许多方法
可诱导其分泌，包括生物素饥饿法
（用于谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌
是生物素缺陷型）、添加胺类表面
活性剂、在菌体生长期添加青霉素、
甘油或脂肪酸缺陷菌株在限制条件
下生长等。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 38
很显然，所使用的这些
方法都对细胞质膜或细胞壁
有一定影响，但使细胞膜通
透性发生变化的机理是不完
全一样的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 39
谷氨酸的分泌曾被认为是因为相
对简单和直接的代谢改变（即影响细
胞膜性质）的而引起的，然而最近发
现在没有紧缩效应的大肠杆菌（ rel A
基因缺损）中，通过氨基酸饥饿法可
以触发细胞的借助于载体的谷氨酸分
泌活性，这表明全局调节机制对分泌
的影响是存在的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 40
1.2 氨基酸生产的微生物生理学
对于经氧化还原过程实现氨基酸
生产的重要性，早有所认识。但对其
中大多数现象（至少在分子水平上）
仍未很好理解。对一般的代谢调节现
象做如下五点概述，可能将有利于我
们从生理学的角度去理解代谢中间产
物的生产。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 41
（ 1） 氨基酸的生产与菌体生长之间
的关系尚未解决（耦合与否？）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 42
（ 2） 限制生长条件下的微生物生理。
在缓慢生长或非生长条件下，有目的
地控制基质的吸收与代谢的速率，能
提高发酵工业生产效率。因此，要用
分子技术或生化技术对此进行深入细
致的研究，以阐明在限制生长条件下，
微生物的生理背景同工业生物过程的
应用必定密切相关的道理。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 43
（ 3）溢出代谢的概念,当这个生
理学的新见识同过量生产的特定代
谢条件，在分子水平上发生相互关
联的时候，溢出代谢（ overflow
metabolism） 的概念是值得关注的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 44
例如，在过量生产某种产物的代谢
条件下，已观察到某些特有的代谢中间
产物，如 丙酮酸,α- 酮戊二酸 等，会
大量分泌。这些特定的代谢中间产物先
在细胞内累积（这取决于碳源的性质和
生长限制），然后分泌到细胞外（如果
细胞具备允许这些代谢中间产物跨膜机
构或有输送系统存在），从而 抵消在碳
架物质、还原当量和代谢能等在代谢中
的不平衡。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 45
（ 4）代谢不平衡,细胞的代谢不平衡指碳
架物质不平衡，特别是指代谢能和还原当量
的不平衡。代谢不平衡的条件常常涉及到 溢
流阀 （ overflow valves ） 的功能。事实上，
代谢网络之所以能够在失去平衡的条件下
（如大量氨基酸的过量合成 ）得以维持，
是因为它具备使通常情况下（指碳架物质和
代谢能限制的条件下 ） 耦合在一起的代谢
流 脱钩 的灵活性 。 好几个术语，如, 解耦
联,、,代谢能溢出, 等就是用来说明
这种灵活性的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 46
实际上，曾有人这样描述过细
菌的这种行为：,可以推断，细菌
对于代谢能过剩的解决办法是把它
浪费（用）掉,。然而，对特定条
件下（如与不生长发生耦合或耦合
欠佳的氨基酸的生产条件下）代谢
能耗散的机制，尚待进行深入的研
究。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 47
在细菌中存在很多能够浪费代
谢能的反应和反应组合。如 K+ 离
子或 NH4+ 的无效循环，（在某些
情况下也会发生）质子的无效循环。
这样的代谢能溢出反应表明,合成
代谢与分解代谢之间存在不平衡,
而这正是氨基酸生产菌种所希望得
到满足的条件。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 48
其实，关于谷氨酸棒杆菌的赖氨
酸生产的能量溢出问题已有过争论，
赖氨酸生产的最大转化率可能受到过
量的代谢能的约束。赖氨酸的合成的
高度增加使代谢发生改变，引起代谢
能的过剩。因此，可以认为 高的能量
耗散能力适合于代谢中间产物（如氨
基酸）的过量合成 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 49
（ 5）有关渗透适应性问题：
在分批培养的条件下，醪液中溶
质（碳源和能源）的浓度会发生很大
的变化，那么了解和控制有关渗透适
应性的代谢过程显然就相当重要了。
细胞外部渗透压（实际上是水活度）
的改变不但对细胞的代谢，而且对基
质的吸收、产物的释放都会产生有效
的影响。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 50
关于真细菌这方面的基本机制的
研究，可能促使我们去选育已丧失以
下两种能力的菌株：
一是丧失对不利于生产的渗透保
护物质（如海藻糖）的合成能力；二
是丧失对代谢和输送反应做出渗透压
响应的能力。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 51
2,氨基酸生物合成的代谢流量分析
除了代谢途径及其调节机制和
已知途径的化学计量分析以外，稳
态代谢流量和流量动力学分析对于
理解氨基酸生产的代谢网络也越来
越重要。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 52
这既涉及到提供碳架物质, 氧
化还原当量和代谢能的中心代谢途
径，也涉及到那些通往特定氨基酸
的合成代谢途径。代谢流量分析和
代谢流的动力学分析的一个主要目
的在于鉴定代谢网络中所一般认为
的限速步骤。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 53
CO
2N A D P
+
N A D P H
+
N A D P
+
N A D P H
+
6 - P - G
F - 6 - P
F D P
D H A P G A - 3 - P
1,3 - 2 P - G A
3 - P - G A
2 - P - G A
PEP
PYR
A c C o A
C T A
S C A
O AA
I C A
α - K G
S c C o A
F M A
M L A GOA
G l c
G 6 P
6 - P - G A R u - 5 - P
X - 5 - P R - 5 - P
E - 4 - P
S e d - 7 - P
P R P P
U M P
C T P
d T M P
A M P
G M P
D N A,R N A
A T P
P R - A T P
P R - A M P
BBM Ⅱ
BBM Ⅲ
I G P
P R A I C
I A P
HP
H O L
His
I
G l u
α - K G
H
2
O
Pi
H A L
N A D
+
N A H D
+
N A D
+
N A H D
+
G l n
G l u
G l uα - K G
N A D P H
+
NH
3
A T P
A D P
A D P
A T P
N A D P H
+
N A D P
+
Pi
A T P
A D P
N A D
+
A sp
G l u
A r g
P r o
CHO
T r p
P R P P PPi
S e r
G lu
P R E B T y r
P h e
G lu
G lu
S e rC y s
S
2-
SO
4
2-
A l a
G l u
GOAG l y
A M P
G M P
P R P P
F i g, M e t a b o l i c P a t h y w a y s f o r t h e B i o s y n t h e s i s o f A m i n o A c i d s
F A D H
2
N A D H
+
G T P
CO
2
N A D H
+
N A D H
+
CO
2
His
E
D A H P
G l c
PE PPY R
ASA
A T P
A D P
A sp - P
N A D P H
+
N A D P
+
DDP
N A D P H
+
N A D P
+
H se
T h r
I l e M e t L y s
I
D A PH 4 D
S C A G l u α - K G
N A D P H
+
NH
3
S C A C O
2
L y s
E
O r n
Cit
G lu
A s p
α - A L α - O I V A V a l
G lu
N A D P H
+
N A D P
+
A c C o A
Leu
G lu
H
2
O
pps p y k F
ppc p c k
pc
odc
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 54
主要可通过两种不同的方法定量地、
完整地描述细胞的代谢网络：
（ 1）描述各步反应（酶）的动力学属
性及其他有用数据的方法；
（ 2）直接测定基质、产物及一些代表
性中间产物的方法，如物料平衡 （ 代
谢物平衡）技术。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 55
如果要对代谢网络做出完整描述并
且对各步反应及其代谢物流量的重要程
度做出评价，就要弄清每一个酶的的调
节（包括对酶的活性的调节和对表达水
平的调节）情况，这当然是不容易如愿
的，但已被实践证明，以下简化的策略
也可以用来对代谢流进行定量的描述。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 56
第一种方法，在某些场合下用代谢
控制理论来对有关生物技术学的研究进
行反应动力学的分析。其基本原理就是
分析酶活力或酶浓度的微量变化对代谢
流量及代谢物浓度的影响，进而确定特
定的流量控制系数 （ flux control
coefficients ）,该系数反映特定反应对
复杂途径的影响程度。另一种更常用的
理论是生化系统理论（略）。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 57
第二种方法，代谢物平衡技术。
其模式的推导建立在对基质、产物及
某些重要中间产物的直接测定上。这
种方法已在谷氨酸棒杆菌生物合成赖
氨酸的研究中得到了应用。如果所研
究的代谢网络的途径结构已知，又假
定进行稳态代谢，那么就可通过准确
测得的所有进出细胞代谢流的流量，
推导出特定途径的代谢流量分布。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 58
但用这类方法计算，很难把代谢
环路（ 如 TCA环 ）、重要节点（ 如
PYR,PEP 节点 ）,以及平衡反应
（酶促反应的正向和逆向流量）的特
殊重要性包罗在内。这是这类方法的
局限性。为了弥补这种局限性，近年
已有几种技术用到这种类型的分析中
去了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 59
如采用示踪流量实验（ tracer
flux experiments ） 技术、快速取
样技术及核磁共振（ NMR） 技术
可获得关于代谢流分布的另外一
些信息,如代谢网络的有关组成
部分中的流量分布,胞内不同代
谢产物的累积量,以及它们各自
随时间而变化的情况。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 60
有人分析了谷氨酸棒杆菌在对数生长
期、赖氨酸生产期（生物素量足够）及谷
氨酸生产期（生物素限量）等条件下胞内
代谢流的不同分布情况（ 下图），它们
以 13C 标记的葡萄糖为碳源进行分批发酵，
然后运用 NMR 测定标记了的代谢物，同
时运用质量平衡法进行计算，得到了图中
的流量分布图，或称 代谢断面 （ sections
of the metabolism ） 图 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 61
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A ACO
2
GOA
B i o m ass
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
1 0 0
59
40 7
33
85
21
7
1
35
18
10
( 6 0 )
14
￡ ? 1
54
36
133
A,?? êy éú 3¤?ú
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A A
CO
2
GOA
B i om a s s
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
10 0
52
47 8
39
89
8
2
1
34
18
16
( 80 )
6
￡? 1
53
35
21
5
L y s
CO
2
12
16
24
4
B, àμ °±?á éú 3é ?ú
G lu
G 6 P
F 6 P
G A 3 P
PYR
R 5 P
CO
2
O A ACO
2
GOA
B i o m ass
?? H M P
?? T C A
?? CO
2
? ? 2 1
?? EM P
1 0 0
83
17 3
14
97
0
0
0
32
21
33
( 2 5 )
0
￡ ? 1
64
43
4411
C, 1è °±?á éú 3é ?ú
G l u
55
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 62
由图可见，在不同条件下，
流量发生了显著的变化。酵解途径
的 HMP 旁路的流量分布在赖氨酸
生成时增加，而在谷氨酸生成时则
下降。在氨基酸分泌的情况下，回
补反应变得更重要一些。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 63
另一个长期以来不能确定的
问题也在研究中得到了解决，也
就是氨基酸生成条件下 GOA 环
活力的问题，在氨基酸生成条件
下,GOA 环的活力实测是非常
低的。
下图为在 不同转化率时的理
论流量分布图 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 64
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
15
11
83
79
8
2
100
5
15
30
33
17
3
3
115
85
20
A, 平衡生长
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
6
94
99
10063
35
128
128
35
B,Y
Ly s / Glc
= 3 5 %
G 6 P
F 6 P
P EP
P Y R
A c Co A
Ru 5 P
G l c
CO
2
O A A
L y s
100
150
-5 0
75
100-2 5
75
0
0
75
C, Y
Ly s / Glc
= 7 5 %
CO2 CO2 CO2
5 125
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 65
课外学习参考资料：
Metabolic Pathway Synthesis (p288)
Metabolic Flux Analysis (p309)
in Metabolic Engineering,1998
Metabolic Flux Balance Analysis (p13)
in Metabolic Engineering,1999
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 66
3,基质的跨膜吸收与氨基酸的跨膜输出
基质的吸收和产物的输出对于氨基
酸的生成是非常重要的。对于某些细菌，
特别是大肠杆菌对基质吸收的不同机制
已作了详尽的研究，但对于其它生物工
程有关的微生物，如谷氨酸棒杆菌的蔗
糖及羧酸的吸收机制则知之甚少。而关
于产物氨基酸怎样跨过膜而被分泌出细
胞的问题，似乎或多或少被忽略掉了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 67
近年的研究表明，在氨基酸生产
的条件下,,氨基酸被动扩散跨过
细胞质膜, 这一设想是武断的。谷
氨酸棒杆菌中至少有谷氨酸、赖氨酸、
异亮氨酸及苏氨酸，以及大肠杆菌中
谷氨酸和苏氨酸，都是借助于载体的
输送过程，而且不纯粹是被动的。而
运动发酵单胞菌（ Zymomonas mobilis）
的重组菌株中，丙氨酸则是依靠简单
扩散机制来分泌。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 68
详细了解特定氨基酸跨过细胞质
膜渗透屏障的机理，对于提高发酵过
程的效率和转化率也非常重要。尽管
采用细菌来生产氨基酸往往可以获得
极高的胞外氨基酸浓度，人们却并未
意识到这至少部分是由于细胞向载体
系统所催化的分泌反应提供了代谢能
的结果。这一点已被有关赖氨酸和异
亮氨酸分泌的研究所证实 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 69
下图显示了谷氨酸棒杆菌在
异亮氨酸生产过程中发生的不同
流量。所观察到的异亮氨酸的净
产量实际上是借助于载体而形成
的向外分泌的流量、向内吸纳的
流量及扩散流量的代数和。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 70
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 71
在分批发酵的开始阶段，异
亮氨酸从胞内向胞外扩散，但随
着胞外异亮氨酸浓度的增加，其
扩散方向也发生改变，并越来越
多地抵消异亮氨酸载体系统的分
泌作用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 72
这一方面解释了所能获得的最
大胞外浓度取决于异亮氨酸对质膜
的透性常数，以及分泌和吸收载体
的活力；另一方面，由此可看出在
生产条件下可能发生 由代谢能驱动
的分泌与被动回流构成的无效循环
是浪费代谢能的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 73
一般说来，抵消氨基酸的产量的
氨基酸的吸收系统对于整个过程并不
重要。用谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸时，
吸收系统的活力非常低。最近发现，
芳香族氨基酸的吸收系统过量表达的
结果是相应氨基酸的吸收的增加，实
际上产物的转化率降低了。总之，深
入了解氨基酸吸收和分泌的能学及调
控的机理对于定量地理解氨基酸的生
产过程是极为重要的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 74
在进行包括输送途径的代谢流
量的详细分析时，特别是在比较野
生株和生产菌株，或特定菌株在生
产或非生产条件下的性质时，已引
出了几个重要的概念。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 75
单靠,瓶颈, 酶的过量表达并不
能获得理想的高产结果,在通常情况下，
仅仅是从基质到产物整条途径的某
,瓶颈, 酶的过量表达并不能获得理
想的高产结果。对生产菌株的分析表明，
为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地
分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。
只有当一系列酶发生了协调的改变，才
能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或
积压，避免代谢不平衡或不必要的副反
应 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 76
用谷氨酸棒杆菌、大肠
杆菌和酵母菌进行了有关芳
香族氨基酸的成功的研究。
关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆
菌的代谢途径工程研究的成
果已见发表 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 77
为提高色氨酸的产量, 已对谷氨
酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的
遗传调节, 包括：色氨酸操纵子 （ 已
被解除调节的 ） 的基因的过量表达,
去除调节子及弱化序列的控制；切断
通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路, 增加
前体物如 PEP,E-4-P和丝氨酸等的供
应, 破坏色氨酸酶的降解色氨酸的活
性等等 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 78
HMP
EMP
PEP E4P
DAHP
莽草酸
分支酸
预苯酸邻氨基苯甲酸
Phe Tyr
Trp
PRPP
Ser
降解产物
大肠杆菌中色
氨酸合成途径
的简图
该图略去了酶活
力及基因表达水
平上的调控机制，
实际上在生产菌
株中，这些调控
机制都已被解除。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 79
虽然一般用于芳香族氨基酸生产
的微生物并不是酿酒酵母，但在概念
探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物
合成的研究是引人关注的。实验结果
表明，即使在无分支的途径中，想靠
单个酶,上调（ up-modulation）,，
增加整条途径的流量往往是无济于事
的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 80
正如基于流量控制理论的理
论解释, 只有几种酶活性协同地提
高, 才有可能大幅度增加流向色氨
酸的全程的流量 。 这个发现为许多
途径中的关于, 分摊式的代谢控制
（ distributive metabolic control）,
的更加笼统的描述提供了支持；同
时也 对仍在广泛使用的代谢途径的
所谓, 瓶颈, 识别方法做出了一个
重要的限制 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 81
4,氨基酸生产的代谢设计
氨基酸生产上广泛使用棒状
杆菌, 这一方面有历史的原因；
另一方面, 与其他微生物如大
肠杆菌相比较, 棒状杆菌在工
业生产上具有明显的优势 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 82
棒状杆菌的代谢调节相对简单。
肠道细菌中特定反应的酶及特定基质
的载体系统具有多重性，而棒状杆菌
中则没有；棒状杆菌的代谢调控模式
也比大肠杆菌要简单得多。然而，利
用肠道细菌进行氨基酸菌种的育种的
优势则在于可以方便地应用成熟的现
代 DNA 重组技术，有效地进行氨基
酸生产菌种的改造。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 83
针对于不同的目的和不同水平的复
杂性，在考虑代谢设计的策略时应区别
对待。
代谢设计的目标在于：
（ 1）提高已建立的途径或过程的效率；
（ 2）将代谢流导向至新插入的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 84
第一个目标可通过多种手段来实现：
①扩展基质利用的范围
②改善生长条件；
③增大通往特定氨基酸合成途径的代谢流；
④调大通往目的产物的支路和调小通往副
产物的支路。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 85
这些对关键酶的活性或
调节机制的改良可大大增加
最终要被分泌的终端产物氨
基酸的胞内浓度。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 86
第二个目标即引入新的途径，
以便在不同的代谢期合成新的产
物。可通过类似但不同的方法来
实现：
①延长特定的代谢途径；
②引入新的代谢分支途径；
③从特定生物引入的全新的途径。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 87
尽管谷氨酸棒杆菌中通往赖
氨酸的流量控制点主要分布在天
冬氨酸激酶,DDP合成酶和赖氨
酸分泌系统，但如果考虑到通往
苏氨酸和异亮氨酸的途径，情况
就更加复杂了。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 88
十多年前，曾有人做过把谷氨
酸棒杆菌中碳架流导向苏氨酸的开
创性研究，其方法是扩增苏氨酸合
成途径起始端的两个酶高丝氨酸脱
氢酶和高丝氨酸激酶的基因（ hom
和 thrB ）,以及解除对高丝氨酸
脱氢酶的反馈调节。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 89
最近有一项有启发性的研究将一株
赖氨酸的生产菌株（出发菌株）逐步转
变为苏氨酸生产菌株，其方法是将突变
株的 hom - thrB 操纵子（指为已解除
调节的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶
编码的操纵子）不同拷贝数整合到出发
菌株的染色体 DNA上。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 90
尽管出发菌株可有效地分泌
赖氨酸及少量的甘氨酸，但当整
合到染色体 DNA 上的 hom-thrB
操纵子的拷贝数为 1～ 3时，苏氨
酸的分泌量则显著增加，同时赖
氨酸的产量则下降了原来的四分
之一。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 91
如果以该苏氨酸生产菌株作
为出发株, 也同样可采用类似
的策略将解除调节的苏氨酸脱
水酶和乙酰羟酸合成酶 （ 从苏
氨酸到异亮氨酸的合成途径的
第一和第二个酶 ） 引入异亮氨
酸的合成途径 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 92
以前，此类研究的主要目标就是鉴
别被认为必须改变或绕过的所谓的
,瓶颈反应,。对于第一步反应受到
反馈调节的某些合成途径，这一方法的
确有效。并且，这一方法是运用代谢撷
颃物（如合成途径的终端产物氨基酸的
结构类似物）成功地实现育种策略的基
础。这些代谢撷颃物的抗性突变株的突
变，常常是发生在一个反馈调节的主要
反应步骤（一般被叫做“代谢瓶颈”）
所对应的基因上。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 93
最典型的例子当属针对谷氨
酸棒杆菌赖氨酸合成途径中的天
门冬氨酸激酶的工作。赖氨酸生
产菌种一般是赖氨酸的结构类似
物 AEC（ aminoethyl cystein） 的
抗性突变株。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 94
然而分子水平的实验证实，即便是
在这种情况下，这种简单的方法仍不能
导致赖氨酸的高效合成。显然,通过随
机诱变和筛选所得到的高产菌株，其代
谢网络已发生了许多改变 。从很多例子
都可推断,单单改变某一, 重要的,
步骤（“瓶颈”）并不一定能实现氨基
酸的过量合成。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 95
因为对于长而复杂的代谢途径
而言, 绝对的单个限速步骤几乎是
不存在的 。 换言之, 整条途径在代
谢网络范围内已经是调整好了的,
,分摊式的代谢调控, （ 整条途径
上的代谢调控实际上是由许多个步
骤共同分担 ） 的发现也说明了这个
问题 。 这对于有目的的代谢设计是
有重要意义的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 96
仅仅提高合成途径的流量
往往并不足以将代谢流导向特
定氨基酸，实现特定氨基酸的
过量合成。为了增加氨基酸的
生产,增加关键前体物的供应
量也是十分重要的 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 97
关键前体物的供应 可通过中间代
谢的反应 （如 TCA 环的回补反应支
持 TCA 环中间产物的供应,EMP 途
径和 HMP 途径分别为芳香族氨基酸
的合成提供磷酸烯醇式丙酮酸和 4 - 磷
酸赤藓糖 ）, 或者在培养基中额外
添加特定前体物供微生物细胞吸收和
利用。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 98
当对合成途径进行修饰或导向时，
中心代谢途径的反应出乎意料地成了限
制因素；这一点再次强调了细胞代谢通
常已得到有效的调节，这也就意味着 许
多不同反应之间的最佳平衡和秩序井然
的分摊式控制覆盖了代谢网络的大部分。
只有当合理延伸的代谢网络片段以一种
协调的方式得到有目的的改变时，代谢
流大规模的导向才能最终导致最优的结
果。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 99
总体来说，副产物的形成
可以通过两种策略来避免：
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 100
最有利的方法是充分地调动所研究
的途径，这样就不会形成大量通往副产
物的中间产物了；另一种方法是使从目
的氨基酸的合成途径分出通往副产物合
成的分支的第一个酶失活。前文所述的
在生产色氨酸的大肠杆菌菌株中，去除
色氨酸酶，就是这一策略的一个成功应
用；这样就堵死了色氨酸过量合成条件
下色氨酸的主要消耗。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 101
当引入新的途径或者改变
已建立的代谢途径上代谢流的
流向时，除了要考虑碳架流，
还考虑氧化还原平衡和代谢能
平衡。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 102
对氨基酸产生菌的代谢途径的大
规模导向会出现一些问题。实际上，
一般氨基酸的分泌，特别是 谷氨酸棒
杆菌中谷氨酸的分泌被解释为氧化还
原作用失去平衡的结果,谷氨酸的分
泌在供氧条件的试验过程中，观察到
一个明显最佳状态。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 103
在谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸
或谷氨酸的条件下，不仅碳架流
会发生较大的变化，糖酵解途径
（产生 NADH） 和磷酸戊糖途径
（产生 NADPH） 间的 流量分配
也必定会发生巨大的变化 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 104
此外,从理论上推测谷氨酸棒
杆菌赖氨酸最大产量的获得在很大
程度上依赖于细胞的 NADPH 的水
平。 然而，曾尝试过确定赖氨酸生
产条件下 NADPH 的真实化学计
量，并尝试将其同其他合成反应进
行比较，结果惊奇地发现 NADPH
是大大过量的，这一点至今还无法
解释。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 105
这些结果再次强调还原
力定量分析的重要性，其对
于氨基酸生产菌株总体流量
的进一步优化，也具有潜在
的重要性。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 106
关于代谢能平衡的量化问题，
就目前而言，几乎还是空白。在
氨基酸生产方面，因为关于还原
力平衡的问题已有一些讨论，能
量平衡问题就常常被忽略。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 107
除了 ATP 的形成过程和已知的
ATP消耗过程之间的不平衡，氨基酸
过量合成显然远非仅仅与能量的输入
和输出的“偶联”或“赢利”。如上
所述,代谢能的重大消耗一般都能观
察到，这种损耗一方面甚至会限制产
物对基质的转化率，另一方面也可能
是增加特定产物分泌的基础。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 108
氨基酸的过量生产可由两种不同
的代谢状态引起。诸如赖氨酸、异亮
氨酸、苏氨酸及芳香族氨基酸等可通
过解除合成途径的调节来实现过量分
泌；而谷氨酸的分泌在许多细菌中则
是对环境压力的响应。因此，如上所
述，这两种情况下的研究策略也是不
同的。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 109
要改善氨基酸的生产，除
了碳架流方面以外，在还原力
控制和能量代谢方面还有很多
工作等待着我们去做。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 110
目前的研究越来越多地把兴
趣放在跨膜输送反应上，包括对
可能限制氨基酸生产的营养因子
的吸收，以及作为工艺控制中重
要一步的终端产物的分泌。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 111
氨基酸分泌系统的存在，以及
其生理重要性，直到最近才得到阐
明。这为氨基酸生产菌株的改良开
创了一块全新的领域。 这一研究方
向可纳入目前的研究热点，也就是
对各种反应进行流量分析，包括底
物吸收、中心代谢途径、合成途径，
以及产物输出。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 112
在这些分析中，我们将实现概念
上的转变，也就是从描述性数据 ——
例如细胞抽提物中有关酶的活力或底
物、产物和副产物浓度的测定 —— 到
稳态流量数据的分析和动力学性质的
描绘的转变。这就意味着 要研究流量
的分布、指定的网络、被微调的酶在
代谢网络中活性的微妙的变化。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 113
为了了解原始生理背景下的
代谢反应，以及在正常条件下这
些反应对细胞的重要性，还要求
实现另一个转变，也就是 由对微
生物细胞输入和输出的平衡数据
的测定和采集（测定细胞外培养
基中的浓度），转变为获取胞内
的定量信息。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 114
当然，这同时也意味着需要
有新的分析方法。胞外和胞内代
谢物浓度的区别应该是可靠的，
这需要靠有效的终止步骤来实现
胞内外组分快速和定量的分离,
也需要灵敏的分析方法来测定尽
可能多的 胞内代谢物 。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 115
目前研究的另一方面是,将大
肠杆菌和酿酒酵母中已经非常成熟
的分子生物学工具,应用到工业微
生物尤其是格兰氏阳性菌中,如谷
氨酸棒杆菌。 遗传的成功改造通常
会受到异种 DNA引起的重排和丢失
的限制,以及细胞的有效的制约系
统的限制。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 116
近年谷氨酸棒杆菌基因工
程的一些主要工具已经构建。
前几年开始研究一种可靠的转
座子诱变，这种重要的工具在
谷氨酸棒杆菌中仍未建立起来。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 117
传统的菌种改良方法同现代,代
谢设计,方法相比较，在许多方面仍
具有竞争力。但随着我们对代谢及分
子遗传学工具等方面认识的加深，有
目的的代谢设计必然成为菌种改良的
主要方法。 在详细地了解细胞的代谢
网络及代谢调控的基础上，代谢途径
的构建和代谢流的导向都将成为现实。
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 118
从以下三个方面分析：
1.麦汁成分； 2.菌种； 3.生产工艺。
根据细胞经济假设灵活应用五字策略
AAs
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 119
啤酒酵母酿造啤酒的代谢亚网络
2010-5-14 张星元：发酵原理（讲座） 120
与其愁，不如做。
做中学，学中做。
勤总结，常修正。
心要平，步要稳。
目标明，事必成。
