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分子发光分析
分子发光包括荧光、磷光、
化学发光、生物发光和散射光谱
等。
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分子发光分析法教学要求
? 掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机
理；掌握激发光谱和发射光谱特征。
? 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧
光（磷光）强度影响因素。
? 了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测
定方法。
? 了解磷光分析法的类型。
? 了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的结
构。
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第一节 分子荧光和磷光分析
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生
单重态与三重态有何区别？
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处于分子基态单重态中的电子对，其自旋
方向相反，当其中一个电子被激发时，通常
跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃
迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合
光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨
道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的
区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具
有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单
重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命
大约为 10-8s,而三重态分子具有顺磁性，其
激发态的平均寿命为 10-4 ~ 1s以上 （通常用 S
和 T分别表示单重态和三重态）
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解释名词：荧光、磷光、延迟荧光
振动弛豫、内转移、系间窜跃、外转移
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振动弛豫
它是指 在同一电子能级 中，
电子由高振动能级转至低振动能
级，而将多余的能量以热的形式
发出 。发生振动弛豫的时间为
10-12s数量级。
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内转移
当 两个电子能级 非常靠近以至其
振动能级有 重叠 时，常发生电子由高
能级以 无辐射跃迁方式 转移至低能级。
右图中指出，处于高激发单重态的电
子，通过内转移及振动弛豫，均跃回
到第一激发单重态的最低振动能级。
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荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长为 λ 3的
荧光。 注意,基态中也有振动驰豫跃迁 。很
明显,λ 3的波长较激发波长 λ 1或 λ 2都长，
而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长 λ 3为的荧光。荧光的产生
在 10-7-10-9s内完成。
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系间窜跃
指 不同多重态间 的 无辐射跃迁,例
如 S1→ T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时,电子由 S1的较低振动能
级转移至 T1的较高振动能级处 。有时，
通过热激发，有可能发生 T1→ S1,然后
由 S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机
理。
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磷光发射
电子由基态单重态激发至第一激发三重
态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，
由第一激发单重态的最低振动能级，有可能
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经
过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激
发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁
过程（ T1→ S0） 也是自旋禁阻的，其发光速
率较慢，约为 10-4-10s。 因此，这种跃迁所发
射的光,在光照停止后，仍可持续一段时间。
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外转移
指激发分子与溶剂分子或其它溶质
分子的相互作用及能量转移，使荧光或
磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为
“熄灭”或“猝灭”。
荧光与磷光的根本区别是什么？
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（二）激发光谱曲线和荧光、
磷光光谱曲线
绘制激发光谱曲线时，
固定测量波长为荧光（或磷
光）最大发射波长，然后改
变激发波长，根据所测得的
荧光（磷光）强度与激发光
波长的关系，即可绘制 激发
光谱曲线 。
如果 固定激发光波长
为其最大激发波长，然后
测定不同的波长时所发射
的荧光或磷光强度, 即可
绘制 荧光或磷光光谱曲线 。
激发光谱曲线
与其吸收曲线
有何区别和联
系？
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荧光发射光谱的普遍特性：
（ 1） Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收
位移到较长的波长,称为 Stokes位移 。这是
由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，
也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，
也会有能量的损失。因此，在激发和发射之
间产生了能量损失。
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（ 2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关
因为分子吸收了不同能量的光子可以由
基态激发到几个 不同的电子激发态,而具有
几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及
转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，
远大于由高能激发态直接发射光子的速度，
故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐
射激发，电子都 从第一电子激发态的最低振
动能层返回到基态的各个振动能层,所以荧
光发射光谱与激发波长无关。
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（ 3）镜像规则
通常 荧光发射光谱 和它的 吸收
光谱 呈镜像对称关系。
如何理解镜像规则
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吸收光谱 是物质分子由基态激发至
第一电子激发态的各振动能层形成的。
其形状决定于 第一电子激发态 中各 振
动能层的分布情况 。
荧光光谱 是激发分子从第一电子激
发态的最低振动能层回到基态中各不同
能层形成的。所以 荧光光谱的形状 决定
于 基态中各振动能层的分布情况 。
基态中振动能层的分布和第一电
子激发态中振动能层的分布情况是类似
的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱
的形状极为相似。
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由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发
态各个振动能层的吸收过程中，振动能层越高,
两个能层之间的能量差越大，即激发所需的能
量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各
个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层
越高,两个能层之间的能量差越小，荧光峰的
波长越长。
另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。
由于光吸收在大约 10-15的短时间内发生，原子
核没有发生明显的位移，即电子与核之间的位
移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的
零振动能层与激发态的第二振动能层之间的 跃
迁几率 最大，那么，在荧光发射过程中，其相
反 跃迁的几率 也应该最大。也就是说，吸收和
发射的能量都最大。
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（三）荧光和分子结构的关系
分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率
相适应的结构，才能吸收激发光；
② 吸收了与其本身特征频率相同的能
量之后，必须具有 一定的荧光量子产
率。
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1,量子产率
荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，
它 表示物质发射荧光的能力,通常用下式表
示
? = 发射荧光分子数 / 激发分子总数
或 ? = 发射荧光量子数 / 吸收光量子数
在产生荧光的过程中，涉及到许多 辐射
和 无辐射跃迁 过程，如荧光发射、内转移，
系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子
产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。
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若用数学式来表达这些关系，得到
?= kf /（ kf+?ki）
式中 kf为 荧光发射 过程的 速率常数, ?ki
为其它有关过程的速率常数的总和。
凡是能使 kf 值升高而使其它 ki值降低的
因素，都可增强荧光。
实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，
其量子产率在某些情况下接近 1，说明 ?kI很
小，可以忽略不计。一般来说,kf主要取决
于化学结构，而 ?ki则主要取决于化学环境，
同时也与化学结构有关。
磷光的量子产率与此类似。
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2,荧光与有机化合物的结构
（ 1）跃迁类型
实验证明，对于大多数荧光物质，首先
经历 ????或 n（ 非键电子轨道） ???激发，
然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发
生 ????或 ???n跃迁而得到荧光。在这两种
跃迁类型中,????跃迁常能发出较强的荧
光 （较大的量子产率）。
????跃迁是产生荧光的主要跃迁类型，为什么？
23
????跃迁具有较大的摩尔吸光系数
（一般比 n???大 100-1000倍），
其次,????跃迁的寿命约为 10-7—
10-9s,比 n???跃迁的寿命 10-5— 10-7s要短。
在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发
射荧光的。
在 ????跃迁过程中，通过系间窜跃至
三重态的速率常数也较小（ S1?T!能级差
较大），这也有利于荧光的发射，总之，
????跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。
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（ 2）共轭效应
实验证明，容易实现 ????激发 的芳香
族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪
族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体
系化合物除外）。此外,增加体系的共轭度,
荧光效率一般也将增大 。例如，在多烯结构
中,ph（ CH=CH） 3 ph和 ph（ CH=CH） 2
ph在苯中的荧光效率分别为 0.68和 0.28。
共轭效应使荧光增强的原因,
主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系
数，有利于产生更多的激发态分子，从而有
利于荧光的发生。
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第一节 分子荧光和磷光分析
(3) 刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结
构的有机分子具有强烈的荧光。 因为这
种结构可以减少分子的振动，使分子与
溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，
也就减少了碰撞去活的可能性。
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（ 4）取代基效应
芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物
的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。
给电子基团，如 -OH,-OR,-CN,-NH2, -
NR2等，使荧光增强。因为产生了 p-?共轭作用，
增强了 ?电子共轭程度，使最低激发单重态与基态
之间的跃迁几率增大。
吸电子基团，如 -COOH,-NO,-C ?O,卤素
等，会减弱甚至会 猝 灭荧光。
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这
可能是由所谓“重原子效应”使系间跨越速率增加
所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，
因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重
态转化为三重态的速率。
取代基的空间障碍对荧光也有影响。
立体异构现象对荧光强度有显著的影响。
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3,金属螯合物的荧光
除过渡元素的顺磁性原子会发生线状
荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在
溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧
光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能
产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分
析。
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（ 1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于
不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生
荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着
分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。
如 8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属
螯合物具有很强的荧光。
（ 2）螯合物中金属离子的特征荧光
这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体
的 ????跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离
子，导致 d?d?跃迁和 f?f?跃迁，最终发射的是
d?d?跃迁和 f?f?跃迁光谱。
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（四）溶液的荧光（或磷光）强度
1,荧光强度与溶液浓度的关系
荧光强度 If正比于吸收的光量 Ia与荧光量子产
率 ? 。
If = ? Ia
式中 ?为荧光量子效率，又根据 Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e -? l C)
I0和 It分别是入射光强度和透射光强度。代入上
式得
If = ? I0(1- 10 -? l c) = ? I0(1- e -2.3? l c)
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整理得：
If =2.3 ? I0 ?lc
当入射光强度 I0 和 l一定时,上式
为：
If = K c
即荧光强度与荧光物质的浓度成之
正比，但这种线性关系只有在极稀的溶
液中,当 ?lc?0.05时才成立 。对于较浓
溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，
使荧光强度和浓度不呈线性关系。
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（ 2）影响荧光强度的因素
① 溶剂 对荧光强度的影响 。
溶剂的影响可分为 一般溶剂效应 和 特殊
溶剂效应 。
一般溶剂效应 指的是溶剂的折射率和介
电常数的影响。
特殊溶剂效应 指的是荧光体和溶剂分子
间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作
用。
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② 温度对荧光强度的影响
温度上升使荧光强度下降。其
中一个原因是 分子的内部能量转化
作用 。当激发分子接受额外热能时，
有可能使激发能转换为基态的振动
能量，随后迅速振动弛豫而丧失振
动能量。另一个原因是 碰撞频率增
加,使外转换的去活几率增加。
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③ 溶液 pH值对荧光强度的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香
族化合物的荧光与溶液的 pH有关。不同的
pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物
或化合物的分子与其离子在电子构型上有所
不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就
有一定的差别。
对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊
合物，一方面 pH会影响鏊合物的形成，另一
方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们
的荧光性质。
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④ 内滤光作用和自吸收现象
溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所
发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现
象称为,内滤光作用”。
内滤光作用的另一种情况是荧光物质的
荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收
光谱的长波长一端有重叠。
在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被
自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶
液的荧光强度。
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（ 3）溶液荧光猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的
相互作用引起荧光强度降低的现象称为 荧光猝灭 。
能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。
导致荧光猝灭的主要类型：
① 碰撞猝灭
碰撞猝灭 是指处于激发单重态的荧光分子与猝
灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐
射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭）
由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非
荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液
吸收光谱的改变。
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③ 转入三重态的猝灭
分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到
三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们
在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。
④ 发生电子转移反应的猝灭
某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，
发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。
⑤ 荧光物质的自猝灭
在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态
的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰
撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度
较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱
发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。
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二、荧光分析仪
用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用
于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器
四部分组成。
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由光源发射的光经第一单色器得到所需
的激发光波长，通过样品池后，一部分光能
被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发
射荧光。 为了消除入射光和散射光的影响，
荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上
进行 。为消除可能共存的其它光线的干扰，
如由激发所产生的反射光,Raman光以及为
将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在
样品池和检测器之间设置了 第二单色器 。荧
光作用于检测器上，得到响应的电信号。
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（ 1）激发光源
在紫外 -可见区范围，通常的光源是氙灯和高
压汞灯。
（ 2）样品池
荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通
常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（ 3）单色器
光栅
（ 4）检测器
由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发
光成直角。
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三、分子荧光分析法及其应用
1.荧光分析方法的特点
（ 1）灵敏度高 （ 2）选择性强
（ 3）试样量少和方法简单
（ 4）提供比较多的物理参数
荧光分析法的弱点是它的应用范围小。因为本
身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方
法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量
也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测
定对环境因素敏感，干扰因素较多。
2,定量分析方法
（ 1）校准曲线法 （ 2）比较法
3,应用
（ 1）元素的荧光测定
（ 2）有机化合物的荧光测定。
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四、磷光分析法
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光
是第一激发单重态的最低能层，经 系间跨越 跃迁到
第一激发三重态，并经 振动弛豫 至最低振动能层，
然后跃迁回到基态发生的。与荧光相比，磷光具有
如下三个特点：
（ 1）磷光辐射的波长比荧光长
分子的 T1态能量比 S1态低。
（ 2）磷光的寿命比荧光长
由于荧光是 S1 ? S0跃迁产生的，这种跃迁
是自旋许可的跃迁，因而 S1态的辐射寿命通常在
10-7~ 10-9s,磷光是 T1 ? S0跃迁产生的，这种跃
迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射
寿命要长，大约为 10-4~ 10s。
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（ 3） 磷光的寿命和辐射强度对于重原子和
顺磁性离子敏感。
1,低温磷光
由于激发三重态的寿命长，使激发态分
子发生 T1? S0这种分子内部的内转化非辐
射去活化过程以及激发态分子与周围的溶剂
分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某
些光化学反应的几率增大，这些都将使磷光
强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去活
化过程的影响，通常应在低温下测量磷光。
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2.室温磷光
由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的
限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（ RTP）。
（ 1） 固体基质室温磷光法（ SS-RTP）
此法基于测量室温下 吸附于固体基质上 的有机
化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多，有 纤
维素载体 （如滤纸、玻璃纤维）,无机载体 （如硅
胶、氧化铝）以及 有机载体 （如乙酸钠、聚合物、
纤维素膜）等。 理想的载体 是既能将分析物质牢固
地束缚在表面或基质中以增加其刚性，并能减小三
重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不
产生磷光背景 。
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（ 2）胶束增稳的溶液室温磷光法（ MS-
RTP）
当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶
束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种
胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定
向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理
性质,减小了内转化和碰撞能量损失 等非辐
射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的
稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷
光。 利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，
并对溶液除氧，是 MS-RTP 的三个要素。
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（ 3）敏化溶液室温磷光法（ SS-RTP）
该法在 没有表面活性剂存在 的情况
下获得溶液的室温磷光。 分析物质被激
发后并不发射荧光,而是经过 系间跨越
过程衰减变至最低激发三重态。当有某
种合适的能量受体存在时，发生了由 分
析物质到受体 的三重态能量 转移,最后
通过测量 受体所发射的室温磷光强度 而
间接测定该分析物质。在这种方法中，
分析物质本身并不发磷光，而是引发受
体发磷光。
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3,磷光分析仪
在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即
可用于磷光测定。
1.液槽：将样品放在盛有液氮的石英杜瓦
瓶内，即可用于低温磷光测定。
2.斩波片：分别测荧光和磷光；测出不同
寿命的磷光。
4,应用
磷光分析主要用于测定有机化合物，如
石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面 。
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第二节 化学发光分析
某些物质在进行化学反应时，由于 吸收
了反应时产生的化学能,而使 反应产物分子
激发至激发态,受激分子由激发态回到基态
时，便发出一定波长的光。这种 吸收化学能
使分子发光的过程称为化学发光 。 利用化学
发光反应而建立起来的分析方法称为化学发
光分析法 。化学发光也发生于生命体系，这
种发光称为生物发光。
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一、化学发光分析的基本原理
化学发光是吸收化学反应过程产生的化
学能，而使反应产物分子激发所发射的光。
任何一个化学发光反应都应包括化学激发和
发光两个步骤，必须满足如下条件：
（ 1）化学反应必须提供足够的激发能，激
发能主要来源于反应焓。
（ 2）要有有利的化学反应历程，使化学反
应的能量至少能被一种物质所接受并生成激
发态。
（ 3）激发态能释放光子或能够转移它的能
量给另一个分子，而使该分子激发，然后以
辐射光子的形式回到基态。
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化学发光反应效率 ?cl,又称化学发光的总量
子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发
效率 ?ce和激发态分子的发射效率 ?em。 定义为：
?cl =发射光子的分子数 / 参加反应的分子数 =
?ce??em
化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及
光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。
每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不
同的化学发光效率。
化学发光反应的发光强度 Icl以单位时间内发射
的光子数表示 。 它与 化学发光反应的速率有关, 而
反应速率又与 反应分子浓度 有关 。 即
Icl （ t） = ?cl ? dc/dt
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二、化学发光反应类型
1,直接化学发光和间接化学发光
直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，
生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。
A + B? C* + D
C* ? C + h?
式中 A或 B是被测物, 通过反应生成电子激发态产物 C*, 当
C* 跃迁回基态时, 辐射光子 。
间接发光 是被测物 A或 B，通过化学反应生成初始激发
态产物 C*, C* 不直接发光，而是将其能量转移给 F,使 F
跃迁回基态，产生发光。
A + B? C* + D
C*+F? F* + E
F* ? F + h?
式中 C*为能量给予体, 而 F为能量接受体
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2,气相化学发光和液相化学发光
按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中
进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为
液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为
异相化学发光。
（ 1）气相化学发光
主要有 O3,NO,S的化学发光反应，可用于
监测空气中的 O3,NO,SO2,H2S,CO,NO2等。
臭氧与乙烯的化学发光反应； 一氧化氮与臭
氧的化学发光反应。（ 教材 P.99）
（ 2） 液相化学发光
用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、
光泽碱、洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，
可测定痕量的 H2O2以及 Cu,Mn,Co,V,Fe,Cr、
Ce等金属离子。
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三、化学发光的测量装置
化学发光分析法的测量仪器主要包括 样
品室、光检测器、放大器和信号输出装置。
化学发光反应在样品室中进行，样品和
试剂混合的方式有 分立取样式,加样是间歇
的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池
内，然后用进样器加入分析物。另一种方法
是 流动注射式,反应试剂和分析物是定时在
样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移
动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲
线的一部分，而以峰高进行定量测量。
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应用：
?化学发光分析测定的物质可以分为三
类,第一类物质是化学发光反应中的
反应物 ;第二类物质是化学发光反应
中的催化剂、增敏剂或抑制剂 ;第三
类物质是偶合反应中的反应物、催化
剂、增敏剂等。这三类物质还可以通
过标记方式用来测定人们感兴趣的其
他物质,进一步扩大了化学发光分析
的应用范围。
?对象：无机物、有机物、生物物质等
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? 流动注射化学发光分析法具有选择性好、
灵敏度高 (1 0 -1 2 -1 0 -2 2 ｍｏｌ,Ｌ -1 ),设备
简单等优点,已在生命科学、环境科学等领
域发挥了巨大的作用,虽然已知的化学发光
体系很多,但应用较广的基本上只有 ｌｕｍ
ｉｌｏｌ 和ＴＣＰＯ体系,今后将继续引入
新的化学发光体系,并着重纳米级光纤化学
发光以及无损、在体、多组分和多信息方
面的研究,以满足日益增长的生命科学生物
分析和环境监测的需要。
分子发光分析
分子发光包括荧光、磷光、
化学发光、生物发光和散射光谱
等。
2
分子发光分析法教学要求
? 掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机
理；掌握激发光谱和发射光谱特征。
? 掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧
光（磷光）强度影响因素。
? 了解荧光（磷光）分析法的特点及定量测
定方法。
? 了解磷光分析法的类型。
? 了解荧光、磷光和化学发光分析仪器的结
构。
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第一节 分子荧光和磷光分析
一、基本原理
（一）荧光和磷光的产生
单重态与三重态有何区别？
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处于分子基态单重态中的电子对，其自旋
方向相反，当其中一个电子被激发时，通常
跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃
迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合
光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨
道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的
区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具
有较低能级。
在单重激发态中，两个电子平行自旋，单
重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命
大约为 10-8s,而三重态分子具有顺磁性，其
激发态的平均寿命为 10-4 ~ 1s以上 （通常用 S
和 T分别表示单重态和三重态）
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解释名词：荧光、磷光、延迟荧光
振动弛豫、内转移、系间窜跃、外转移
6
7
振动弛豫
它是指 在同一电子能级 中，
电子由高振动能级转至低振动能
级，而将多余的能量以热的形式
发出 。发生振动弛豫的时间为
10-12s数量级。
8
内转移
当 两个电子能级 非常靠近以至其
振动能级有 重叠 时，常发生电子由高
能级以 无辐射跃迁方式 转移至低能级。
右图中指出，处于高激发单重态的电
子，通过内转移及振动弛豫，均跃回
到第一激发单重态的最低振动能级。
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荧光发射
处于第一激发单重态中的电子跃回至
基态各振动能级时，将得到最大波长为 λ 3的
荧光。 注意,基态中也有振动驰豫跃迁 。很
明显,λ 3的波长较激发波长 λ 1或 λ 2都长，
而且不论电子开始被激发至什么高能级，最
终将只发射出波长 λ 3为的荧光。荧光的产生
在 10-7-10-9s内完成。
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系间窜跃
指 不同多重态间 的 无辐射跃迁,例
如 S1→ T1就是一种系间窜跃。通常，发
生系间窜跃时,电子由 S1的较低振动能
级转移至 T1的较高振动能级处 。有时，
通过热激发，有可能发生 T1→ S1,然后
由 S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机
理。
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磷光发射
电子由基态单重态激发至第一激发三重
态的几率很小，因为这是禁阻跃迁。但是，
由第一激发单重态的最低振动能级，有可能
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经
过振动驰豫，转至其最低振动能级，由此激
发态跃回至基态时，便发射磷光，这个跃迁
过程（ T1→ S0） 也是自旋禁阻的，其发光速
率较慢，约为 10-4-10s。 因此，这种跃迁所发
射的光,在光照停止后，仍可持续一段时间。
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外转移
指激发分子与溶剂分子或其它溶质
分子的相互作用及能量转移，使荧光或
磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为
“熄灭”或“猝灭”。
荧光与磷光的根本区别是什么？
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（二）激发光谱曲线和荧光、
磷光光谱曲线
绘制激发光谱曲线时，
固定测量波长为荧光（或磷
光）最大发射波长，然后改
变激发波长，根据所测得的
荧光（磷光）强度与激发光
波长的关系，即可绘制 激发
光谱曲线 。
如果 固定激发光波长
为其最大激发波长，然后
测定不同的波长时所发射
的荧光或磷光强度, 即可
绘制 荧光或磷光光谱曲线 。
激发光谱曲线
与其吸收曲线
有何区别和联
系？
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荧光发射光谱的普遍特性：
（ 1） Stokes位移
在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收
位移到较长的波长,称为 Stokes位移 。这是
由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，
也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，
也会有能量的损失。因此，在激发和发射之
间产生了能量损失。
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（ 2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关
因为分子吸收了不同能量的光子可以由
基态激发到几个 不同的电子激发态,而具有
几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及
转动弛豫回到第一电子激发态的几率较高，
远大于由高能激发态直接发射光子的速度，
故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐
射激发，电子都 从第一电子激发态的最低振
动能层返回到基态的各个振动能层,所以荧
光发射光谱与激发波长无关。
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（ 3）镜像规则
通常 荧光发射光谱 和它的 吸收
光谱 呈镜像对称关系。
如何理解镜像规则
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吸收光谱 是物质分子由基态激发至
第一电子激发态的各振动能层形成的。
其形状决定于 第一电子激发态 中各 振
动能层的分布情况 。
荧光光谱 是激发分子从第一电子激
发态的最低振动能层回到基态中各不同
能层形成的。所以 荧光光谱的形状 决定
于 基态中各振动能层的分布情况 。
基态中振动能层的分布和第一电
子激发态中振动能层的分布情况是类似
的。 因此荧光光谱的形状和吸收光谱
的形状极为相似。
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由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发
态各个振动能层的吸收过程中，振动能层越高,
两个能层之间的能量差越大，即激发所需的能
量越高，所以吸收峰的波长越短。反之，由
第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各
个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层
越高,两个能层之间的能量差越小，荧光峰的
波长越长。
另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。
由于光吸收在大约 10-15的短时间内发生，原子
核没有发生明显的位移，即电子与核之间的位
移没有发生变化。假如在吸收过程中，基态的
零振动能层与激发态的第二振动能层之间的 跃
迁几率 最大，那么，在荧光发射过程中，其相
反 跃迁的几率 也应该最大。也就是说，吸收和
发射的能量都最大。
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（三）荧光和分子结构的关系
分子产生荧光必须具备两个条件：
① 分子必须具有与所照射的辐射频率
相适应的结构，才能吸收激发光；
② 吸收了与其本身特征频率相同的能
量之后，必须具有 一定的荧光量子产
率。
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1,量子产率
荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，
它 表示物质发射荧光的能力,通常用下式表
示
? = 发射荧光分子数 / 激发分子总数
或 ? = 发射荧光量子数 / 吸收光量子数
在产生荧光的过程中，涉及到许多 辐射
和 无辐射跃迁 过程，如荧光发射、内转移，
系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子
产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。
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若用数学式来表达这些关系，得到
?= kf /（ kf+?ki）
式中 kf为 荧光发射 过程的 速率常数, ?ki
为其它有关过程的速率常数的总和。
凡是能使 kf 值升高而使其它 ki值降低的
因素，都可增强荧光。
实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，
其量子产率在某些情况下接近 1，说明 ?kI很
小，可以忽略不计。一般来说,kf主要取决
于化学结构，而 ?ki则主要取决于化学环境，
同时也与化学结构有关。
磷光的量子产率与此类似。
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2,荧光与有机化合物的结构
（ 1）跃迁类型
实验证明，对于大多数荧光物质，首先
经历 ????或 n（ 非键电子轨道） ???激发，
然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发
生 ????或 ???n跃迁而得到荧光。在这两种
跃迁类型中,????跃迁常能发出较强的荧
光 （较大的量子产率）。
????跃迁是产生荧光的主要跃迁类型，为什么？
23
????跃迁具有较大的摩尔吸光系数
（一般比 n???大 100-1000倍），
其次,????跃迁的寿命约为 10-7—
10-9s,比 n???跃迁的寿命 10-5— 10-7s要短。
在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发
射荧光的。
在 ????跃迁过程中，通过系间窜跃至
三重态的速率常数也较小（ S1?T!能级差
较大），这也有利于荧光的发射，总之，
????跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。
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（ 2）共轭效应
实验证明，容易实现 ????激发 的芳香
族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪
族和脂环族化合物极少（仅少数高度共轭体
系化合物除外）。此外,增加体系的共轭度,
荧光效率一般也将增大 。例如，在多烯结构
中,ph（ CH=CH） 3 ph和 ph（ CH=CH） 2
ph在苯中的荧光效率分别为 0.68和 0.28。
共轭效应使荧光增强的原因,
主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系
数，有利于产生更多的激发态分子，从而有
利于荧光的发生。
25
第一节 分子荧光和磷光分析
(3) 刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结
构的有机分子具有强烈的荧光。 因为这
种结构可以减少分子的振动，使分子与
溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，
也就减少了碰撞去活的可能性。
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（ 4）取代基效应
芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物
的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。
给电子基团，如 -OH,-OR,-CN,-NH2, -
NR2等，使荧光增强。因为产生了 p-?共轭作用，
增强了 ?电子共轭程度，使最低激发单重态与基态
之间的跃迁几率增大。
吸电子基团，如 -COOH,-NO,-C ?O,卤素
等，会减弱甚至会 猝 灭荧光。
卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这
可能是由所谓“重原子效应”使系间跨越速率增加
所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，
因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重
态转化为三重态的速率。
取代基的空间障碍对荧光也有影响。
立体异构现象对荧光强度有显著的影响。
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3,金属螯合物的荧光
除过渡元素的顺磁性原子会发生线状
荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在
溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧
光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能
产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分
析。
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（ 1）螯合物中配位体的发光
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于
不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生
荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着
分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。
如 8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属
螯合物具有很强的荧光。
（ 2）螯合物中金属离子的特征荧光
这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体
的 ????跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离
子，导致 d?d?跃迁和 f?f?跃迁，最终发射的是
d?d?跃迁和 f?f?跃迁光谱。
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（四）溶液的荧光（或磷光）强度
1,荧光强度与溶液浓度的关系
荧光强度 If正比于吸收的光量 Ia与荧光量子产
率 ? 。
If = ? Ia
式中 ?为荧光量子效率，又根据 Beer定律
Ia = I0 - It = I0(1- e -? l C)
I0和 It分别是入射光强度和透射光强度。代入上
式得
If = ? I0(1- 10 -? l c) = ? I0(1- e -2.3? l c)
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整理得：
If =2.3 ? I0 ?lc
当入射光强度 I0 和 l一定时,上式
为：
If = K c
即荧光强度与荧光物质的浓度成之
正比，但这种线性关系只有在极稀的溶
液中,当 ?lc?0.05时才成立 。对于较浓
溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，
使荧光强度和浓度不呈线性关系。
31
（ 2）影响荧光强度的因素
① 溶剂 对荧光强度的影响 。
溶剂的影响可分为 一般溶剂效应 和 特殊
溶剂效应 。
一般溶剂效应 指的是溶剂的折射率和介
电常数的影响。
特殊溶剂效应 指的是荧光体和溶剂分子
间的特殊化学作用，如氢键的生成和化合作
用。
32
② 温度对荧光强度的影响
温度上升使荧光强度下降。其
中一个原因是 分子的内部能量转化
作用 。当激发分子接受额外热能时，
有可能使激发能转换为基态的振动
能量，随后迅速振动弛豫而丧失振
动能量。另一个原因是 碰撞频率增
加,使外转换的去活几率增加。
33
③ 溶液 pH值对荧光强度的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香
族化合物的荧光与溶液的 pH有关。不同的
pH值，化合物所处状态不同，不同的化合物
或化合物的分子与其离子在电子构型上有所
不同，因此，它们的荧光强度和荧光光谱就
有一定的差别。
对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊
合物，一方面 pH会影响鏊合物的形成，另一
方面还会影响鏊合物的组成，因而影响它们
的荧光性质。
34
④ 内滤光作用和自吸收现象
溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所
发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现
象称为,内滤光作用”。
内滤光作用的另一种情况是荧光物质的
荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收
光谱的长波长一端有重叠。
在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被
自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶
液的荧光强度。
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（ 3）溶液荧光猝灭
荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的
相互作用引起荧光强度降低的现象称为 荧光猝灭 。
能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。
导致荧光猝灭的主要类型：
① 碰撞猝灭
碰撞猝灭 是指处于激发单重态的荧光分子与猝
灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐
射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭）
由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非
荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液
吸收光谱的改变。
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③ 转入三重态的猝灭
分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到
三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们
在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。
④ 发生电子转移反应的猝灭
某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，
发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。
⑤ 荧光物质的自猝灭
在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态
的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰
撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度
较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱
发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。
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二、荧光分析仪
用于测量荧光的仪器由激发光源、样品池、用
于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器
四部分组成。
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由光源发射的光经第一单色器得到所需
的激发光波长，通过样品池后，一部分光能
被荧光物质所吸收，荧光物质被激发后，发
射荧光。 为了消除入射光和散射光的影响，
荧光的测量通常在与激发光成直角的方向上
进行 。为消除可能共存的其它光线的干扰，
如由激发所产生的反射光,Raman光以及为
将溶液中杂质滤去，以获得所需的荧光，在
样品池和检测器之间设置了 第二单色器 。荧
光作用于检测器上，得到响应的电信号。
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（ 1）激发光源
在紫外 -可见区范围，通常的光源是氙灯和高
压汞灯。
（ 2）样品池
荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通
常用石英，形状以方形和长方形为宜。
（ 3）单色器
光栅
（ 4）检测器
由光电管和光电倍曾管作检测器，并与激发
光成直角。
40
三、分子荧光分析法及其应用
1.荧光分析方法的特点
（ 1）灵敏度高 （ 2）选择性强
（ 3）试样量少和方法简单
（ 4）提供比较多的物理参数
荧光分析法的弱点是它的应用范围小。因为本
身能发荧光的物质相对较少，用加入某种试剂的方
法将非荧光物质转化为荧光物质进行分析，其数量
也不多；另一方面，由于荧光分析的灵敏度高，测
定对环境因素敏感，干扰因素较多。
2,定量分析方法
（ 1）校准曲线法 （ 2）比较法
3,应用
（ 1）元素的荧光测定
（ 2）有机化合物的荧光测定。
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四、磷光分析法
分子磷光与分子荧光光谱的主要差别是磷光
是第一激发单重态的最低能层，经 系间跨越 跃迁到
第一激发三重态，并经 振动弛豫 至最低振动能层，
然后跃迁回到基态发生的。与荧光相比，磷光具有
如下三个特点：
（ 1）磷光辐射的波长比荧光长
分子的 T1态能量比 S1态低。
（ 2）磷光的寿命比荧光长
由于荧光是 S1 ? S0跃迁产生的，这种跃迁
是自旋许可的跃迁，因而 S1态的辐射寿命通常在
10-7~ 10-9s,磷光是 T1 ? S0跃迁产生的，这种跃
迁属自旋禁阻的跃迁，其速率常数要小，因而辐射
寿命要长，大约为 10-4~ 10s。
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（ 3） 磷光的寿命和辐射强度对于重原子和
顺磁性离子敏感。
1,低温磷光
由于激发三重态的寿命长，使激发态分
子发生 T1? S0这种分子内部的内转化非辐
射去活化过程以及激发态分子与周围的溶剂
分子间发生碰撞和能量转移过程，或发生某
些光化学反应的几率增大，这些都将使磷光
强度减弱，甚至完全消失。为减少这些去活
化过程的影响，通常应在低温下测量磷光。
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2.室温磷光
由于低温磷光需要低温实验装置，溶剂选择的
限制等因素，从而发展了多种室温磷光法（ RTP）。
（ 1） 固体基质室温磷光法（ SS-RTP）
此法基于测量室温下 吸附于固体基质上 的有机
化合物所发射的磷光。所用的载体种类较多，有 纤
维素载体 （如滤纸、玻璃纤维）,无机载体 （如硅
胶、氧化铝）以及 有机载体 （如乙酸钠、聚合物、
纤维素膜）等。 理想的载体 是既能将分析物质牢固
地束缚在表面或基质中以增加其刚性，并能减小三
重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不
产生磷光背景 。
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（ 2）胶束增稳的溶液室温磷光法（ MS-
RTP）
当溶液中表面活性剂的浓度达到临界胶
束浓度后，便相互聚集形成胶束。由于这种
胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定
向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理
性质,减小了内转化和碰撞能量损失 等非辐
射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的
稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷
光。 利用胶束稳定的因素，结合重原子效应，
并对溶液除氧，是 MS-RTP 的三个要素。
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（ 3）敏化溶液室温磷光法（ SS-RTP）
该法在 没有表面活性剂存在 的情况
下获得溶液的室温磷光。 分析物质被激
发后并不发射荧光,而是经过 系间跨越
过程衰减变至最低激发三重态。当有某
种合适的能量受体存在时，发生了由 分
析物质到受体 的三重态能量 转移,最后
通过测量 受体所发射的室温磷光强度 而
间接测定该分析物质。在这种方法中，
分析物质本身并不发磷光，而是引发受
体发磷光。
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3,磷光分析仪
在荧光分光光度计上配上磷光配件后，即
可用于磷光测定。
1.液槽：将样品放在盛有液氮的石英杜瓦
瓶内，即可用于低温磷光测定。
2.斩波片：分别测荧光和磷光；测出不同
寿命的磷光。
4,应用
磷光分析主要用于测定有机化合物，如
石油产品、多环芳烃、农药、药物等方面 。
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第二节 化学发光分析
某些物质在进行化学反应时，由于 吸收
了反应时产生的化学能,而使 反应产物分子
激发至激发态,受激分子由激发态回到基态
时，便发出一定波长的光。这种 吸收化学能
使分子发光的过程称为化学发光 。 利用化学
发光反应而建立起来的分析方法称为化学发
光分析法 。化学发光也发生于生命体系，这
种发光称为生物发光。
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一、化学发光分析的基本原理
化学发光是吸收化学反应过程产生的化
学能，而使反应产物分子激发所发射的光。
任何一个化学发光反应都应包括化学激发和
发光两个步骤，必须满足如下条件：
（ 1）化学反应必须提供足够的激发能，激
发能主要来源于反应焓。
（ 2）要有有利的化学反应历程，使化学反
应的能量至少能被一种物质所接受并生成激
发态。
（ 3）激发态能释放光子或能够转移它的能
量给另一个分子，而使该分子激发，然后以
辐射光子的形式回到基态。
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化学发光反应效率 ?cl,又称化学发光的总量
子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发
效率 ?ce和激发态分子的发射效率 ?em。 定义为：
?cl =发射光子的分子数 / 参加反应的分子数 =
?ce??em
化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及
光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。
每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不
同的化学发光效率。
化学发光反应的发光强度 Icl以单位时间内发射
的光子数表示 。 它与 化学发光反应的速率有关, 而
反应速率又与 反应分子浓度 有关 。 即
Icl （ t） = ?cl ? dc/dt
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二、化学发光反应类型
1,直接化学发光和间接化学发光
直接发光 是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，
生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。
A + B? C* + D
C* ? C + h?
式中 A或 B是被测物, 通过反应生成电子激发态产物 C*, 当
C* 跃迁回基态时, 辐射光子 。
间接发光 是被测物 A或 B，通过化学反应生成初始激发
态产物 C*, C* 不直接发光，而是将其能量转移给 F,使 F
跃迁回基态，产生发光。
A + B? C* + D
C*+F? F* + E
F* ? F + h?
式中 C*为能量给予体, 而 F为能量接受体
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2,气相化学发光和液相化学发光
按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中
进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为
液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为
异相化学发光。
（ 1）气相化学发光
主要有 O3,NO,S的化学发光反应，可用于
监测空气中的 O3,NO,SO2,H2S,CO,NO2等。
臭氧与乙烯的化学发光反应； 一氧化氮与臭
氧的化学发光反应。（ 教材 P.99）
（ 2） 液相化学发光
用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、
光泽碱、洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，
可测定痕量的 H2O2以及 Cu,Mn,Co,V,Fe,Cr、
Ce等金属离子。
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三、化学发光的测量装置
化学发光分析法的测量仪器主要包括 样
品室、光检测器、放大器和信号输出装置。
化学发光反应在样品室中进行，样品和
试剂混合的方式有 分立取样式,加样是间歇
的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池
内，然后用进样器加入分析物。另一种方法
是 流动注射式,反应试剂和分析物是定时在
样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移
动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲
线的一部分，而以峰高进行定量测量。
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应用：
?化学发光分析测定的物质可以分为三
类,第一类物质是化学发光反应中的
反应物 ;第二类物质是化学发光反应
中的催化剂、增敏剂或抑制剂 ;第三
类物质是偶合反应中的反应物、催化
剂、增敏剂等。这三类物质还可以通
过标记方式用来测定人们感兴趣的其
他物质,进一步扩大了化学发光分析
的应用范围。
?对象：无机物、有机物、生物物质等
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? 流动注射化学发光分析法具有选择性好、
灵敏度高 (1 0 -1 2 -1 0 -2 2 ｍｏｌ,Ｌ -1 ),设备
简单等优点,已在生命科学、环境科学等领
域发挥了巨大的作用,虽然已知的化学发光
体系很多,但应用较广的基本上只有 ｌｕｍ
ｉｌｏｌ 和ＴＣＰＯ体系,今后将继续引入
新的化学发光体系,并着重纳米级光纤化学
发光以及无损、在体、多组分和多信息方
面的研究,以满足日益增长的生命科学生物
分析和环境监测的需要。
