发酵工程 精品课程
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第八章 典型培养过程
传统微生物培养
重组菌培养
动物细胞培养
传统微生物培养前面已讲述很多，本章着重在
后两方面的介绍
典型培养过程
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第一节 基因工程菌培养
一、概述
基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非
蛋白质。
非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这
些细胞插入编码酶的 DNA，产生新的途径或增强
某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。
现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如
下：
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细胞因子、疫苗、酶
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产品最主要的用于人的治疗，此外还有用
于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用
于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病
人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难
性的。
有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、
磷酸化后才有活性。
治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安
全，降低成本并不重要，由于这些产品大多
用量很小，价格高，附加值高。
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二、宿主 -载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，
一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食
品要考虑宿主菌是否列入 FDA表中，列入的
认为是安全的菌。常用的宿主系统有：
大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
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1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最
普遍选用的宿主。
优点：
?人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解
得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基
因操作；
?大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高
细胞浓度（ 50g/l）；
?大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
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这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大
肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌
分泌 (secretion)的蛋白通常在细胞内,当这些
蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的 包
含体 。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细
胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠
的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复
性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热
冲击调节子的一种响应是增加 蛋白水解酶的活
性 。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋
白的降解速率几乎等于产生的速率。
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2,G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是
G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌
（ excretion）到胞外。它的这一性质对生
产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题
妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产
生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯
草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定
性也比较差，所以在使用上有较大的限制，
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，
它的最大生长速率是大肠杆菌的 25%，酵母比
最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有
简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它
的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困
难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了
其他的酵母如甲醇营养型酵母等。
当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后
修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物
细胞组织培养来达到。
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4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，
而且所有转录后处理与在整个动物中相同，
在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它
可提供 最接近于天然副本的产物,此外多数
产物 可以分泌到胞外 。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋
白表达水平较低。用于重组 DNA 生产蛋白的
最常用的宿主是 CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
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三、利用基因工程菌生产的特点
?基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质
粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳
定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快
得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制
基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压
力，如抗生素。
?基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生
长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物
表达。
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四、基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量
外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是
致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生
长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这
就导致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因：
?分离丢失、
?结构不稳定性
?宿主细胞调节突变
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1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离
丢失。质粒可分为高拷贝质粒（ >20拷贝 /细胞）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。
低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等
的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子
代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一
些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形
成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中
一个）。
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但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在
无质粒细胞，例如 1000L发酵液，每毫升有 109
个细胞，总共就有 1015个细胞，那么在这个反应
器中就含有 109个无质粒细胞。
质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶
氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在
一起形成一个单位。
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2、质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留质粒，但
质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白,减少对细
胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发
生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源
蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基
中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来
的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的
质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳
定性。
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3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突
变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。
例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞
的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改
变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是
操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如
IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖
苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构
类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体
系统和原宿主 -载体系统的生长速率不同。
如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主 -
载体系统有生长优势，那么改变了的系统将
最终占优势，基因不稳定性就出现。
表达的诱导
基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要
有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、
氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
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五、重组大肠杆菌的高密度培养策略
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（ OD值或 A值）在
波长 600～ 660
菌生长的障碍是
?重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢
?重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成
后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水
性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会
导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的 比生长速率往往
远小于宿主菌。
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高表达的障碍是：
外源基因的不稳定，造成表达的下降。
高生长速率与高表达之间的矛盾
乙酸的产生
蛋白的降解
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高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取了连续培
养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制
作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，
从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实
现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效
的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是
反馈补料培养。有几种反馈控制
控制基质浓度流加
恒 pH流加
恒溶氧流加
控制比生长速率的葡萄糖流加
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1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙
酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极
检测发酵液中的葡萄糖含量,葡萄糖电极通
过反馈系统与补糖单元相连。 当葡萄糖浓度
在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由
于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄
糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄
糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制
效应，达到很高的细胞浓度。
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2、恒 pH流加
大肠杆菌在 LB培养基上生长,pH会上升。这是
由于菌体分解 LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨
积累的原因。因此用 葡萄糖代替酸液进行恒 pH
流加。 实验通过 pH反馈控制系统流加葡萄糖,
使 pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，
细胞密度是无流加的 2倍。可以以葡萄糖代替酸
液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水
和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往
不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适
宜。
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3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖 。当培养液的氧饱和
百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补
糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而
减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下
降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减
少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需
平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，
用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、
搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，
从而获得高密度和高表达
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加
菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相
关。比生长速率太大，超过某一值，易产生
乙酸，这一比生长速率值称为菌体的 乙酸产
生临界比生长速率。 通过考察得出最优比生
长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生
长速率。
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六、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
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1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现
当 发酵液的溶氧为 1.8~2.6ppm/L时，菌体湿
重为 1.9~2.08g/L外源基因表达量为
13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L
时菌体湿重为 2.27g/L外源基因表达量为 26.4%。
在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转
录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼
吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速
以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长
而且有利于外源蛋白产物的形成。
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2,pH值对工程菌生长和表达的影响
在相同通气量和搅拌速度下,pH值对不
同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达
有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段
培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为
蛋白诱导表达阶段。偏碱性的 pH对外源
蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节
pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高
水平表达。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间,加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，
但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，
合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响
诱导时间 酶活力 酶表达水平
0 0.02
1 52.3 37%
2 118.8 57%
3 120.8 67%
4 165.0 68%
5 139.9 64%
*L-天冬酰氨酶
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4、诱导时机对表达的影响
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10
时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶
蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌
体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，
氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速
度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受
到影响。
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诱导时机对酶表达水平和活力的影响
生物量（ A600） 酶活力 酶表达水平
0.015 6.0 15.0%
0.049 19.1 31.1%
0.160 72.5 41.5%
0.225 102.6 49.8%
0.295 165.0 57.7%
0.360 105.5 53.4%
0.410 62.4 44.5%
0.450 30.2 22.5%
*L-天冬酰氨酶
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5、乙酸对生长和表达的影响
（ 1）乙酸的产生及抑制作用机理
当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所
需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特
别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更
为严重。
乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环
有关。 Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代
谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，
不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅
靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生
成途径储备 ATP和 NADH。
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乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶
（ Pta）和乙酰激酶（ Ack），它们催化葡萄糖代
谢中从乙酰辅酶 A生成乙酸的两步酶促反应。
EL-Mansi和 Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在
中性 pH环境中以离子化（ CH3COO－ ）和质子化
（ CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具
有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细
胞内（ pH7.5）解离成 CH3COO-和 H＋,这样就降
低了膜内的 pH值，使膜内外的 pH差减小，减弱
了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰
乱了细胞的正常代谢和生理活性。
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（ 2）减少乙酸积累的对策
?宿主菌
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途
径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。
?培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影
响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复
合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成,Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘
氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。 Klemam等研究
了培养基 pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌
W3200在葡萄糖浓度为 5g/L,pH6.0的培养基中乙酸
生成量为 6g/L.而 pH7.5为 12g/L。
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?降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，
一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长
速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养
中，当稀释速率超过 0.2h－ 1才能检测到乙酸的
存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时
对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率
才能达到高密度、高表达发酵。
?降低培养温度
将温度从 370C降低到 26-300C可以降低菌体对营
养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。
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?透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发
酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组
菌的高密度发酵。 Lee等用中空纤维膜过滤装置除
去乙酸，可以在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌
而得到较高的密度
?限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其
浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大
多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方
法利用反馈的参数，如 pH,μ,OUR,CER作为控
制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使
培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。
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七、甲醇营养型酵母的生长和表达
（一）酵母作为宿主菌的优点
单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于
基因工程操作
具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有
适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境
和糖链加工系统
分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。
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酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌
之一，由于人们对酿酒酵母（ S.Cerevisiae）的遗
传学和生理学背景了解得多，及其表达的安全性。
但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：
一是缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常
用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，
如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；
二是分泌效率低，特别是对分子量大于 30KD的外
源蛋白几乎不分泌；
三是表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；
四是不适于高密度培养。
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（二）甲醇营养型酵母
甲醇营养型酵母主要包括 Candida、
Torulopsis,Hansenula,Pichia。 用作
表达宿主株的主要是 Hansenula和 Pichia。
基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型
酵母作为第二代酵母表达系统。
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甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一
的碳源和能量来源。因为甲醇能诱导其表达甲醇代
谢所需的酶，如醇氧化酶（ Alcohol Oxidase,AOX）
二羟丙酮合成酶（ Dihydroxy-acetone
synthase,DHAS）和过氧化氢酶（ Catalase），表
达的 DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的 60-80%。
而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时,AOX几乎
不表达。进一步研究表明,AOX的表达是转录水平
调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表
达。已经在 P.pastoris染色体中鉴定了二个 AOX基因
（ AOX1和 AOX2）,AOX1编码的蛋白质与 AOX2编
码的蛋白质有 97%的同源性，但 AOX1基因的启动子
（ PAOX1）受甲醇强烈诱导，而 PAOX2则很弱。
H.polymorpha染色体只有一个 AOX基因，也受甲醇
调节。
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甲醇营养性酵母的另一个特点是 甲醇代谢
所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体
中，形成区域化 。 在葡萄糖为碳源时，菌
体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，
而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占
到整个细胞体积的 80%，里面的蛋白质主
要 AOX和 DHAS。
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自 1987年 Gregg等首次在 P.pastoris菌中表达
乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，至少有
40多种外源蛋白在 P.pastoris 和
H.polymorpha中获得表达。表达产物分泌到
培养液中或聚集在胞浆，表达量最高的可达全
菌蛋白的 32%或每升 12g产物。
H.polymorpha表达比 P.pastoris有更多的优
点，如更高的耐热性（理想温度为 37-430C，
而 P.pastoris为 300C）和在甲醇诱导下更快的
生长速率，可减少培养时间，降低污染机会。
H.polymorpha更适于大分子量蛋（ 150KD）
的表达与分泌。
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为了提高外源表达蛋白在酵母细胞中的稳
定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下
几种方法：一是在培养液中补加一些富含
氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白
水解物，提高给酵母细胞蛋白酶过量的底
物，以减少目的蛋白的水解；二是由于
P.pastoris能耐受较宽的 pH范围（ pH3.0-
7.0），因此可调培养液 pH 值抑制蛋白水
解酶活性；三是改造 P.pastoris表达宿主
菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基
因，使目的蛋白稳定。
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酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，如
过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重要，
过氧化物酶体内不含 DNA，也无蛋白质合成机
制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基因编码
表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋白质结构
中必定存在一些进入过氧化物酶体所必须的局部
信息。如果把表达的外源蛋白运输进入过氧化物
酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白水解酶降
解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的
毒害作用。一些实验表明，甲醇营养型酵母分拣
外源蛋白进入过氧化物酶体，使之区域化的信号。
已鉴定出二种分拣进入过氧化物酶体所需的靶信
号 PTS1和 PTS2。
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由于甲醇营养型酵母表达系统具有一些特殊的优
点
（ 1）应用 AOX启动子，转录效率高，易于诱发
调控；
（ 2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，
适于高密度发酵，产量高；
（ 3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等
因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为
外源基因表达的系统。
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（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素
1、甲醇浓度对基因工程菌 P.Pestoris表达
rHSA的影响
按摇瓶培养方法每 24h分别补加甲醇使其在培
养基中浓度为 5,10,20,30,40,50g／ L诱
导培养 96h，结果见表 2(表中数据为 2个发酵瓶
平均值 )。
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在甲醇浓度为 10g／ L时毕赤酵母表达目的蛋白量达到
最高，这可能是当甲醇浓度小于 10g／ L，甲醇成为限制
性底物，限制了蛋白的表达当浓度高于 20g／ L时，甲酵
浓度过高，对目的蛋白的表达也有抑制作用。因此，在
摇瓶条件下，甲醇的最佳诱导浓度为 10g／ L。
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2,pH对基因工程菌 P.Pastoris表达 rHSA的影响
按摇瓶培养方法把菌种接至用 0.2mol/L的磷酸缓冲液
配制好的摇瓶诱导培养基中 pH分别为 5.43,5.72、
5.84,5.98,6.29,6.59和 7.05，每 24h加甲醇至终浓
度 10g／ L进行诱导培养。
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由基因工程菌 P.Pastoris表达目的蛋白和细胞光密度
曲线 (图 1)可以看出 pH为 5.84时目的蛋白表达量最高。
pH为 5.43时，目的蛋白基本没有表达，但细胞光密度
极大，说明在低 pH值条件下，适合细胞生长而不适合
目的的蛋白表达；当 pH值在 5.72— 7.00时，细胞光密
度基本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降的
趋势,pH为 7.05时，目的蛋白表达量明显下降。因此，
既利于 P.Pastoris细胞生长又利于目的蛋白高表达的
pH范围为 5.72— 6.59。
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3、接种量对基因工程菌 P.Pastoris表达
rHSA的影响
在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研究
中发现，产物表达量与接种量有关。在 BMGY
中培养菌体至 A600为 9，离心后水洗，分别用 4、
2,1,1／ 2,1／ 5,1／ 10倍体积 BMMY(1％
甲醇 )重悬，进行 2d的诱导表达。结果表明产
量随发酵密度增大而明显提高，重悬于 1／ 5体
积的 BMMY中 (相当于菌体吸收度 A600约 45)的
表达量最高，为 0.204g／ L，但增大到 A600为
90时，表达量有所下降 (见图 2)。
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4,(NH4)2SO4浓度对蛋白表达的影响
氮源是宿主菌合成异源蛋白所必须的成分，试验不同
浓度的 (NH4)2SO4对菌体生长的影响，所得结果见图 l。
(NH4)2SO4浓度太高或太低都会对蛋白的表达产生不
利影响。当 (NH4)2SO4浓度低于 50mg／ L时，蛋白的
表达很明显受到限制，而 (NH4)2SO4浓度高于 3.0g／ L
时则会抑制蛋白表达。另外由于目前高密培养
P.Pastorisr表达白蛋白通常只补加碳源和微量元素，
而只以流加氨水调节 pH来补充氮源。但诱导过程中
pH下降很少，因而补充的氮源也很少，可能会限制菌
的生长和白蛋白的分泌。由图 1也可以看出开始诱导后
每 24h补加 (NH4)2SO4,使其浓度维持在 2g/L左右，
蛋白表达量最大。
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5、微量量元素 PTM1的影响
对比加入 PTM1与不加 PTM1所分泌的总蛋白，前
者明显高于后者，这说明加入 PTM 1能够明显提
高 rHSA的表达，从图 3可知，总蛋白质量浓度由
119.0mg／ L增加到 192.3mg／ L，增加了 61.6％。
这是因为微量元素中含有 Ca2+,Fe3+,Zn2+，
Mg+等金属离子，还有 Co2+,I-,Mo2+在微生物
培养中经常使用这些金属离子，有助于提高培养
的细胞浓度、细胞得率和细胞产率；前 24h白蛋
白量增加迅速，此后增加缓慢，至 60h达最高，
然后呈下降趋势，可能是产生的蛋白酶分解了所
分泌的白蛋白。
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总结：
基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物有
许多相似之处，比如补料控制,pH控制、温
度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到高密
度。它的特殊之处在于外源基因的稳定性、
外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的防止以及
生长与表达的协调等方面，以达到高表达的
目的。
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思考题
1、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有哪些？
2、利用基因工程菌生产有哪些特点？
3、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？
4、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？
5、基因工程菌高表达的障碍是什么？
6、常规的高密度培养的措施有哪些？
7 重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？
8 与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？
9 重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？
10重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因子有哪些？
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第八章 典型培养过程
传统微生物培养
重组菌培养
动物细胞培养
传统微生物培养前面已讲述很多，本章着重在
后两方面的介绍
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第一节 基因工程菌培养
一、概述
基因工程菌生产的主要产品有二类，蛋白质和非
蛋白质。
非蛋白质产物可以通过代谢工程细胞来获得，这
些细胞插入编码酶的 DNA，产生新的途径或增强
某一途径，从而得到新的化合物或增加产量。
现代基因工程重点在蛋白质产物上，主要产品如
下：
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细胞因子、疫苗、酶
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产品最主要的用于人的治疗，此外还有用
于畜牧业、食品或工业用的生物催化剂。用
于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，由于病
人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难
性的。
有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、
磷酸化后才有活性。
治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安
全，降低成本并不重要，由于这些产品大多
用量很小，价格高，附加值高。
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二、宿主 -载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，
一般希望翻译后的处理要简单，如果用于食
品要考虑宿主菌是否列入 FDA表中，列入的
认为是安全的菌。常用的宿主系统有：
大肠杆菌
G+细菌
低等真核细胞
哺乳动物细胞
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1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最
普遍选用的宿主。
优点：
?人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解
得比其他任何生物深。有利于进行复杂的基
因操作；
?大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高
细胞浓度（ 50g/l）；
?大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
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这些因素给大肠杆菌许多经济上的优势。但大
肠杆菌不是完美的宿主。主要问题是大肠杆菌
分泌 (secretion)的蛋白通常在细胞内,当这些
蛋白达到高浓度时，会被水解或形成不溶的 包
含体 。其中主要是外源蛋白，但也含有其它细
胞物质。包含体中的蛋白是不折叠的，不折叠
的蛋白没有生物活性，必须重新溶解并使它复
性。
大量的外源蛋白的产生会触发热冲击响应。热
冲击调节子的一种响应是增加 蛋白水解酶的活
性 。在一些情况下，细胞内蛋白水解酶是使蛋
白的降解速率几乎等于产生的速率。
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2,G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是
G+菌，它没有外膜，并且能把蛋白分泌
（ excretion）到胞外。它的这一性质对生
产非常有吸引力。然而枯草杆菌有许多问题
妨碍它在商业上的采用。主要是枯草杆菌产
生大量的蛋白酶，会很快降解产物。而且枯
草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定
性也比较差，所以在使用上有较大的限制，
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3、低等真核细胞
酵母菌 酿酒酵母是第一个被人利用的生物，
它的最大生长速率是大肠杆菌的 25%，酵母比
最大的细菌大，容易从发酵液中回收。酵母有
简单糖基化能力和分泌蛋白的能力。这些是它
的优点。但酵母达到高表达水平比大肠杆菌困
难，外源蛋白分泌到胞外也有限，现在发展了
其他的酵母如甲醇营养型酵母等。
当产生是外源蛋白需要复杂的糖基化和翻译后
修饰时，低等真核细胞就不能适应，要用动物
细胞组织培养来达到。
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4、哺乳动物细胞
哺乳动物细胞在表达时有正确的氨基酸排列，
而且所有转录后处理与在整个动物中相同，
在某种情况下可能转录后修饰有些不同但它
可提供 最接近于天然副本的产物,此外多数
产物 可以分泌到胞外 。
但动物细胞生长缓慢，培养基价格昂贵，蛋
白表达水平较低。用于重组 DNA 生产蛋白的
最常用的宿主是 CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
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三、利用基因工程菌生产的特点
?基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质
粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳
定。丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快
得多，这样就会大大降低产物的表达。为了抑制
基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压
力，如抗生素。
?基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生
长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物
表达。
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四、基因不稳定性
生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量
外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是
致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生
长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这
就导致基因的不稳定性。
基因的不稳定性原因：
?分离丢失、
?结构不稳定性
?宿主细胞调节突变
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1、分离丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离
丢失。质粒可分为高拷贝质粒（ >20拷贝 /细胞）和
低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。
低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等
的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子
代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一
些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形
成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中
一个）。
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但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在
无质粒细胞，例如 1000L发酵液，每毫升有 109
个细胞，总共就有 1015个细胞，那么在这个反应
器中就含有 109个无质粒细胞。
质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶
氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。
许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在
一起形成一个单位。
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2、质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留质粒，但
质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白,减少对细
胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发
生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源
蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基
中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来
的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的
质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳
定性。
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3、宿主细胞突变
宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突
变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。
例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞
的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改
变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是
操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如
IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖
苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构
类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。
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4、生长速率占优势的不稳定性
所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体
系统和原宿主 -载体系统的生长速率不同。
如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主 -
载体系统有生长优势，那么改变了的系统将
最终占优势，基因不稳定性就出现。
表达的诱导
基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要
有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、
氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。
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五、重组大肠杆菌的高密度培养策略
关键点：高密度、高表达
菌密度的测定：光密度（ OD值或 A值）在
波长 600～ 660
菌生长的障碍是
?重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢
?重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成
后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水
性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会
导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的 比生长速率往往
远小于宿主菌。
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高表达的障碍是：
外源基因的不稳定，造成表达的下降。
高生长速率与高表达之间的矛盾
乙酸的产生
蛋白的降解
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高密度培养的措施
分批补料培养 以分批培养为基础，吸取了连续培
养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制
作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，
从而有效地控制了菌体的生长过程。因此，要实
现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效
的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是
反馈补料培养。有几种反馈控制
控制基质浓度流加
恒 pH流加
恒溶氧流加
控制比生长速率的葡萄糖流加
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1、控制基质浓度流加
用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙
酸、氨等）。以葡萄糖为例，用葡萄糖电极
检测发酵液中的葡萄糖含量,葡萄糖电极通
过反馈系统与补糖单元相连。 当葡萄糖浓度
在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由
于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄
糖以一定速率加入。这样，发酵液中的葡萄
糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制
效应，达到很高的细胞浓度。
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2、恒 pH流加
大肠杆菌在 LB培养基上生长,pH会上升。这是
由于菌体分解 LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨
积累的原因。因此用 葡萄糖代替酸液进行恒 pH
流加。 实验通过 pH反馈控制系统流加葡萄糖,
使 pH恒定，结果推迟了比生长速率的降低时间，
细胞密度是无流加的 2倍。可以以葡萄糖代替酸
液，以氨水代替氢氧化钠碱液，同时流加氨水
和葡萄糖。这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往
不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适
宜。
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3、恒溶氧流加
用复膜氧电极来控制补糖 。当培养液的氧饱和
百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补
糖。加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而
减少氧饱和百分数，引起读数下降。当读数下
降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减
少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需
平衡。 Konstantinov等进一步发展了这种方法，
用 DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、
搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，
从而获得高密度和高表达
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加
菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相
关。比生长速率太大，超过某一值，易产生
乙酸，这一比生长速率值称为菌体的 乙酸产
生临界比生长速率。 通过考察得出最优比生
长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生
长速率。
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六、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8%
2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7%
3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2%
4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4%
5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9%
*鲤鱼生长激素基因工程菌
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1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
在鲤鱼生长激素基因工程菌的发酵研究中发现
当 发酵液的溶氧为 1.8~2.6ppm/L时，菌体湿
重为 1.9~2.08g/L外源基因表达量为
13.8%~16.7%，而当溶氧值提高到 4.0ppm/L
时菌体湿重为 2.27g/L外源基因表达量为 26.4%。
在诱导表达期间，要维持外源基因的高水平转
录和翻译，细胞需要大量的能量代谢以促进呼
吸作用。因此通过增大通气量和提高搅拌转速
以保证较大的溶氧值，不仅提高工程菌的生长
而且有利于外源蛋白产物的形成。
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2,pH值对工程菌生长和表达的影响
在相同通气量和搅拌速度下,pH值对不
同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达
有一定影响。由于工程菌培养采用两阶段
培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为
蛋白诱导表达阶段。偏碱性的 pH对外源
蛋白的表达不利，因此，表达开始要调节
pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高
水平表达。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响
诱导时间,加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，
但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，
合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响
诱导时间 酶活力 酶表达水平
0 0.02
1 52.3 37%
2 118.8 57%
3 120.8 67%
4 165.0 68%
5 139.9 64%
*L-天冬酰氨酶
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4、诱导时机对表达的影响
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10
时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶
蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌
体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，
氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速
度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受
到影响。
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诱导时机对酶表达水平和活力的影响
生物量（ A600） 酶活力 酶表达水平
0.015 6.0 15.0%
0.049 19.1 31.1%
0.160 72.5 41.5%
0.225 102.6 49.8%
0.295 165.0 57.7%
0.360 105.5 53.4%
0.410 62.4 44.5%
0.450 30.2 22.5%
*L-天冬酰氨酶
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5、乙酸对生长和表达的影响
（ 1）乙酸的产生及抑制作用机理
当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所
需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，特
别是在培养时间较长的高密度发酵过程中，问题更
为严重。
乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环
有关。 Han认为细菌在低比生长速率下通过氧化代
谢的作用产生的能量足以满足合成和异化的需求，
不会产生乙酸，而在髙比生长速率时，大肠杆菌仅
靠氧化代谢不能提供足够的能量，必须通过乙酸生
成途径储备 ATP和 NADH。
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乙酸的生成需要两个关键性的酶，磷酸转乙酰酶
（ Pta）和乙酰激酶（ Ack），它们催化葡萄糖代
谢中从乙酰辅酶 A生成乙酸的两步酶促反应。
EL-Mansi和 Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在
中性 pH环境中以离子化（ CH3COO－ ）和质子化
（ CH3COOH）两种形式存在，质子化的乙酸具
有弱的亲脂性可以穿过细胞质膜进入胞内，在细
胞内（ pH7.5）解离成 CH3COO-和 H＋,这样就降
低了膜内的 pH值，使膜内外的 pH差减小，减弱
了质子的推动力，产生的能量就被大大减少，扰
乱了细胞的正常代谢和生理活性。
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（ 2）减少乙酸积累的对策
?宿主菌
不同的宿主产生乙酸不同，可通过诱变使乙酸生成途
径中的两个关键酶，有一个突变了或活性降低了，使乙酸合成受阻。
?培养基
培养基组成能影响乙酸的产生，特别是碳源的含量影
响最大。在基本培养基中大肠杆菌产生的乙酸比在复
合培养基中产生少。另外用甘油取代葡萄糖可以降低乙酸的生成,Han等在培养基中加入某些氨基酸（甘
氨酸、甲硫氨酸）减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。 Klemam等研究
了培养基 pH值对产生乙酸的影响，发现重组大肠杆菌
W3200在葡萄糖浓度为 5g/L,pH6.0的培养基中乙酸
生成量为 6g/L.而 pH7.5为 12g/L。
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?降低比生长速率
细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高，
一般来说，在合成培养基中，当重组菌的生长
速率超过某个临界值便产生乙酸。在连续培养
中，当稀释速率超过 0.2h－ 1才能检测到乙酸的
存在。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时
对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率
才能达到高密度、高表达发酵。
?降低培养温度
将温度从 370C降低到 26-300C可以降低菌体对营
养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。
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?透析培养
在重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发
酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组
菌的高密度发酵。 Lee等用中空纤维膜过滤装置除
去乙酸，可以在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌
而得到较高的密度
?限制性流加葡萄糖
利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其
浓度在较低的范围内，减少乙酸的生成。目前大
多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方
法利用反馈的参数，如 pH,μ,OUR,CER作为控
制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使
培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。
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七、甲醇营养型酵母的生长和表达
（一）酵母作为宿主菌的优点
单细胞低等真核生物，易于培养、繁殖快、便于
基因工程操作
具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，具有
适合于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境
和糖链加工系统
分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。
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酿酒酵母最先内用来作为外源基因的表达宿主菌
之一，由于人们对酿酒酵母（ S.Cerevisiae）的遗
传学和生理学背景了解得多，及其表达的安全性。
但酿酒酵母表达系统也存在一些问题：
一是缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常
用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，
如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；
二是分泌效率低，特别是对分子量大于 30KD的外
源蛋白几乎不分泌；
三是表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；
四是不适于高密度培养。
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（二）甲醇营养型酵母
甲醇营养型酵母主要包括 Candida、
Torulopsis,Hansenula,Pichia。 用作
表达宿主株的主要是 Hansenula和 Pichia。
基于以上的问题，人们发展了甲醇营养型
酵母作为第二代酵母表达系统。
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甲醇营养型酵母的重要特性是能利用甲醇作为唯一
的碳源和能量来源。因为甲醇能诱导其表达甲醇代
谢所需的酶，如醇氧化酶（ Alcohol Oxidase,AOX）
二羟丙酮合成酶（ Dihydroxy-acetone
synthase,DHAS）和过氧化氢酶（ Catalase），表
达的 DHAS的含量甚至可达到总细胞蛋白的 60-80%。
而当以葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源时,AOX几乎
不表达。进一步研究表明,AOX的表达是转录水平
调控的，其启动子能非常有效地控制外源基因的表
达。已经在 P.pastoris染色体中鉴定了二个 AOX基因
（ AOX1和 AOX2）,AOX1编码的蛋白质与 AOX2编
码的蛋白质有 97%的同源性，但 AOX1基因的启动子
（ PAOX1）受甲醇强烈诱导，而 PAOX2则很弱。
H.polymorpha染色体只有一个 AOX基因，也受甲醇
调节。
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甲醇营养性酵母的另一个特点是 甲醇代谢
所需的三种酶被分拣转运入过氧化物酶体
中，形成区域化 。 在葡萄糖为碳源时，菌
体中只有一个或几个很小的过氧化物酶体，
而在甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占
到整个细胞体积的 80%，里面的蛋白质主
要 AOX和 DHAS。
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自 1987年 Gregg等首次在 P.pastoris菌中表达
乙型肝炎表面抗原以来，短短几年间，至少有
40多种外源蛋白在 P.pastoris 和
H.polymorpha中获得表达。表达产物分泌到
培养液中或聚集在胞浆，表达量最高的可达全
菌蛋白的 32%或每升 12g产物。
H.polymorpha表达比 P.pastoris有更多的优
点，如更高的耐热性（理想温度为 37-430C，
而 P.pastoris为 300C）和在甲醇诱导下更快的
生长速率，可减少培养时间，降低污染机会。
H.polymorpha更适于大分子量蛋（ 150KD）
的表达与分泌。
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为了提高外源表达蛋白在酵母细胞中的稳
定性，免受蛋白酶的降解，通常采用以下
几种方法：一是在培养液中补加一些富含
氨基酸的组分如胃蛋白酶水解物或酪蛋白
水解物，提高给酵母细胞蛋白酶过量的底
物，以减少目的蛋白的水解；二是由于
P.pastoris能耐受较宽的 pH范围（ pH3.0-
7.0），因此可调培养液 pH 值抑制蛋白水
解酶活性；三是改造 P.pastoris表达宿主
菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶的基
因，使目的蛋白稳定。
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酵母细胞是真核生物，具有一些亚细胞结构，如
过氧化物酶体等，它们对细胞的功能极端重要，
过氧化物酶体内不含 DNA，也无蛋白质合成机
制，所有过氧化物酶体内的蛋白都由核基因编码
表达，再转运入过氧化物酶体。因此蛋白质结构
中必定存在一些进入过氧化物酶体所必须的局部
信息。如果把表达的外源蛋白运输进入过氧化物
酶体储存起来，不仅可使蛋白免受蛋白水解酶降
解，增加其稳定性，还可减少外源蛋白对宿主的
毒害作用。一些实验表明，甲醇营养型酵母分拣
外源蛋白进入过氧化物酶体，使之区域化的信号。
已鉴定出二种分拣进入过氧化物酶体所需的靶信
号 PTS1和 PTS2。
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由于甲醇营养型酵母表达系统具有一些特殊的优
点
（ 1）应用 AOX启动子，转录效率高，易于诱发
调控；
（ 2）表达质粒易于整合到基因组，不易丢失，
适于高密度发酵，产量高；
（ 3）表达产物分拣进入过氧化物酶体等
因此最近十几年来，人们越来越多的应用它作为
外源基因表达的系统。
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（三）甲醇营养型酵母培养中的影响因素
1、甲醇浓度对基因工程菌 P.Pestoris表达
rHSA的影响
按摇瓶培养方法每 24h分别补加甲醇使其在培
养基中浓度为 5,10,20,30,40,50g／ L诱
导培养 96h，结果见表 2(表中数据为 2个发酵瓶
平均值 )。
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在甲醇浓度为 10g／ L时毕赤酵母表达目的蛋白量达到
最高，这可能是当甲醇浓度小于 10g／ L，甲醇成为限制
性底物，限制了蛋白的表达当浓度高于 20g／ L时，甲酵
浓度过高，对目的蛋白的表达也有抑制作用。因此，在
摇瓶条件下，甲醇的最佳诱导浓度为 10g／ L。
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2,pH对基因工程菌 P.Pastoris表达 rHSA的影响
按摇瓶培养方法把菌种接至用 0.2mol/L的磷酸缓冲液
配制好的摇瓶诱导培养基中 pH分别为 5.43,5.72、
5.84,5.98,6.29,6.59和 7.05，每 24h加甲醇至终浓
度 10g／ L进行诱导培养。
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由基因工程菌 P.Pastoris表达目的蛋白和细胞光密度
曲线 (图 1)可以看出 pH为 5.84时目的蛋白表达量最高。
pH为 5.43时，目的蛋白基本没有表达，但细胞光密度
极大，说明在低 pH值条件下，适合细胞生长而不适合
目的的蛋白表达；当 pH值在 5.72— 7.00时，细胞光密
度基本相同，而目的蛋白表达量基本是呈逐渐下降的
趋势,pH为 7.05时，目的蛋白表达量明显下降。因此，
既利于 P.Pastoris细胞生长又利于目的蛋白高表达的
pH范围为 5.72— 6.59。
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3、接种量对基因工程菌 P.Pastoris表达
rHSA的影响
在用重组毕赤酵母生产人骨唾液酸蛋白的研究
中发现，产物表达量与接种量有关。在 BMGY
中培养菌体至 A600为 9，离心后水洗，分别用 4、
2,1,1／ 2,1／ 5,1／ 10倍体积 BMMY(1％
甲醇 )重悬，进行 2d的诱导表达。结果表明产
量随发酵密度增大而明显提高，重悬于 1／ 5体
积的 BMMY中 (相当于菌体吸收度 A600约 45)的
表达量最高，为 0.204g／ L，但增大到 A600为
90时，表达量有所下降 (见图 2)。
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4,(NH4)2SO4浓度对蛋白表达的影响
氮源是宿主菌合成异源蛋白所必须的成分，试验不同
浓度的 (NH4)2SO4对菌体生长的影响，所得结果见图 l。
(NH4)2SO4浓度太高或太低都会对蛋白的表达产生不
利影响。当 (NH4)2SO4浓度低于 50mg／ L时，蛋白的
表达很明显受到限制，而 (NH4)2SO4浓度高于 3.0g／ L
时则会抑制蛋白表达。另外由于目前高密培养
P.Pastorisr表达白蛋白通常只补加碳源和微量元素，
而只以流加氨水调节 pH来补充氮源。但诱导过程中
pH下降很少，因而补充的氮源也很少，可能会限制菌
的生长和白蛋白的分泌。由图 1也可以看出开始诱导后
每 24h补加 (NH4)2SO4,使其浓度维持在 2g/L左右，
蛋白表达量最大。
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5、微量量元素 PTM1的影响
对比加入 PTM1与不加 PTM1所分泌的总蛋白，前
者明显高于后者，这说明加入 PTM 1能够明显提
高 rHSA的表达，从图 3可知，总蛋白质量浓度由
119.0mg／ L增加到 192.3mg／ L，增加了 61.6％。
这是因为微量元素中含有 Ca2+,Fe3+,Zn2+，
Mg+等金属离子，还有 Co2+,I-,Mo2+在微生物
培养中经常使用这些金属离子，有助于提高培养
的细胞浓度、细胞得率和细胞产率；前 24h白蛋
白量增加迅速，此后增加缓慢，至 60h达最高，
然后呈下降趋势，可能是产生的蛋白酶分解了所
分泌的白蛋白。
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总结：
基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物有
许多相似之处，比如补料控制,pH控制、温
度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到高密
度。它的特殊之处在于外源基因的稳定性、
外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的防止以及
生长与表达的协调等方面，以达到高表达的
目的。
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思考题
1、利用基因工程菌生产，有什么优势？常用的宿主菌有哪些？
2、利用基因工程菌生产有哪些特点？
3、重组菌基因不稳定性的原因有哪些？
4、在基因工程菌培养过程中为什么质粒会丢失？
5、基因工程菌高表达的障碍是什么？
6、常规的高密度培养的措施有哪些？
7 重组菌与传统微生物在产物表达上有什么区别？
8 与大肠杆菌相比酵母作为宿主菌有什么优点？
9 重组菌与传统菌在发酵过程控制中有哪些相同之处？
10重组大肠杆菌的诱导因子有哪些？重组酵母的诱导因子有哪些？
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