发酵工程 精品课程
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第二节 动物细胞培养
典型过程培养
?动物细胞培养
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动物细胞和微生物细胞的总体差异
内容 微生物细胞 动物细胞
细胞壁 普遍存在 存在
生长速率 0.1~0.5h-1 0.01~0.05h-1
需氧量 高 低
营养要求 普遍简单 复杂
CO2需求 一些微生物需 CO2 许多需要 CO2形成缓冲
液
环境影响 小 大
大小范围 100~2000nm 10000~100000nm
接种浓度 低 高（ 10-5.ml-1）
生长浓度 高（ 109~1010.ml-1） 低（ 106.ml-1）
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一、动物细胞培养的特性
动物细胞培养是指在合适的培养条件下，
动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性
和功能的技术，这些细胞不再形成组织。
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1 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素
2 细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差
3 需氧少，不耐受强力通风与搅拌
4 群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）
5 培养过程产品分布细胞内外，成本高
6 原代培养细胞一般繁殖 50代即退化死亡
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两个专业术语
细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培
养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。
细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培
养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记
的培养物称为细胞株。
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细胞生长的类型
贴壁依赖性 来自动物实体组织的大多数细胞需
要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁
依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，
才能生长。
非贴壁依赖性细胞 无需贴附到固体介质上就能
生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细
胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它
们形态呈圆形。
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生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附
于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅
速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对
数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并
形成致密的细胞单层。
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贴壁培养的优点：
●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，
可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养
液。
●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度
的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有
效的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液 /细胞的比例。
●适用于所有类型细胞。
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.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比
●扩大培养比较困难，投资大；
●占地面积大；
●不能有效监测细胞的生长；
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二、细胞培养物的获得
原代培养物
在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎
成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使
组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培
养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细
胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最
易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。
仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某
些细胞类型的生长。
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转化细胞
正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控
制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二
倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性
细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，
虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止
单层。
细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在培养中
自发转化②化学转化。某些化学致癌物会增加转
化频率③病毒转化。④致瘤因子转化
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转化细胞由于有无限寿命，在培养中更
易生长，被广泛用于生成生物制品，如
重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人
们对她们的安全性仍然非常关心，对可
能造成的生物危害性进行严格的检测和
控制。
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肿瘤细胞
肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤
细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤
细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基
本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的
增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖
程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。。
肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治
疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯
化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认
识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交
瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，
C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。
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体外培养所需的一般条件
适宜的培养皿 血清成分 370C CO25
％
95～ 100％湿度 抗生素
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培养基
培养基配置考虑的因素的
?pH 多数细胞系在 pH7.4下生长得很好。
一些正常的成纤维细胞系以 7.4~7.7最好，转
化细胞系以 pH7.0~7.4更合适。
?缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生
大量二氧化碳和乳酸，引起 pH下降，需要在
培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、
HEPES(N-2-羟乙基哌嗪 -N’-2-乙磺酸 N-[2-
Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic
acid ] )
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温度 低温下 CO2溶解度增加，引起 pH
变化。
黏度 培养基的黏度主要受血清含量
的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受
损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基
吡咯烷增加培养基黏度
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细胞培养基的基本组成
1、水
细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水
的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物
标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应
高于注射用水标准。
2、能源和碳源
主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能
用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖
很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更
偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要
的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它
的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷
酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。
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3、氮源
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞
合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可
少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的
种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到
的谷氨酰胺外，还有 12种氨基酸不能在细胞
内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所
有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需
要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含
量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加
氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产
物产率。
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4、维生素
维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要
生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基
或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。
5、无机离子
无机离子分为两组，一种是含量较高的，，
包括维持膜电势的（ Na+,K+），维持渗透
压平衡（ Na+,Cl－ ），作为酶的辅因子
（ Mg2+），促进细胞贴附（ Mg2+Ca2+），起
缓冲作用（ HPO42-,HCO3-）；另一种势微
量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。
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6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细
胞培养中，脂类来自血清，在无血清培
养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固
醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，
对某种脂类有很高的依赖性。
非营养性物质
1、抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培
养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。
2,pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，
常用浓度 26mmol/L，接近血中浓度，必须与
5％～ 10％ CO2平衡，否则培养基迅速变碱。
HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它
相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。
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3、酚红
酚红普遍作为培养基的 pH指示剂
4、保护剂
细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、
毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反
应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产
生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、
葡聚糖,PEG、聚乙烯吡咯烷酮,Pluronic F68、
血清白蛋白，能够减轻这种损伤。
5、还原剂
某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。 β－巯基乙
醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱
氨酸利用。
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血清
常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马
血清和人血清。最常用的是小牛血清。
血清是极其复杂的混合物，含有食物物
质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细
胞释放物质、采血中引入的污染物。由
于历史原因，商业培养基大都是按添加
血清来设计的，使用血清技术也很成熟，
尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为
细胞培养最重要的添加剂普遍采用。
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三、细胞计数及活力测定
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度
才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数
结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理
和方法与血细胞计数相同。
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在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，
总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由
组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离
的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也
要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，
从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些
酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相
对数和相对活力。
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四、培养物的污染及防止
污染途径
1 空气：空气流动性大，如果培养操作场地
于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁
空气很容易进入造成污染。因此，培养设施
不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内
进行，工作时要带口罩
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2 器材：各种培养器皿
3 操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟
练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以
造成污染。
4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体
或病毒等污染，变成了污染。
5 组织样本：原代培养的污染多数来源于组
织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可
造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细
胞细胞生长。
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五、动物细胞的大规模培养
（一）培养环境
1、温度 温度是细胞在体外生存的基本条件
之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温
度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是 25～
280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是 370C，
细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范
围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚
至导致死亡。
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2,pH
大规模培养时影响培养液的 pH稳定性的主要因
素有三种：
（ 1）缓冲液的缓冲能力及种类
（ 2）对流空间大小
（ 3）葡萄糖浓度
培养液中正常的缓冲系统是 NaHCO3/CO2系统，
它是一种弱缓冲系统，其 pK为 6.1，低于生理学
最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的
对流空间加入 CO2以防止它的丢失及增加羟基
离子。
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也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞
有毒害作用。 HEPES生物缓冲剂也曾被加
入 NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于
HEPES的 pK为 7.0,HEPES被加入后，其
缓冲能力为 pH6.8～ 7.2。。但是当 HEPES
浓度高于 25mmol/L时，它对大多数动物细
胞都有毒害作用。
动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节
培养液中的 pH：
（ 1）在培养基中添加 NaHCO3作为缓冲剂
及通入含 CO2的空气进行调节
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（ 2）用 0.1mol/LNaON或 0.1mol/LHCl进
行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌
和弱混合，利用 NaOH或 HCl进行调节时
会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细
胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动
物细胞培养时不太合适。通常通过调节培
养基中 NaHCO3用量及通气中 CO2浓度来
控制发酵过程的 pH。
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3、溶解氧
大规模培养中如何提供足够的氧是非常
重要的。通气得得目的有两个：一是提
供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发
酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过
程。
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（三）培养容器
1、多孔板,Petri培养皿和组织培养方瓶都是常
用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易
放入培养箱内培养。
2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在
滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培
养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养
箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入
微载体以增加培养表面积。
3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设
备。它有各种不同形式，容积可以从 1升到几十
立方米。
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微载体
微载体是指直径在 60～ 250μm、适合于动物细胞
贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多
好处 ;① 可在反应器中提供大的比表面积②可采用
均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，
提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细
胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种
贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。微载体培养
系统的缺点是：①细胞生长在微载体表面，易受到
剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长②微载体价
格较贵，一般不能重复使用③需要较高的细胞接种
量。
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悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生
长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的
培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培
养与微生物过程比较接近，但由于动物细
胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，
在反应器的设计和操作上又有特殊要求 如
利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程
中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表
面气泡产生
具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧
传递速率
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目前，动物细胞培养用生物反应器主要
包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填
充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反
应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道
蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤
维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气
升式反应器等。
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细胞大规模培养生物反应器
气升式生物反应器
气升式生物反应器与其它反应器相比，
结构简单，无转动部件，细胞损伤率
低，减少了污染的机会；产生的湍动
温和而均匀，剪切力相当小；当大容
易；直接通气供氧，氧传递速率高，
供氧充分；液体循环量大，细胞和营
养成分混合均匀。存在问题：由于液
体混合的能量唯一来自通入的气体，
因而通气量大，泡沫多，而且气泡破
碎造成严重的细胞机械损伤
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通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器
转动时混合性能好，产生的剪切力小，
气泡产生的不利影响小。设计有多种形
式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。
笼式搅拌器有两个由 200目不锈钢丝网围成
的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消
泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气
腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的
液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫
经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液
两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在
反应器中积累。
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搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的
垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动
时，由于离心力的作用，搅拌器中心的
空腔产生负压，使培养基从底部吸入，
沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排
出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细
胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于
培养基，被培养基所裹胁，反复循环，
充分混合。
在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般
搅拌转速在 30～ 60r/min范围内，混合
时间为 12～ 24s。
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中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的
培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细
胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空
纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长
微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管
状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时
纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供
细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来
供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管
外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞
的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代
谢物对细胞的毒害作用。
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优点是：
●占地空间少；
●细胞产量高，细胞密度可达 109数量级；
●生产成本低，且细胞培养维持时间长，
适用于长期分泌的细胞。
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细胞生物反应器的控制系统
由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能
沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全
而有效地方法是高便通入培养罐内气体中
的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的
目的，
采用二氧化碳 /碳酸氢钠缓冲液系统来控
制培养液的 pH值，它主要是靠预先加入
培养基＝液中适量的碳酸氢钠和通过改变
气体流量中的二氧化碳含量来实现。
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生物反应器中的细胞培养模式
分批培养
分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反
应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也
不断形成，经过一定时间反应后，将整个反
应系取出。
流加培养
流加培养是指先将一定量的培养液装入反应
器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细
胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对
营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补
充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到
反应终止时，取出整个反应系。
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半连续培养
半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指
在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分
重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操
作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。
连续培养
连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器
内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，
另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处
于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，
连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳
定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细
胞生长和产物形成。
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灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方
面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面
又将反应液连续不断地取出，但细胞留在
反应器内，使细胞处于一种不断的营养状
态。
当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞
补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。
通过调节灌注速率可以把培养过程保持在
稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。
一般在分批培养中细胞密度为（ 2！ 4）
× 106cell/ml，在灌注系统中可达到（ 2～
5） × 107cell/ml。
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培养基研究进展 —— 无血清培养基
通常动物细胞的生长均有赖于血清的存
在，在普通培养基中，如不加血清，绝
大部分细胞将不能增殖。但使用血清的
主要弊端是存在潜在的污染源、不同批
号蛋白含量差异大及价格高等，给生物
制品的生产造成了不利。这就引发了人
们对无血清培养基的研究。结果发现，
只要在培养基中增加某些适于细胞生长
的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛
素和表皮生长因子等，不少细胞即能在
无血清供应的情况下生长，尤其是 CHO、
杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。
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其中胰岛素是无血清培养基中促进动物
细胞生长的最重要的多肽。 CHO细胞能
在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无
血清培养基中连续传代。在人类细胞培
养中，应用无血清培养基还能有选择性
地控制及避免成纤维细胞的过度生长。
某些细胞在无血清的条件下，其生长和
抗体的产量甚至较有血清培养时高出数
倍。另外．动物细胞培养应用无血清培
养基的成功，还将为某些疫苗的生产降
低成本。
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动物细胞和微生物细胞的总体差异
内容 微生物细胞 动物细胞
细胞壁 普遍存在 存在
生长速率 0.1~0.5h-1 0.01~0.05h-1
需氧量 高 低
营养要求 普遍简单 复杂
CO2需求 一些微生物需 CO2 许多需要 CO2形成缓冲
液
环境影响 小 大
大小范围 100~2000nm 10000~100000nm
接种浓度 低 高（ 10-5.ml-1）
生长浓度 高（ 109~1010.ml-1） 低（ 106.ml-1）
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一、动物细胞培养的特性
动物细胞培养是指在合适的培养条件下，
动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性
和功能的技术，这些细胞不再形成组织。
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1 细胞生长缓慢，易污染，培养需用抗生素
2 细胞大，无细胞壁，机械强度低，环境适应性差
3 需氧少，不耐受强力通风与搅拌
4 群体生长效应，贴壁生长（锚地依赖性）
5 培养过程产品分布细胞内外，成本高
6 原代培养细胞一般繁殖 50代即退化死亡
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两个专业术语
细胞系：首次分离组织的培养称之为原代培
养。原代培养物经传代成功后即成细胞系。
细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培
养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标记
的培养物称为细胞株。
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细胞生长的类型
贴壁依赖性 来自动物实体组织的大多数细胞需
要贴壁单层生长。只要它们没有转化为非贴壁
依赖性的必须贴伏在合适的固体介质上并铺展，
才能生长。
非贴壁依赖性细胞 无需贴附到固体介质上就能
生存和生长的细胞。来自血液、淋巴系统的细
胞和大多数肿瘤细胞常为非贴壁依赖性的，它
们形态呈圆形。
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生长特性：贴壁依赖型细胞在培养时要贴附
于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅
速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对
数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并
形成致密的细胞单层。
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贴壁培养的优点：
●容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，
可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养
液。
●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度
的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有
效的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液 /细胞的比例。
●适用于所有类型细胞。
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.贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比
●扩大培养比较困难，投资大；
●占地面积大；
●不能有效监测细胞的生长；
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二、细胞培养物的获得
原代培养物
在无菌条件下，用镊子和剪刀将切下的组织碎
成小块，再用胰蛋白酶等蛋白水解酶处理，使
组织解离成单个细胞，放入培养容器中无菌培
养。这种原代培养物中含有各种不同分化的细
胞类型，它们的生长速率不同，成纤维细胞最
易生长，常会在此后的传代培养中占据优势。
仔细控制培养基的成分，可以选择性地支持某
些细胞类型的生长。
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转化细胞
正常细胞经过一个转化的过程，丧失了对生长控
制的敏感性。转化伴随着染色体模式的改变，二
倍体变成异倍体。更典型的表现是，贴壁依赖性
细胞对贴壁的依赖及细胞密度的抑制发生改变，
虽然也许细胞仍需贴壁生长，但可能生长到不止
单层。
细胞转化有四种主要途径：①有些细胞在培养中
自发转化②化学转化。某些化学致癌物会增加转
化频率③病毒转化。④致瘤因子转化
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转化细胞由于有无限寿命，在培养中更
易生长，被广泛用于生成生物制品，如
重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人
们对她们的安全性仍然非常关心，对可
能造成的生物危害性进行严格的检测和
控制。
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肿瘤细胞
肿瘤细胞使来自于肿瘤组织的细胞或经肿瘤
细胞与其它细胞融合产生的细胞，如杂交瘤
细胞。与转化细胞相比，它们是恶性的，基
本上是非贴壁依赖性的。肿瘤细胞有很好的
增殖特性，生长速率高。对生长因子的依赖
程度低，对培养环境的要求也不那么苛刻。。
肿瘤细胞的致癌性是造成其难以用于体内治
疗产品生产的主要原因。由于近年来分离纯
化技术的进步和对这些细胞致瘤性的深刻认
识，对其在生产中的应用有所松动，如杂交
瘤细胞生产的单克隆抗体已用于体内治疗，
C127细胞生成重组蛋白的研究也形成了规模。
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体外培养所需的一般条件
适宜的培养皿 血清成分 370C CO25
％
95～ 100％湿度 抗生素
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培养基
培养基配置考虑的因素的
?pH 多数细胞系在 pH7.4下生长得很好。
一些正常的成纤维细胞系以 7.4~7.7最好，转
化细胞系以 pH7.0~7.4更合适。
?缓冲 在高细胞密度下，转化细胞系产生
大量二氧化碳和乳酸，引起 pH下降，需要在
培养基中加入缓冲作用的试剂，如碳酸氢钠、
HEPES(N-2-羟乙基哌嗪 -N’-2-乙磺酸 N-[2-
Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic
acid ] )
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温度 低温下 CO2溶解度增加，引起 pH
变化。
黏度 培养基的黏度主要受血清含量
的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受
损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基
吡咯烷增加培养基黏度
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细胞培养基的基本组成
1、水
细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水
的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物
标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应
高于注射用水标准。
2、能源和碳源
主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能
用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖
很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更
偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要
的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它
的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷
酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。
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3、氮源
氨基酸是组成蛋白质的基本单位，也是细胞
合成复杂含氮化合物的前体，还作为必不可
少的能源物质。不同种类的细胞对氨基酸的
种类和浓度有不同的要求，但除了前面提到
的谷氨酰胺外，还有 12种氨基酸不能在细胞
内合成，必须依靠从培养基中摄取。几乎所
有培养基中都含有全部必须氨基酸，根据需
要补充适量非必需氨基酸。非必须氨基酸含
量低时常会增加必须氨基酸的消耗量。增加
氨基酸的浓度可以提高培养的细胞密度和产
物产率。
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4、维生素
维生素是维持细胞正常生理状态的一种重要
生物活性化合物，在细胞中多形成酶的辅基
或辅酶，对细胞的代谢过程有重要影响。
5、无机离子
无机离子分为两组，一种是含量较高的，，
包括维持膜电势的（ Na+,K+），维持渗透
压平衡（ Na+,Cl－ ），作为酶的辅因子
（ Mg2+），促进细胞贴附（ Mg2+Ca2+），起
缓冲作用（ HPO42-,HCO3-）；另一种势微
量元素，如铁、锰、锌、钼、硒、钒、铜。
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6、脂类和磷脂前体 在使用血清的细
胞培养中，脂类来自血清，在无血清培
养中，有些细胞需要添加脂类，如胆固
醇、脂肪酸、磷脂。特别是缺陷型细胞，
对某种脂类有很高的依赖性。
非营养性物质
1、抗生素 细胞培养中，特别是原代细胞培
养中，常使用抗生素抑制微生物的污染。
2,pH缓冲剂 最常用的缓冲剂是碳酸氢钠，
常用浓度 26mmol/L，接近血中浓度，必须与
5％～ 10％ CO2平衡，否则培养基迅速变碱。
HEPES是缓冲能力很强的化合物，但由于它
相当昂贵，细胞大规模培养中很少使用。
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3、酚红
酚红普遍作为培养基的 pH指示剂
4、保护剂
细胞保护剂指保护细胞免受由渗透压变化、剪切、
毒性金属和氧化剂所引起的损伤的物质。在生物反
应器中培养的细胞会受到机械搅拌和气泡运动所产
生的剪切损伤，某些大分子化合物，如甲基纤维素、
葡聚糖,PEG、聚乙烯吡咯烷酮,Pluronic F68、
血清白蛋白，能够减轻这种损伤。
5、还原剂
某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。 β－巯基乙
醇在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱
氨酸利用。
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血清
常用的血清是小牛血清、胎牛血清、马
血清和人血清。最常用的是小牛血清。
血清是极其复杂的混合物，含有食物物
质、代谢物、激素、血浆蛋白、破碎细
胞释放物质、采血中引入的污染物。由
于历史原因，商业培养基大都是按添加
血清来设计的，使用血清技术也很成熟，
尽管使用血清有许多缺点，仍将其作为
细胞培养最重要的添加剂普遍采用。
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三、细胞计数及活力测定
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度
才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数
结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理
和方法与血细胞计数相同。
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在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，
总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由
组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离
的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也
要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，
从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些
酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相
对数和相对活力。
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四、培养物的污染及防止
污染途径
1 空气：空气流动性大，如果培养操作场地
于外界隔离不严格或消毒不充分，外界不洁
空气很容易进入造成污染。因此，培养设施
不能设在通风场所。无菌操作应在净化台内
进行，工作时要带口罩
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2 器材：各种培养器皿
3 操作：实验操作无菌观念不强，技术不熟
练，使用污染的器皿或封瓶不严等，都可以
造成污染。
4 血清：有些血清在生产时就已经被支原体
或病毒等污染，变成了污染。
5 组织样本：原代培养的污染多数来源于组
织样本；取材时碘酒消毒后脱碘不彻底，可
造成碘混入组织，细胞或培养液中，影响细
胞细胞生长。
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五、动物细胞的大规模培养
（一）培养环境
1、温度 温度是细胞在体外生存的基本条件
之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温
度不同。例如昆虫细胞的 最适温度是 25～
280C，人和哺乳动物细胞的最适温度是 370C，
细胞代谢强度与温度成正比，超出最适温度范
围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚
至导致死亡。
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2,pH
大规模培养时影响培养液的 pH稳定性的主要因
素有三种：
（ 1）缓冲液的缓冲能力及种类
（ 2）对流空间大小
（ 3）葡萄糖浓度
培养液中正常的缓冲系统是 NaHCO3/CO2系统，
它是一种弱缓冲系统，其 pK为 6.1，低于生理学
最佳要求。这种缓冲系统要求在培养液上面的
对流空间加入 CO2以防止它的丢失及增加羟基
离子。
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也可使用磷酸缓冲液，但磷酸对动物细胞
有毒害作用。 HEPES生物缓冲剂也曾被加
入 NaHCO3/CO2缓冲系统中，这是由于
HEPES的 pK为 7.0,HEPES被加入后，其
缓冲能力为 pH6.8～ 7.2。。但是当 HEPES
浓度高于 25mmol/L时，它对大多数动物细
胞都有毒害作用。
动物细胞大规模培养时常有几种方法来调节
培养液中的 pH：
（ 1）在培养基中添加 NaHCO3作为缓冲剂
及通入含 CO2的空气进行调节
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（ 2）用 0.1mol/LNaON或 0.1mol/LHCl进
行调节。由于动物细胞培养时要求低搅拌
和弱混合，利用 NaOH或 HCl进行调节时
会发生局部过酸或过碱的现象，从而对细
胞产生毒性作用，因此这种调节方法在动
物细胞培养时不太合适。通常通过调节培
养基中 NaHCO3用量及通气中 CO2浓度来
控制发酵过程的 pH。
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3、溶解氧
大规模培养中如何提供足够的氧是非常
重要的。通气得得目的有两个：一是提
供细胞代谢所需的足够的氧；二是使发
酵液处于均匀悬浮状态，有利于传质过
程。
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（三）培养容器
1、多孔板,Petri培养皿和组织培养方瓶都是常
用的静止培养容器，体积小，操作方便，很容易
放入培养箱内培养。
2、滚瓶 也是一种重要的培养容器，培养时放在
滚瓶机上缓慢滚动，但培养条件很接近于静止培
养。它体积交大，接种后放入温室或专门的培养
箱中培养。培养依赖性贴壁培养细胞时，需加入
微载体以增加培养表面积。
3、生物反应器是大规模培养中最重要的培养设
备。它有各种不同形式，容积可以从 1升到几十
立方米。
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微载体
微载体是指直径在 60～ 250μm、适合于动物细胞
贴附和生长的微珠。微载体法培养动物细胞有很多
好处 ;① 可在反应器中提供大的比表面积②可采用
均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，
提高了培养系统的重演性③可用普通显微镜观察细
胞在微载体上的生长情况④容易放大⑤适合于多种
贴壁依赖性细胞培养⑥容易收获细胞。微载体培养
系统的缺点是：①细胞生长在微载体表面，易受到
剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长②微载体价
格较贵，一般不能重复使用③需要较高的细胞接种
量。
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悬浮培养
悬浮培养指细胞在培养容器中自由悬浮生
长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞的
培养，如杂交瘤细胞等。动物细胞悬浮培
养与微生物过程比较接近，但由于动物细
胞对搅拌和通气造成的流体剪切很敏感，
在反应器的设计和操作上又有特殊要求 如
利用螺旋带叶轮减小生物反应器培养过程
中的剪切作用，并通过表面充气及诱导表
面气泡产生
具有双层滤网的新型搅拌器，它提高了氧
传递速率
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目前，动物细胞培养用生物反应器主要
包括：转瓶培养器、塑料袋增殖器、填
充床反应器、多层板反应器、螺旋膜反
应器、管式螺旋反应器、陶质矩形通道
蜂窝状反应器、流化床反应器、中空纤
维及其它膜式反应器、搅拌反应器、气
升式反应器等。
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细胞大规模培养生物反应器
气升式生物反应器
气升式生物反应器与其它反应器相比，
结构简单，无转动部件，细胞损伤率
低，减少了污染的机会；产生的湍动
温和而均匀，剪切力相当小；当大容
易；直接通气供氧，氧传递速率高，
供氧充分；液体循环量大，细胞和营
养成分混合均匀。存在问题：由于液
体混合的能量唯一来自通入的气体，
因而通气量大，泡沫多，而且气泡破
碎造成严重的细胞机械损伤
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通气搅拌生物反应器
根据动物细胞培养的特点，要求搅拌器
转动时混合性能好，产生的剪切力小，
气泡产生的不利影响小。设计有多种形
式的搅拌器，应用最多的是笼式搅拌器。
笼式搅拌器有两个由 200目不锈钢丝网围成
的笼式腔。下部的是通气腔，上部的是消
泡腔，之间有细管相通。气体交换在通气
腔内进行，其中的液体通过丝网与腔外的
液体进行交换。在气体鼓泡中形成的泡沫
经细管进入消泡腔，经丝网破碎分成气液
两部分，既做到深层通气，又避免泡沫在
反应器中积累。
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搅拌器有三个导流筒，与搅拌器中心的
垂直空腔相通，当导流筒随搅拌器转动
时，由于离心力的作用，搅拌器中心的
空腔产生负压，使培养基从底部吸入，
沿空腔螺旋式上升，再从三个导流筒排
出，绕搅拌器外缘螺旋式下降。悬浮细
胞或贴附有细胞的微载体的密度接近于
培养基，被培养基所裹胁，反复循环，
充分混合。
在微载体法培养贴壁动物细胞时，一般
搅拌转速在 30～ 60r/min范围内，混合
时间为 12～ 24s。
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中空纤维生物反应器 用途较广，既可用于悬浮细胞的
培养，又可用于贴壁细胞的培养。其原理是：模拟细
胞在体内生长的三维状态，利用反应器内数千根中空
纤维的纵向布置，提供细胞近似生理条件的体外生长
微环境，使细胞不断生长。中空纤维是一种细微的管
状结构，管壁为极薄的半透膜，富含毛细管，培养时
纤维管内灌流充以氧气的无血清培养液，管外壁则供
细胞黏附生长，营养物质通过半透膜从管内渗透出来
供细胞生长；对于血清等大分子营养物，划必须从管
外灌入，否则会被半透膜阻隔不能被细胞利用；细胞
的代谢废物也可通过半透膜渗入管内，避免了过量代
谢物对细胞的毒害作用。
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优点是：
●占地空间少；
●细胞产量高，细胞密度可达 109数量级；
●生产成本低，且细胞培养维持时间长，
适用于长期分泌的细胞。
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细胞生物反应器的控制系统
由动物细胞的特性所决定，细胞培养不能
沿用微生物发酵过程中常用的手段，安全
而有效地方法是高便通入培养罐内气体中
的氧气和氮气的比例来实现控制溶氧值的
目的，
采用二氧化碳 /碳酸氢钠缓冲液系统来控
制培养液的 pH值，它主要是靠预先加入
培养基＝液中适量的碳酸氢钠和通过改变
气体流量中的二氧化碳含量来实现。
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生物反应器中的细胞培养模式
分批培养
分批培养是指将细胞和培养基一次性装入反
应器内，进行培炎，细胞不断生长，产物也
不断形成，经过一定时间反应后，将整个反
应系取出。
流加培养
流加培养是指先将一定量的培养液装入反应
器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细
胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对
营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补
充至反应器内，使细胞进一步生长代谢。到
反应终止时，取出整个反应系。
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半连续培养
半连续培养又称为反复分批培养或换液培养，是指
在分批培养的基础上不全部取出反应系，剩余部分
重新补充新的营养成分，在按分批培养的方式进操
作。这是反应器内培养液体积保持不变的操作方式。
连续培养
连续培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器
内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，
另一方面又将反应液连续不断地取出，反应条件处
于一种恒定状态。与分批培养和半连续培养不同，
连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳
定。因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细
胞生长和产物形成。
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灌注培养
灌注培养是指细胞接种后进行培养，一方
面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面
又将反应液连续不断地取出，但细胞留在
反应器内，使细胞处于一种不断的营养状
态。
当高密度培养动物细胞时必需保持给细胞
补充足够的营养以及去除有毒的代谢废物。
通过调节灌注速率可以把培养过程保持在
稳定的、废物代谢低于抑制水平的状态下。
一般在分批培养中细胞密度为（ 2！ 4）
× 106cell/ml，在灌注系统中可达到（ 2～
5） × 107cell/ml。
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培养基研究进展 —— 无血清培养基
通常动物细胞的生长均有赖于血清的存
在，在普通培养基中，如不加血清，绝
大部分细胞将不能增殖。但使用血清的
主要弊端是存在潜在的污染源、不同批
号蛋白含量差异大及价格高等，给生物
制品的生产造成了不利。这就引发了人
们对无血清培养基的研究。结果发现，
只要在培养基中增加某些适于细胞生长
的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛
素和表皮生长因子等，不少细胞即能在
无血清供应的情况下生长，尤其是 CHO、
杂交瘤及重组骨髓瘤细胞等。
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其中胰岛素是无血清培养基中促进动物
细胞生长的最重要的多肽。 CHO细胞能
在仅含重组人胰岛素一种蛋白成分的无
血清培养基中连续传代。在人类细胞培
养中，应用无血清培养基还能有选择性
地控制及避免成纤维细胞的过度生长。
某些细胞在无血清的条件下，其生长和
抗体的产量甚至较有血清培养时高出数
倍。另外．动物细胞培养应用无血清培
养基的成功，还将为某些疫苗的生产降
低成本。
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