2009-12-17 1
天然药物学
Natural Medicine
东莞理工学院化学生物工程系
各 论
各 论
2009-12-17 2
天然药物学的主要任务及意义
天然药物
中药现代化、国际化的
关键科学问题
生药质量控制方法
资源、质量、
开发利用
主要
任务
具有生药鉴定、质量
评价、质量标准制定
和中药新药研制的初
步能力
教学
目的
各论
重要
意义
有效、安全
稳定、可控
中药及
其产品
各 论
2009-12-17 3
教学内容
一、各论的学习方法
*DNA分子鉴定新方法
二、根与根茎类药材的质量控制
*人参,
*甘草,三

*生物显微镜 -数码成像系统
*无 UV吸收的皂苷类
HPLC-ELSD分析方法
各 论
2009-12-17 4
一、各论的学习方法
按课程教学体系的安排学习
学习获取知识的能力
有限学习
无限学习
各 论
2009-12-17 5
(一 )按课程教学体系的安排学习
优劣
Superior or
inferior


教科书
(补充科研新进展 )
按课程教
学体系的
安排学习
真伪
True or
fake
生药质量控制方法
Methods of quality
Control for crude drugs
各 论
2009-12-17 6
生药质量控制方法
原植物形态 Plant Morphology
真伪
药用部

性状特征 Description
*DNA特征 DNA molecular characters
显微特征 Microscopical characters
定性分析 Qualitatively analysis优劣
有效成
分 定量分析 Quantitatively analysis
有害物质限量 (重金属、农残、毒性成分) 各 论
2009-12-17 7
真 伪
原植物形态
Plant Morphology
金钗石斛
性状特征
Description
各 论
2009-12-17 8
显微特征
Microscopical characters
生物显微镜 -数码成像系统 各 论
2009-12-17 9
DNA 分子鉴定
Identification of TCM by DNA Molecular Marker
20世纪 90年代中后期开始;
解决形态鉴定的某些局限;
同属多来源药材的鉴别
道地药材的鉴别等
各 论
2009-12-17 10
PCR
(Polymerase chain reaction)
PCR fragments
Interested DNA sequences
Primer
Primer
Identification(鉴定 )of TCM
by DNA Molecular Marker
Extracts
Genomic
DNA
TCM materials
DNA sequencing
寻找特征性基因
PCR-RFLP
DNA Chip
Diagnostic PCR
各 论
2009-12-17 11
高等植物中 nrDNA基因重复单位的基本结构,P1,P2为 PCR扩增的两引物
18S r
DNA ITS
ITS
Spacer region
AS AS-1
5S-rRNA
Coding
region
Coding
region
在高等植物中,5SDNA
是编码 5S核糖体 RNA的
多拷贝基因,以串联重
复的形式存在,每个重
复单位包括一个大约
120bp的编码区和长度
在 100~700bp之间的转
录间隔区
核糖体 DNA(ribosome DNA,r DNA)基因片段
生药鉴定常用的基因
各 论
2009-12-17 12
F.unibracteata
F.cirrhosa
F.przewalskii
F.t
hunbergii
浙贝

川贝母及其伪品浙贝母幼小鳞茎的性状和显微特征
两者性状和显微特征难以区别
各 论
2009-12-17 13
浙贝母的鉴别性 PCR鉴定
上游引物,Fth-P3,5’- GGT GAG ATT AGA TCA TAA TTT CGG TG -3’ 329
下游引物,Fth-P2,5’-TAT TAG CAT TAA TCG ATC GAA TTC-3’ 522
基于 5S-rRNA 基因间区序列, 152(P1);522(P2);329(P3);505(P4)
300
400
500
FthP2,P3于 60℃ 的扩增
243
M,100bp Ladder DNA
分子量标记,
1 浙贝母
2 东贝母
3 平贝母
4 伊贝母
5 新疆贝母
6 蒲圻贝母
7 蒲圻贝母
8 湖北贝母
9 梭砂贝母
10 暗紫贝母
11 甘肃贝母
12 卷叶贝母
13 紫花贝母
14 绿黄贝母
15 康定贝母
浙贝母
各 论
2009-12-17 14
川贝母类药材的 PCR-RFLP鉴定
nrDNA ITS区 (含 5.8S) 序列全长 610bp
川贝类 特异性序列, 5’ - TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC–3’
非川贝
类 T 75bpITS1区序列全长 212bp
200
300 400
ITS1区 SmaⅠ 酶 03131798.7
118
190
308
川贝类
川贝母
暗紫贝母
甘肃贝母
梭砂贝母
基于 5S-rRNA基因间区序列
HinfⅠ 梭砂贝母 ;BcnⅠ 暗紫贝母
Primer Premier各 论
2009-12-17 15
金银花存在明显的
道地性,同一物种产
地不同质量差异明显
金银花道地药材的鉴定
各 论
2009-12-17 16
优劣
对象, 药材所含的化学成分 (药效物质基础 )
定性分析
Qualitatively analysis
定量分析
Quantitatively analysis
含有什么成分? 含有多少?
各 论
2009-12-17 17
The major 5?-cevane isosteroidal alkaloids in Beimu
中药贝母中含有的主要活性成分
N
H O
H H
O H
H
H H
H H
H
R
V e r t i c i n e R =
V e r t i c i n o n e R = O
H
O H川贝 ;新贝
N
R
H H
O H
H
H H
H H
H
I m p e r i a l i n e R = O H
I m p e r i a l i n e - ? ? D - g l u c o s i d e R = O G l u
O
湖贝 ;浙贝
(生物碱 )
各 论
2009-12-17 18
To control active compounds (alkaloids) by TLC fingerprints
I
伊贝母药材薄层色谱图 1,2 阴性对照 3.西贝素甙对照品 4,西贝素对照品 5,样品
990120yc 6,样品 990406yc 7,样品 990918yc 8,9伊贝母药材对照
Ⅰ, 展开系统为乙酸乙酯:丙酮:甲酸:水( 5,3,0.5,1)
Ⅱ, 展开系统为氯仿 -甲醇 -水( 40,10,1)
II
各 论
2009-12-17 19
To control active compounds (alkaloids) by HPLC
1
3
4
5
6
7 8
22
1
2
3
4
5
6
990720
Waters 515 (Waters 公司产品 );柱,Kromasil?C-18 5?m,200?4.6mm (Turner公
司产品 );流动相:乙腈 -水 -二乙胺( 71,29,0.03),流速 1.0ml/min; 检测器:
Alltech 500 蒸发光散射检测器( ELSD),漂移管温度 88 oC,氮气流速 2.38SLPM
( 每分钟标准升);数据处理:江申色谱工作站
1.FPJ2 2.贝母辛 3.西贝素苷 4.FPJ4 5.伊贝碱苷 A
6.西贝素 7.新贝甲素 8.FPJ3
西贝素
西贝素
各 论
2009-12-17 20
学习获
取知识
的能力
,中华中药全书》大型数据库,查阅 300余种常
用药材的国内外研究进展文献资料,以及其他
相关课程内容
www.cnki.net; 数字图书馆
中国期刊 全文 数据库 (1994年以来 )
中国优秀博硕士论文全文数据库
中国重要会议论文数据库
中国专利数据库


图书馆
(书、杂志)
internet www.ncbi.nlm.nih.gov美国医学图书馆
(题录、摘要免费 )
(二 ) 学习获取知识的能力
无限学

各 论
2009-12-17 21
二、根与根茎类药材的质量控制
各论
植物药
Plant Drugs
动物药
Animal Drugs
矿物药
Mineral Drugs
各 论
2009-12-17 22
植物药
根及根茎类生药 Radix (Roots) and Rhizoma (Rhizomes)
茎木类生药 Caulis (stems) and Lignum (woods)
皮类生药 Cortex (Barks)
果实、种子类生药 Fructus (Fruits) and Semen (Seeds)
叶类生药 Folium (Leaves or leaflets)
藻菌类生药 Algae and Fungi
花类生药 Flos (The Flower )
全草类生药 Herba (whole herbs)
各 论
2009-12-17 23
人参的质量控制方法
真伪 优劣
原植物 形态特征
药材 性状特征
药材 显微特征
人参皂苷 TLC定性分析
人参皂苷 HPLC定量分析
*无 UV吸收的皂苷类 HPLC-ELSD
分析方法*DNA分子特征
根及根茎类生药 选讲
( *人参,*甘草,三七)
各 论
2009-12-17 24
Origins
Ginseng is the dried root of Panax ginseng C,A,
Mey,family Araliaceae.
本品为五加科植物人参 Panax ginseng 的干燥根。
各 论
2009-12-17 25
Plant Morphology ( description)原植物 形态特征
A perennial herb
各 论
2009-12-17 26
Main root large and fleshy,nearly cylindrical or
spindle-shaped,simple or forked ; rhizome short.
主根肥大,略呈圆柱形或纺锤形,单一或二岐,根茎短。
各 论
2009-12-17 27
Stem erect,simple,at the top bearing a whorl of 3~6
palmately compound leaves,Leaflets usually 5.
茎直立,单一。掌状复叶 3~ 6枚轮生茎顶;小叶常为 5 。
各 论
2009-12-17 28
Inflorescence a small terminal umbel; greenish or
yellowish-green.
伞形花序顶生,花小,淡绿色或淡黄绿色。
各 论
2009-12-17 29
Fruit a berry- like drupe,oblate,bright red when ripe.
浆果状核果,扁圆形,成熟时鲜红色。
各 论
2009-12-17 30
采制
各 论
2009-12-17 31
主产地
各 论
2009-12-17 32
Description ( Macroscopical Characters)
药材性状特征
各 论
2009-12-17 33
Description ( Macroscopical Characters)
Sun-dried Ginseng
n Main roots fusiform or cylindrical,externally greyish-yellow,the
upper part or entire root exhibiting sparse,shallow,interrupted
and coarse transverse-striations and distinct longitudinal wrinkles;
the lower part bearing 2~4 branch roots and numerous slender
rootlets with inconspicuous minute tubercles,
n Rhizomes (Lutou) mostly constricted and curved,bearing
adventitious roots (Ding) and showing sparse depressed-circular
stem scars (Luwan),
n Texture relatively hard,fracture yellowish-white,starchy,cambium
ring brownish-yellow,bark exhibiting yellow-brown dotted resin
canals and radial clefts,Odour,characteristic; taste,slightly bitter
and sweet.
生晒参主根圆柱形。表面灰黄色,上部或全体有疏浅断续的粗横纹及明显的纵皱纹,下部分出
2-4条支根,并着生多数细长的须根,须根上常有不明显的细小疣状突起。根茎(芦头)多拘
挛而弯曲,具不定根(丁)和稀疏的凹窝状茎痕(芦碗)。 质较硬,断面 淡黄白色,显粉性,
形成层环棕黄色,皮部有黄棕色点状树脂道及放射状裂隙,香气特异,味微苦、甘。 各 论
2009-12-17 34各 论
2009-12-17 35
Sun-dried Wild Ginseng
n Main roots as long as or shorter than rhizome,V-
shaped or cylindrical; Externally greyish-yellow,
longitudinally wrinkled,the upper end with dense deep
depressed annulations,branch roots mostly 2,rootlets
slender,orderly arranged and showing some distinct
warts,known as,pearl like knot” (Zhenzhugeda),
n Rhizomes slender,the upper part exhibiting dense stem
scar,adventitious roots relatively thick,like a kernel of
Chinese date,
野山参主根与根茎等长或稍短,呈人字形、菱形或圆柱形。表面
灰黄色,具纵纹,上端有紧密而深陷的细密环状横纹。支根多为 2
条,须根细长,清晰不乱,有明显的疣状突起,习称珍珠疙瘩。
根茎细长,上部具密集的茎痕,不定根较粗,形似枣核。 各 论
2009-12-17 36各 论
2009-12-17 37
Microscopical characters
显微特征
各 论
2009-12-17 38
人参(主根)横切面
Transverse section of ginseng
Main root
Cork 木栓层
草酸钙簇晶
Clusters of calcium oxalate
树脂道
Resin canals
Cortex 皮层
Phloem 韧皮部
Cambium形成层
Xylem 木质部
showing clefts in the outer
part,and parenchymatous
cells densely arranged and
scattered with resin canals
containing yellow secretions
in the inner part.
Xylem rays broad,vessels
singly scattered,or grouped,
interruptedly arranged
radially 各 论
2009-12-17 39
Powder of Sun-dried Ginseng:
n Fragments of resin
canals containing
yellow masses of
secretion,Clusters of
calcium oxalate 20~68
? m in diameter,with
acute angles.
1,
2,草酸钙簇晶棱角大多锐尖。
各 论
2009-12-17 40
DNA 分子鉴定
DNA Molecular Marker
各 论
2009-12-17 41各 论
2009-12-17 42
化学成分
Chemical constituents
各 论
2009-12-17 43各 论
2009-12-17 44各 论
2009-12-17 45
人参皂苷类成分定性分析
各 论
2009-12-17 46
Assays 人参皂苷类成分定量分析
? Carry out the method for
high performance liquid
chromatography
n (Appendix VI D)
高效液相色谱法测定 (附录 六 D)
各 论
2009-12-17 47
Chromatographic system and
system suitability
色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈 -
0.05%磷酸溶液( 99,400)为流动相,检测波长为 203nm。 理论塔板数按人
参皂苷 Re 峰计算应不低于 2500。
stationary phase,ODS; reversed-phase
mobile phase,acetonitrile-0.05%
phosphoric acid (99:400) ;
wavelength of the detector,is 203nm
The number of theoretical plates of the
column,> 2500,calculated with the
reference to the peak of Re.
各 论
2009-12-17 48
Preparation of reference solution
对照品的制备,精密称取人参皂苷 Rg1对照品 12.5mg,人参皂苷 Re对照品 10mg,加甲醇
分别制成每 1ml 含人参皂苷 Rg1对照品 0.5mg,人参皂苷 Re对照品 0.4mg的溶液,即得。
Weigh accurately 12.5 mg of
ginsenoside Rg1 CRS and 10mg of
ginsenosides Re CRS respectively,
separately dissolve in methanol to
produce two solutions containing
0.5mg of ginsenoside Rg1 per ml and
0.4mg of ginsenosides Re per ml.
各 论
2009-12-17 49
Preparation of test solution
供试品溶液的制备
Place 1g of the powder,weighed accurately
取本品粉末 1g,精密称定Into a Soxhlet’s
extractor
置索氏提取器中
heat under reflux with 40ml of chloroform
on a water bath for 3 hours
加氯仿 40ml,
加热回流 3小时
Discard the CHCl3
solution,expel CHCl3
from the residue
弃去氯仿液,
药渣挥去氯仿
transfer it with the filter paper tube
into a stoppered conical flask
连同滤纸筒
移入具塞锥
形瓶中
各 论
2009-12-17 50
Accurately add 50ml of
n-butanol saturated with water,
tightly stoppered,
allow to stand over night
精密加入水饱和的
正丁醇 50ml,密塞,
放置过夜,
ultrasonicate for 30 minutes 超声处理30分钟
Dissolve the residue in methanol,
transfer to a 5ml volumetric flask,
dilute with methanol to volume
and mix well
残渣加甲醇溶解并转移至 5ml量瓶中,
加甲醇至刻度,摇匀,即得。
Evaporate accurately
25ml of the successive
filtrate to dryness
滤过,精密量取续
滤液 25ml,置蒸发
皿中蒸干
各 论
2009-12-17 51
Procedures
n Accurately inject 10
?l of each of the two
reference solutions
and 10-20 ?l of the
test solutions,
respectively,into the
column,determine
and calculate the
content,
测定法:分别精密吸取上述两种
对照品溶液各 10 ?l 与共试品溶
液 10-20 ?l, 注入液相色谱仪,
测定,即得。
ReRg1
各 论
2009-12-17 52
含量限度
n It contains not less than 0.25% of
the sum of ginsenoside Rg1
(C42H72O14) and ginsenosides
Re(C48H82O18 ).
本品含人参皂苷 Rg1(C42H72O14C) 和人参皂苷 Re
( C48H82O18) 的总量不得少于 0.25% 。
各 论
2009-12-17 53
Determination of ginsenoside
by HPLC With Evaporative
Light Scattering Detector
皂苷类成分高效液相色谱蒸发光散射检测法
灵敏度
溶剂选择
梯度洗脱
UV
末端吸收
O
O
Og lc
O
R O g lc
H
g lc
各 论
2009-12-17 54
Nebulization
Evaporative Light Scattering Detector
流动相由热气流
使之热气化喷雾
进入加热管,溶剂在此挥发
Mobile phase
evaporation
被检测的物质颗粒通过
一狭窄光束散射光,由光
电倍增管收集
Detection
Laser light
to detector
ELSD响应取决于被分析物质颗粒的数量和大小。由于 ELSD仅对不挥发物质产生响
应,即使是在梯度洗脱时也能提供平稳的基线。 ELSD已成功用于皂甙、生物碱、萜类
内酯、氨基酸和糖类等分析 ;是分析无紫外吸收及紫外吸收弱成分的有力工具 。各 论
2009-12-17 55
Assay of ginsenoside in Radix
quinquefolium by HPLC/ELSD
色谱条件,色谱柱为德国默克 LiChrosorbNH2(250mm× 4mmid.10μm);
梯度洗脱进行分离,流动相 (A)乙腈 -水 -异丙醇 (80∶ 20∶ 15),(B)水按下列
次序,0~ 20min,0%B;20~ 30min,线性梯度 0%B~ 10%B;30~
45min;10%B。 柱温 25℃ ;流速 1.0ml/min;ELSD检测器漂移管温度 95℃ ;
载气压力为 0.20mPa。
ELSD
Re
Rg
1
Standard Panax quinquefolium L.
西洋参
Rg
1
Re
Rg
1
Re
各 论
2009-12-17 56
药理作用
各 论
2009-12-17 57
功效
各 论
2009-12-17 58
附注
各 论
2009-12-17 59