COOH
NH2
每一种离子的分布都满足 Boltzmann分布函数
第 i种离子 density profile,?(x)i = ??i e-Zi e ?(x)/kT
接近表面处 (x=0),?oi = ??i e-Zi e ?o/kT
其中,Zi为第 i种离子的离子价
?(x),electrostatic potential at x
?o为表面电势 (x=0处的 ?(x))
e为电子电荷
??i为第 i种离子的体浓度
7.生物膜的离体研究
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
脂单分子层技术
Langmuir膜
兼性分子在空气与水的界面上形成的单
分子层。
Langmuir-Blodgett (LB)膜
气 /液界面单层膜转移到固体表面上形成
的薄膜 (单层或多层 )。
典型的能形成 LB膜的分子：
硬脂酸分子 (兼性分子 )的结构及模型
空气
水
脂单分子层技术
Langmuir膜的铺展
将要铺展单层膜的兼性分子溶于适当的易
挥发性有机溶剂中，滴加在适当的亚相上，
待有机溶剂挥发掉以后，在亚相表面就悬
浮着一层兼性分子。
脂单分子层技术
气液界面上 Langmuir膜制备装置示意图
脂单分子层技术
LB膜制备装置示意图
垂直提拉法制备
LB膜
将单层膜保持在一
定的压力下，用事先
处理好的固体载片沿
着垂直方向缓慢地伸
入和提拉出亚相，单
层膜就会被连续地转
移到固体表面上 。
疏水衬底提拉 (左 ) 妾水衬底提拉 (右 )
水平提拉法制备
LB膜
将表面经过疏水
化处理的载片水平
地放在亚相表面，
使单层膜吸附转移
到载片表面 。
脂单分子层技术
表面压 ?
由于气 /液 (如水 )界面单分子层的存在，使
液相的表面张力由 ?0 降低为 ?，定义表面
压为
? = ?0 - ?
脂单分子层技术
单层膜的 ?-A曲线
在等温条件下改变膜太平的挡片的位置，
并记录 ? 的变化。以 ? 对分子的平均面积
作图，得到单层膜的曲线 (等温线 )。
单分子层 ?-A 曲线 (等温线 )示意图
G,气相 (二维理想气体状态
方程,?A = kT )
L-G,气相 -液相共存
L,液相 (状态方程,
?(A-Ao) = kT )
M,凝胶相 -液相共存
S:固相
由于单分子层除了层内分子
间的相互作用外还有层内分子
与底部亚相中的液体分子之间
的相互作用，这就使得单层膜
可能出现一些中间状态，与这
些中间状态相似的三维空间的
相态至今还未发现过。
Idealized isotherms of pressure (?) versus area (A)
relationship of phospholipid monolayers showing
different phases and coexistence regions.
Pressure-Area isotherms of monolayers of DPPC
on water at the temperatures indicated.
使用单层膜检测 A?40的插膜
单层膜检测 A?40与 A?28插膜的比较
单层膜检测胆固醇对 A?40插膜的影响
单层膜检测 A?40插膜 的膜组分依赖性
脂单分子层技术
表面收集法测量界
面蛋白浓度原理图
Wang等人设计了一套真空
吸取的办法 (Biophysical
J.83(2002)985-993)，待荧
光标记的蛋白达到插膜平
衡之后，将部分单层膜连
同粘着的体相溶液收集，
然后通过荧光强度的测量
确定界面蛋白浓度。
倒置式荧光显
微膜天平的结
构原理示意图
脂单分子层技术
荧光显微镜膜天平技术观测
脂膜的相分离和运动
LB膜在生物学中的应用
(1)脂类之间及脂类 /蛋白之间相互作用的研究
?-A 曲线,?-t 曲线，荧光显微膜太平
(2) 配体与受体间的分子识别
(3) 膜的粘着与融合
(4) 蛋白质的二维结晶化
(5) 生物传感器和生物芯片
Two-dimensional crystallization of avidin
on biotinylated lipid monolayers
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
固态支撑膜
四种不同类型的固体表
面支撑膜
(A) 支撑脂双层与固体表面间
由一层约 1nm厚度的超薄水
层分隔； (B) 支撑双层的内层
与固体表面通过静电作用或
共价键直接结合； (C) 支撑双
层与固体表面间由一层超薄
的软多聚化合物分隔； (D) 在
固体表面先藕联上超薄的多
聚物层（如 dextran），然后
再通过共价藕联将蛋白与多
聚物结合在一起形成蛋白支
撑膜。
制备支撑双水分子
层的 3种方法 (1993)
a) LB 技术
b) SUV在亲水衬
底上融合
c) SUV在疏水脂
单层表面融合
固态支撑膜
固态支撑膜
固体衬底表面生物功能化的方法
A) 如果要固定多聚物，如 Dextran，可以先在表面上沉积一层带有功能头基（如
环氧基，氨基，腈基）的长链表面活性剂单层膜和乙醇，乙醇的目的是使表面
亲水化，以防非特异性的蛋白吸附。
B) 通过活化的酯（如琥珀酰胺），将其结合到脂质或聚合物链上，而蛋白上则化
合上氨基，氨基与活化脂间结合将蛋白固定。这种方法很适合固定抗原表位或
Fab片断。
C) 在镍或铜离子存在的情况下,NTA(Nitrilotriacetic acid)与寡聚组氨酸可以形成
稳定的鳌合物。利用此原理，制备鳌合脂质 NTA-lipid，在二价离子（如 Ni2+,
Cu2+）存在时鳌合脂质与含有寡聚 Histine的蛋白能结合。
全内反射荧光技术
Schematic illustration of controlled assembly of biotin-lipid
containing monolayer/avidin/biotin-ssDNA complex on solid
support (a) and the related SPR spectra (b).
g old f il m
a v idin
DNA
D P P E
B- D P P E
s li de /pri s m
(a)
2 5, 0 03 0, 0 03 5, 0 04 0, 0 04 5, 0 0
I n c i d e n t A n g l e ( )
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
R
e
f
l
e
c
t
io
n
(
A
/
D
u
n
it
)
?
?
A u / D P B P E
A u / L i p i d / A v i d i n / D N A
4 5, 0 0 4 8, 0 0 5 1, 0 0 5 4, 0 0
I n c i d e n t A n g l e ( )
o
o
?
?
P r i s m
L a s e r
G o l d F i l m
( b)
Supported membranes as, phantom cells”
Incorporation of charged lipids,gangliosides,and receptors into
supported bilayers allow control of electrostatic,polymer-
induced,and lock-key forces (Science 271(1996) 43-48)
RICM visualization of a DMPC vesicle containing 1 mol%
biotin-labeled lipid as the receptor interacting with a surface
covered by streptavidin,
The formation of adhesion plaques is caused by interplay of
the strong attraction between receptors and the repulsive
undulation forces.
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
为什么叫“黑脂膜”？
显微观察磷脂成膜情况
Schematic representation of the experimental
set-up for the formation of BLM by painting a
film of lipid on a hole on Teflon cup,
测量参数：
电阻
电容
制备 BLM的脂溶液
为了要模拟生物膜的脂组分, 故 BLM是从需要模拟的组
织器官提取磷脂或鞘脂的 。 用得较多的有从脑组织提取的
脂, 叶绿粒抽提物, 胆固醇, 氧化胆固醇以及纯的 PC，
PE,PS等 。
BLM制备液一般应将高度纯化的磷脂溶于碳氢溶剂, 例
如癸烷, 辛烷, 苯, 氯仿或乙醇等 。 有时也用鲨烯作溶剂,
因为鲨烯会在 BLM形成过程中被排挤出来, 使 BLM成为
无溶剂的 BLM。 这种 BLM更接近自然生物膜的基架 。 一
般情况下溶剂碳氢链在 C6一 CI16间较适宜, 它们在室温时
都是液态, 极少溶于水 。 BLM制备液中如含有杂质就不
易铺制出 BLM。
对称 BLM的铺制
实验槽中间以聚四氯乙烯作为隔板 （ BLM支持物 ）, 隔板中
间开一小圆孔, 面积一般不要超过 0.25平方厘米 。
槽内放上适当的缓冲溶液, 把小孔浸没 。 然后把一滴 BLM
制备液加到隔板的小孔下方 （ 用毛刷或微量注射器 ） 。 由于聚
四氯乙烯具有良好的亲脂疏水性, 故脂较容易附在小孔四周,
并扩展过整个小孔, 随后脂滴的中间部分慢慢变薄, 最后成为
双分子层, 而沿着小孔四周则积有较厚的脂层, 成为一个圈,
它对 BLM起支持作用, 这一圈称 P－ G边界 （ Plateau－ Gibbs
border） 。
脂滴在小孔中形成双分子层脂膜是一个自发的渐变过程 。 通
过光学或电学的方法可以验证双分子层是否已经形成 。
毛刷法铺制对称 BLM
The formation of BLM by apposing two monolayers on a
hydrophobic partition by raising the level of the aqueous
phase on which a monolayer has been formed.
不对称 BLM的制备 (1)
由单层合成双层的 BLM铺制法
隔板固定而使两侧溶液液面移动的方法：使两个可以同步推进的注射
器与聚四氟乙烯隔板两侧的溶液连通并使左右液面保持在同一水平上 。
同步推进注射器, 使两侧液面升至小孔下方 2－ 3毫米处 。 在两侧溶液面
上分别滴加 BLM制备液, BLM制备液在液面扩展为单分子层, 此时再使
二注射器同步推进, 使二侧面上升经小孔而达小孔上方 2－ 3毫米处方才
停止 。 当二侧脂单层上升经过小孔时, 合而形成脂双层 。 如果脂溶剂是
易挥发的, 这样形成的 BLM还能做到不含脂溶剂 。
另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移动, 但仍能保证左右
两侧之间有良好的绝缘性 。 铺制时先将隔板向上提起, 使小孔上升至液
面之上, 将 BLM制备液分别滴在左右两侧的水面上, 脂即在水面上扩展
为脂单分子层 。 如果在两侧水面上铺展不同的脂, 则两边的单分子层就
不对称 。 然后将隔板向下移, 当隔板的小孔移到液面下时, 很自然地在
小孔上就形成了双分子脂层 。
铺成的 BLM并不是静止不动的, 双层的脂分子是流动的, 两侧不同的
脂分子在 P－ G边界中会混合在一起, 而 P－ G边界中的脂分子是会同双分
子层中的脂分子通过流动而进行交换的, 最后在 BLM中的脂也就不可能
保持不对称了 。 但是这种方法可以确保 BLM两侧溶液不会混合, 因而可
以进行膜两侧溶液不对称时的各种研究 。
The formation of BLM by apposing two monolayers on
the tip of a micropipette by first removing the tip from
the aqueous phase on which a monolayer is present,and
then reinserting the tip through the monolayer,
不对称 BLM的制备 (2)
在滤纸的微孔中形成 BLM
在显微镜下观察滤纸，可以看到上面有许多微
孔。有人把滤纸先用脂浸泡，然后取出晾干，这
样滤纸就具有亲脂疏水特性。用这种脂处理过的
滤纸放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯
隔板（当然要有特别设计的夹具，把滤纸夹在左
右二室之间）。然后用前面介绍的方法铺制 BLM，
实践证明在滤纸的许多小孔上都形成了 BLM，只
是每个 BLM的面积小，但是许多小面积的 BLM加
起来就比单个“大”孔上铺成的 BLM还大 。
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
Temperature induced
shape changes of
vesicles (1990),
(a) Transition of a vesicle
from a biconcave shape
(center) to an invaginated
(stomatocyte) shape (left
side) at decreasing
temperature and to a
budded shape (right side)
at increasing temperature.
Shapes of vesicles (or cells)
on the basis of the bilayer
coupling hypothesis model
(1983):
The different cell shapes can be
explained in terms of two
parameters,
1) the reduced volume v=v/vs,the
ratio of the actual volume of the
cell to that of a sphere,
2) the relative area difference
?=(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s)
where A0 and Ai are the areas of
the outer and inner leaflet of the
membrane and where A0,s and
Ai,s are the corresponding values
of the sphere,Shape transformation of giant vesicle triggered
by temperature changes,The transitions are
completely reversible !
Phase contrast micrographs of shape
change of composite shell (1998).
DMPC vesicle containing 2?M of actin (image a and b) and
7 ? M(image c and d) of actin,
脂质体的类型：
SUV,小单片层脂质体 (small unilaminar-)
MLV,多片层脂质体 (multilayer-)
LUV,大单片层脂质体 (large unilaminar-)
脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相
的闭合囊泡。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (1)：
方法一：将磷脂用氯仿溶解, 通氮气干燥, 用真空泵
或旋转蒸发器驱除残留溶剂 。 加入所需的水相, 使脂质
浓度在 mM范围 。 之后, 悬浮液在探头式或水浴式超声
仪中超声至透明 （ 温度视脂质而异, 保持在相变温度以
上, 但过高温度时脂质易氧化 ） 。 用探头式时仅带几分
钟, 用水浴式则右时长达 2小时 。 虽然用水浴式费时长,
但此时超声可在充氮气的密闭容器中进行 。
用负染电镜术, 可检验囊泡的大小, 其直径下限可达
20nm。 实用中往往要加入胆固醇成分, 此时直径至少
50nm。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (2):
第二种方法是将脂质的乙醇溶液快速注入
到缓冲液中，随即自发地形成 SUV。脂质的
最终浓度为 3—30mM。所形成的囊泡直径范
围为 30-110 nm，与脂质的浓度有关 。
这一方法的优点是避免了超声的损伤．且
快速、简单及温和，但脂质体的浓度相当稀，
需要进一步浓缩，另一个缺点是高浓度的乙
醇必须由随后的纯化阶段去除。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (3):
方法三：将 MLV的悬浮液以 20,000磅／英
寸的压力,4℃ 时通过 French滤器挤排。四次
挤排后,94％囊泡的大小范围为 31.5－ 52.5纳
米。
该法所得囊泡较超声法的略大，能适用于各
种脂质。此外，操作简单、重复性好，亦无
超声损伤。
MLV(多层囊泡 )的制备 (1)：
根据 Bangham的方法,
在 100毫升圆底烧瓶中, 用氯仿溶解 10毫克含 5摩尔 ％ PA
的 eggPC,通氮气去除氯仿, 在烧瓶壁形成磷脂薄膜 。 将烧
瓶置于真空中, 过夜 （ 或数小时 ） 除去剩留的溶剂 。 然后加
入所需的水溶液 5毫升, 脂质水化数小时 （ 相变温度之上 ） 。
然后用旋涡混合器振摇, 即得 MLV的悬浮液 。
MLV中 各片层之间的间隔取决于 Van der Waais吸引力和
水化, 静电的排斥力之间的平衡 。 生理盐浓度条件下, PC组
成的 MLV中各片层之间的间距约 2.8纳米 。 脂质带负电时,
间距增加 （ 特别是在低离子强度时 ） 。 制备中加酸性磷脂 (如
PA)的道理就在于此 。
MLV适于包囊各种物质, 也适于各种脂膜 。 其制备法是
所有脂质体制备中最简单的 。 缺点是大小分布很不均匀, 包
裹效率也不高 。
MLV(多层囊泡 )的制备 (2)：
多层囊泡的脱水形成（脱水一再水化循环法 )
0.1微摩尔磷脂用超声分散于 1毫升水中。将待包裹的物质加
入，通干燥的氮气将水分蒸发。在干燥的过程中,SUV被浓缩，
彼此融合形成多片层的平板，因而将待包裹的物质夹在诸片层
之间。干燥毕，把湿棉花塞入试管或通以含水汽的氮气流几小
时以使脂质再水化。此时，多片层膨润，形成大的囊泡。从而
俘获大部分的溶质。然后加入水，将混合物轻轻振荡以分散脂
质囊泡。若再通过聚碳酸酯滤膜，则可分选大小。
该方法的最大优点是包裹效率极高，对 DNA分子能达 50％
（ 10毫克脂质包裹 1毫克 DNA)，也能有效地包裹蛋白质。制备
过程中酶的活性仍保持近 90％。此外，适用于几乎所有的磷脂。
但该法易受水相中无机离子的影响，此外不太适用于包裹较小
的分子。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (1):
注入法
将非极性溶剂中的脂质溶液在使溶剂能挥发的条件下注入到水
溶液中, 溶液中脂质即以薄膜的形式残留在气泡和液相的界面
上 。 可以计算出, 薄膜的组成仅是几个脂双层 。 当气泡通过水
相上升时, 片层分散后形成单片层的脂质体 。 最后用聚碳酸酯
滤膜分选大小 。
具体方法,4毫升戊烷或乙醚的脂质溶液 （ 1－ 2毫摩尔脂质 ）
缓慢地注入到 4毫升, 60℃ 的水相中 （ 0.2毫升／分 ） 。 水相中缓
慢地通氮气泡以促使溶液混匀, 同时给空气一溶液的界面上提
供惰性环境, 增加气泡的大小, 从而有利于单片层囊泡的形成 。
注入完全后, 将脂质体悬浮液通过聚碳酸酯滤膜以分选大小,
去除凝聚体 。 然后, 再用凝胶柱过滤 （ 例如 Sephadex。 G－ 25或
G－ 50,Biogel P－ 10） 进一步去除残留的溶剂 。
注入法的好处是适用于各种脂质, 而且在 1小时内即可完成 。
主要的限制是最终的制剂相当稀 （ 1一 15毫摩尔 ）, 因而包裹效
率低 。 该法能得直径为 150－ 250纳米的 LUV。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (2):
反相蒸发法（ REV）
Szoka等设计了另一种制备 LUV的方法。 该方法中，水一非极性溶剂
混合液中的脂质分子形成内翻型微团，此时脂质的尾部插入非极性相，
而头部基团包围水滴。当非极性溶剂在真空中蒸发后，微团彼此结合，
形成大的单片层的囊泡。
典型制备时,66微克分子（ 50毫克）脂质溶于 3毫升乙醚，加入 1毫升
水相（ PBS等缓冲液及待包物质），通氮气下水溶式超声 2－ 5分，直至
混合物变为清沏的一相悬浮液或均匀的乳白色液（超声后 30分内水和油
相不分离）。然后，移至旋转蒸器中，用水泵抽气驱除乙醚。当大部分
溶剂除去后，悬浮液呈凝胶状，经 2－ 3次旋涡振荡后再继续减压蒸发，
直至得到均一的悬浮液．最后进过孔直径 0.2微米的聚碳酸脂滤膜，即能
得到大小校均匀的 LUV。也可用透析或上 Sepharose 4B柱或离心等方法
除去未包裹的物质及残留的有机溶剂。
REV法的优点是,1.水相的包裹容积大（水相离子强度低时，如 0.01
摩尔 NaCI，能达 65％）； 2.能包裹大的生物高分子，如铁蛋白,25S
RNA； 3.制备过程中不受水溶性蛋白质存在的影响，也不受磷脂种类的
影响； 4.水相容积从 02毫升至 10毫升都可以处理。主要的缺点是待包物
质暴露于有机溶剂中，且要经短时间超声，这样可能导致某些蛋白质的
变性或 DNA断裂。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (3):
去垢剂稀释法
将过量去垢剂 (超过 CMC)加入到膜悬浮液中直到因形成去垢剂 -脂质 -
蛋白质的混合微团而变得澄清为止。此后缓慢降低去垢剂的浓度 (如透
析 )，致使脂质与膜蛋白形成囊泡状膜结构，这样就能达到重组蛋白的作
用。去垢剂如胆酸盐,TritonX－ 100等用于脂质体重组已取得很大成功。
现列举典型的去垢剂一 LUV法,eggPC和脱氧胆酸盐混合成 1毫升溶液
（ 20微克分子脂质,10微克分子去垢剂）。水浴超声数分，最初的浑浊
悬浮液即变为透明状（因混合微团的形成）。然后用凝胶过滤除去脱氧
胆酸盐。囊泡的直径约 100纳米，可认为是小的 LUV。俘获容积为 2－ 3
升／摩尔。用该法已成功地包裹了细胞色素 C和葡萄糖等。
去垢剂稀释法已广泛地应用于膜蛋白脂质体的重组。方法学上的限制
是，透析时需几小时甚至几天才能完成；此外，如果被包裹的溶质能够
通过透析膜，则包裹效率就非常低。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (4),SUV融合法
1.钙促融合法
Panahadjonoulos等将负电荷磷脂的 SUV和 Ca2＋ 混和，再用 EDTA螯合 Ca2＋ 。
当 Ca2＋ 与含 PS的 SUV相互作用时，囊泡首先凝聚形成沉淀，融合形成多片
层结构。而后用 EDTA去除 Ca2＋ 时，该片层结构膨胀，形成大的单层囊泡。
典型实验中,1－ 10毫摩尔不饱和 PS用以制备 SUV。加入足量的 CaCI2，
使 Ca2＋ ／脂质之比为 1,2。此时 SUV沉淀。然后，加入稍过量的 EDTA，搅
拌直至沉淀物形成 LUV的透明悬浮液。这样所形成的囊泡，能够在相当温
和的条件下包裹诸如病毒、核酸及铁蛋白等结构。俘获容积约 7升／摩尔，
20毫摩尔脂质悬浮液中包裹效率约 10－ 15％。
2.冰冻一融化一超声法
第二种融合方法是冰冻一融化一超声的方法。典型步骤是,30毫克脂质在
1毫升缓冲液中超声形成 SUV。然后加进待包物质。混合物在液氮中冰冻，
然后再融化。冰冻一融化过程可根据情况一次或两次。再在水浴中超声 30
秒（超声目的主要是用以分散聚集体）。
最终所形成的囊泡对离子不易通透，俘获容积约 8升 /摩尔。该方法的优
点是简单且温和，且可用于膜蛋白重组。然而，在有蔗糖、高浓度离子或
有二价阳离子存在时效果不好。
Three methods for reconstitution,(1) Lipid and proteins solubilized
in detergents are mixed and then the detergent is removed by dialysis,
dilution,or gel filtration,(2) Delipidated proteins can sometimes be
spontaneously incorporated into a preformed bilayer,(3) Partially
delipidated proteins with a small amount of detergents sometimes
form discs that can fuse with preformed vesicles(胆酸盐法 ),
重组脂质体
right-side-out vesicles:
0.5?M Na2PO4 and 0.1 ?M Mg+.
inside-out vesicles:
0.5?M Na2PO4,
red blood cell
红细胞膜制备脂质体
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
去污剂与膜的分离
对于生物膜结构与功能的研究，通常需
要将膜解聚成各种组分。
抽提分析膜脂，一般使用有机溶剂。对
于膜蛋白，有机溶剂也是可以使用的，但
是许多蛋白在有机溶剂中容易变性，沉淀。
因此，要针对不同类型的膜蛋白选择不同
的提取方法。溶解膜蛋白可以采用：螯合
剂，改变离子强度和 pH值，蛋白的变性剂
（如脲、胍等），酶解等方法,但对于膜
内在蛋白，上述方法分离效果都不好，只
能采用去污剂抽提的方法 。
Methods for solubilization of membrane proteins,Steps
usually involved are salt wash (which removes
electrostatically bound proteins) followed by sonication or
detergent treatment,or solubilization in an organic solvent,
用去污剂溶解膜内在蛋白
搞清去垢剂溶解膜磷脂和膜蛋白的先后次序
Klingenberg实验室利用 CAT(抑制剂 )饱和的线粒体膜研究
去垢剂对这种线粒体膜的作用机理 。
结果发现, 去垢剂与蛋白的比例为 1:1时, 当膜上的磷脂约
有 50％ 被溶解后, 才开始观察到 CAT－蛋白复合体被溶解 。
因此, 去垢剂对这种线粒体膜的作用, 首先是磷脂被溶解,
然后才是蛋白被溶解 。
由此可以设想, 去垢剂单体分子首先, 攻击, 磷脂的双分
子层, 使脂的双分子层变成松散, 然后才作用于 CAT－蛋白
复合体上 。 Detergent的 单体与团粒在溶液中处于动态平衡状
态 。 由于单体分子不断深入到磷脂双层中, 使团粒不断解离
成单体 。 当愈来愈多的去垢剂分子深入到脂双层而形成复合
的磷脂－去垢剂团粒时, 蛋白分子被包围, 最后被溶解下来 。
需要了解去污剂的性质及其作用机理
纯化鉴定膜蛋白, 使用去污剂是必须的 。 在使用去污剂溶解的
过程中, 膜被破坏, 蛋白与脂双层以及细胞骨架之间的作用被去
除, 取而代之的是蛋白与去污剂之间的作用 。 蛋白被去污剂溶解
后, 膜蛋白就如同水溶性蛋白一样可被进一步分离纯化 。
但是蛋白在去污剂－蛋白复合体中常难以保持稳定, 其机理尚
不够清楚, 可能与以下几个方面有关：
（ 1） 蛋白的亲水及疏水 domain与去污剂匹配不合适 。
（ 2） 蛋白之间相互作用导致的稳定性被破坏 。
（ 3） 脂双层粘滞性比去污剂强, 蛋白因微环境变化而导致稳定
性的破坏 。
分离膜蛋白使用的去污剂
1.非离子型去污剂
a.聚氧乙烯二醇衍生物
这类去污剂比较温和, 溶解过程对蛋白结构影响较
小, 是分离膜蛋白最常使用的 。 几种聚氧乙烯二醇衍
生物类去污剂示出如下：
b.以糖苷为亲水基团，以脂肪烃链为疏水基团的
去污剂
此类去污剂多有高的 c.m.c.值，在脂膜重组中
有优势。
辛基葡萄糖苷,
c.兼性离子去污剂
此类去污剂在生物反应所需的 PH范围内处于
非离子态。包括：溶血卵磷脂、硫代三甲胺乙
内酯、胺氧化物,CHAPS等。
CHAPS
2.胆盐类去污剂
去氧胆酸盐是一种有效的溶膜去污剂。在离子型去
污剂中此类去污剂是较温和的。这类去污剂容易由 2
至 10个分子通过非极性区相互作用发生二级聚集。
(去氧 )胆酸
膜蛋白－去污剂复合物
去污剂与膜蛋白的作用方式目前认为有两种 。
(1)被溶解的膜蛋白插在胶束结构中, 胶束取代脂双层膜
包裹蛋白的疏水区；
(2)去污剂形成单层膜结构包裹蛋白疏水区, 所有的去污
剂分子都充分靠近蛋白分子 。
这两种方式都在去污剂的浓度接近 c.m.c.时实现 。 当膜
蛋白较大, 超过了所用去污剂胶束的线度, 或者使用的
去污剂烷基链较短, 难于形成厚度与磷脂双层膜相当的
胶束时, 第二种方式占优势 。
(1) (2)
去污剂－蛋白复合物中的膜蛋白的构象
在使用去污剂溶解膜蛋白的过程中, 蛋白活性的保持与溶解
的效率通常为互补的 。 适宜的溶解条件可以延缓蛋白的失活 。
以下几个方法可以帮助保持蛋白的活性构象：
(1)向溶解体系中加入甘油, 蔗糖等多元醇类化合物 。 这种方法
有助于在溶液中稳定蛋白, 不仅仅针对去污剂溶解体系 。 其机
理可能是在多羟基化合物存在的条件下, 蛋白易于被水化, 有
利于保持其天然构象 。
(2)溶解过程中尽可能降低去污剂浓度 。
(3)蛋白活性的保持有时依赖于能与其特异结合的金属离子或小
分子化合物的存在 。 如, 使用胆盐溶解生物膜时, 较高的离子
强度 （ 0.4MKCl） 有助于稳定蛋白 。
分离膜蛋白时去垢剂选择的因素,
1.去垢剂的温和性 。 这对保持分离膜蛋白的天然构
象十分重要 。 例如 SDS是一种强离子去垢剂, 具有
很好的膜溶解能力, 但温和性不理想 。 去氧胆酸和
胆酸都是弱的离子型去垢剂, 它们的温和性相对好
一些 。
2.去垢剂的临界团粒浓度 （ CMC） 。 一般来说, 离
子型去垢剂 CMC高, 非离子去污剂的 CMC很低 。
非离子型去垢剂的 CMC低,因而使膜蛋白变性的作
用也小 。
登顶成功，可惜神仙都被一脸幸
福地俺们吓跑了。
膜分子生物学
游击队
NH2
每一种离子的分布都满足 Boltzmann分布函数
第 i种离子 density profile,?(x)i = ??i e-Zi e ?(x)/kT
接近表面处 (x=0),?oi = ??i e-Zi e ?o/kT
其中,Zi为第 i种离子的离子价
?(x),electrostatic potential at x
?o为表面电势 (x=0处的 ?(x))
e为电子电荷
??i为第 i种离子的体浓度
7.生物膜的离体研究
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
脂单分子层技术
Langmuir膜
兼性分子在空气与水的界面上形成的单
分子层。
Langmuir-Blodgett (LB)膜
气 /液界面单层膜转移到固体表面上形成
的薄膜 (单层或多层 )。
典型的能形成 LB膜的分子：
硬脂酸分子 (兼性分子 )的结构及模型
空气
水
脂单分子层技术
Langmuir膜的铺展
将要铺展单层膜的兼性分子溶于适当的易
挥发性有机溶剂中，滴加在适当的亚相上，
待有机溶剂挥发掉以后，在亚相表面就悬
浮着一层兼性分子。
脂单分子层技术
气液界面上 Langmuir膜制备装置示意图
脂单分子层技术
LB膜制备装置示意图
垂直提拉法制备
LB膜
将单层膜保持在一
定的压力下，用事先
处理好的固体载片沿
着垂直方向缓慢地伸
入和提拉出亚相，单
层膜就会被连续地转
移到固体表面上 。
疏水衬底提拉 (左 ) 妾水衬底提拉 (右 )
水平提拉法制备
LB膜
将表面经过疏水
化处理的载片水平
地放在亚相表面，
使单层膜吸附转移
到载片表面 。
脂单分子层技术
表面压 ?
由于气 /液 (如水 )界面单分子层的存在，使
液相的表面张力由 ?0 降低为 ?，定义表面
压为
? = ?0 - ?
脂单分子层技术
单层膜的 ?-A曲线
在等温条件下改变膜太平的挡片的位置，
并记录 ? 的变化。以 ? 对分子的平均面积
作图，得到单层膜的曲线 (等温线 )。
单分子层 ?-A 曲线 (等温线 )示意图
G,气相 (二维理想气体状态
方程,?A = kT )
L-G,气相 -液相共存
L,液相 (状态方程,
?(A-Ao) = kT )
M,凝胶相 -液相共存
S:固相
由于单分子层除了层内分子
间的相互作用外还有层内分子
与底部亚相中的液体分子之间
的相互作用，这就使得单层膜
可能出现一些中间状态，与这
些中间状态相似的三维空间的
相态至今还未发现过。
Idealized isotherms of pressure (?) versus area (A)
relationship of phospholipid monolayers showing
different phases and coexistence regions.
Pressure-Area isotherms of monolayers of DPPC
on water at the temperatures indicated.
使用单层膜检测 A?40的插膜
单层膜检测 A?40与 A?28插膜的比较
单层膜检测胆固醇对 A?40插膜的影响
单层膜检测 A?40插膜 的膜组分依赖性
脂单分子层技术
表面收集法测量界
面蛋白浓度原理图
Wang等人设计了一套真空
吸取的办法 (Biophysical
J.83(2002)985-993)，待荧
光标记的蛋白达到插膜平
衡之后，将部分单层膜连
同粘着的体相溶液收集，
然后通过荧光强度的测量
确定界面蛋白浓度。
倒置式荧光显
微膜天平的结
构原理示意图
脂单分子层技术
荧光显微镜膜天平技术观测
脂膜的相分离和运动
LB膜在生物学中的应用
(1)脂类之间及脂类 /蛋白之间相互作用的研究
?-A 曲线,?-t 曲线，荧光显微膜太平
(2) 配体与受体间的分子识别
(3) 膜的粘着与融合
(4) 蛋白质的二维结晶化
(5) 生物传感器和生物芯片
Two-dimensional crystallization of avidin
on biotinylated lipid monolayers
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
固态支撑膜
四种不同类型的固体表
面支撑膜
(A) 支撑脂双层与固体表面间
由一层约 1nm厚度的超薄水
层分隔； (B) 支撑双层的内层
与固体表面通过静电作用或
共价键直接结合； (C) 支撑双
层与固体表面间由一层超薄
的软多聚化合物分隔； (D) 在
固体表面先藕联上超薄的多
聚物层（如 dextran），然后
再通过共价藕联将蛋白与多
聚物结合在一起形成蛋白支
撑膜。
制备支撑双水分子
层的 3种方法 (1993)
a) LB 技术
b) SUV在亲水衬
底上融合
c) SUV在疏水脂
单层表面融合
固态支撑膜
固态支撑膜
固体衬底表面生物功能化的方法
A) 如果要固定多聚物，如 Dextran，可以先在表面上沉积一层带有功能头基（如
环氧基，氨基，腈基）的长链表面活性剂单层膜和乙醇，乙醇的目的是使表面
亲水化，以防非特异性的蛋白吸附。
B) 通过活化的酯（如琥珀酰胺），将其结合到脂质或聚合物链上，而蛋白上则化
合上氨基，氨基与活化脂间结合将蛋白固定。这种方法很适合固定抗原表位或
Fab片断。
C) 在镍或铜离子存在的情况下,NTA(Nitrilotriacetic acid)与寡聚组氨酸可以形成
稳定的鳌合物。利用此原理，制备鳌合脂质 NTA-lipid，在二价离子（如 Ni2+,
Cu2+）存在时鳌合脂质与含有寡聚 Histine的蛋白能结合。
全内反射荧光技术
Schematic illustration of controlled assembly of biotin-lipid
containing monolayer/avidin/biotin-ssDNA complex on solid
support (a) and the related SPR spectra (b).
g old f il m
a v idin
DNA
D P P E
B- D P P E
s li de /pri s m
(a)
2 5, 0 03 0, 0 03 5, 0 04 0, 0 04 5, 0 0
I n c i d e n t A n g l e ( )
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
R
e
f
l
e
c
t
io
n
(
A
/
D
u
n
it
)
?
?
A u / D P B P E
A u / L i p i d / A v i d i n / D N A
4 5, 0 0 4 8, 0 0 5 1, 0 0 5 4, 0 0
I n c i d e n t A n g l e ( )
o
o
?
?
P r i s m
L a s e r
G o l d F i l m
( b)
Supported membranes as, phantom cells”
Incorporation of charged lipids,gangliosides,and receptors into
supported bilayers allow control of electrostatic,polymer-
induced,and lock-key forces (Science 271(1996) 43-48)
RICM visualization of a DMPC vesicle containing 1 mol%
biotin-labeled lipid as the receptor interacting with a surface
covered by streptavidin,
The formation of adhesion plaques is caused by interplay of
the strong attraction between receptors and the repulsive
undulation forces.
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
为什么叫“黑脂膜”？
显微观察磷脂成膜情况
Schematic representation of the experimental
set-up for the formation of BLM by painting a
film of lipid on a hole on Teflon cup,
测量参数：
电阻
电容
制备 BLM的脂溶液
为了要模拟生物膜的脂组分, 故 BLM是从需要模拟的组
织器官提取磷脂或鞘脂的 。 用得较多的有从脑组织提取的
脂, 叶绿粒抽提物, 胆固醇, 氧化胆固醇以及纯的 PC，
PE,PS等 。
BLM制备液一般应将高度纯化的磷脂溶于碳氢溶剂, 例
如癸烷, 辛烷, 苯, 氯仿或乙醇等 。 有时也用鲨烯作溶剂,
因为鲨烯会在 BLM形成过程中被排挤出来, 使 BLM成为
无溶剂的 BLM。 这种 BLM更接近自然生物膜的基架 。 一
般情况下溶剂碳氢链在 C6一 CI16间较适宜, 它们在室温时
都是液态, 极少溶于水 。 BLM制备液中如含有杂质就不
易铺制出 BLM。
对称 BLM的铺制
实验槽中间以聚四氯乙烯作为隔板 （ BLM支持物 ）, 隔板中
间开一小圆孔, 面积一般不要超过 0.25平方厘米 。
槽内放上适当的缓冲溶液, 把小孔浸没 。 然后把一滴 BLM
制备液加到隔板的小孔下方 （ 用毛刷或微量注射器 ） 。 由于聚
四氯乙烯具有良好的亲脂疏水性, 故脂较容易附在小孔四周,
并扩展过整个小孔, 随后脂滴的中间部分慢慢变薄, 最后成为
双分子层, 而沿着小孔四周则积有较厚的脂层, 成为一个圈,
它对 BLM起支持作用, 这一圈称 P－ G边界 （ Plateau－ Gibbs
border） 。
脂滴在小孔中形成双分子层脂膜是一个自发的渐变过程 。 通
过光学或电学的方法可以验证双分子层是否已经形成 。
毛刷法铺制对称 BLM
The formation of BLM by apposing two monolayers on a
hydrophobic partition by raising the level of the aqueous
phase on which a monolayer has been formed.
不对称 BLM的制备 (1)
由单层合成双层的 BLM铺制法
隔板固定而使两侧溶液液面移动的方法：使两个可以同步推进的注射
器与聚四氟乙烯隔板两侧的溶液连通并使左右液面保持在同一水平上 。
同步推进注射器, 使两侧液面升至小孔下方 2－ 3毫米处 。 在两侧溶液面
上分别滴加 BLM制备液, BLM制备液在液面扩展为单分子层, 此时再使
二注射器同步推进, 使二侧面上升经小孔而达小孔上方 2－ 3毫米处方才
停止 。 当二侧脂单层上升经过小孔时, 合而形成脂双层 。 如果脂溶剂是
易挥发的, 这样形成的 BLM还能做到不含脂溶剂 。
另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移动, 但仍能保证左右
两侧之间有良好的绝缘性 。 铺制时先将隔板向上提起, 使小孔上升至液
面之上, 将 BLM制备液分别滴在左右两侧的水面上, 脂即在水面上扩展
为脂单分子层 。 如果在两侧水面上铺展不同的脂, 则两边的单分子层就
不对称 。 然后将隔板向下移, 当隔板的小孔移到液面下时, 很自然地在
小孔上就形成了双分子脂层 。
铺成的 BLM并不是静止不动的, 双层的脂分子是流动的, 两侧不同的
脂分子在 P－ G边界中会混合在一起, 而 P－ G边界中的脂分子是会同双分
子层中的脂分子通过流动而进行交换的, 最后在 BLM中的脂也就不可能
保持不对称了 。 但是这种方法可以确保 BLM两侧溶液不会混合, 因而可
以进行膜两侧溶液不对称时的各种研究 。
The formation of BLM by apposing two monolayers on
the tip of a micropipette by first removing the tip from
the aqueous phase on which a monolayer is present,and
then reinserting the tip through the monolayer,
不对称 BLM的制备 (2)
在滤纸的微孔中形成 BLM
在显微镜下观察滤纸，可以看到上面有许多微
孔。有人把滤纸先用脂浸泡，然后取出晾干，这
样滤纸就具有亲脂疏水特性。用这种脂处理过的
滤纸放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯
隔板（当然要有特别设计的夹具，把滤纸夹在左
右二室之间）。然后用前面介绍的方法铺制 BLM，
实践证明在滤纸的许多小孔上都形成了 BLM，只
是每个 BLM的面积小，但是许多小面积的 BLM加
起来就比单个“大”孔上铺成的 BLM还大 。
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
Temperature induced
shape changes of
vesicles (1990),
(a) Transition of a vesicle
from a biconcave shape
(center) to an invaginated
(stomatocyte) shape (left
side) at decreasing
temperature and to a
budded shape (right side)
at increasing temperature.
Shapes of vesicles (or cells)
on the basis of the bilayer
coupling hypothesis model
(1983):
The different cell shapes can be
explained in terms of two
parameters,
1) the reduced volume v=v/vs,the
ratio of the actual volume of the
cell to that of a sphere,
2) the relative area difference
?=(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s)
where A0 and Ai are the areas of
the outer and inner leaflet of the
membrane and where A0,s and
Ai,s are the corresponding values
of the sphere,Shape transformation of giant vesicle triggered
by temperature changes,The transitions are
completely reversible !
Phase contrast micrographs of shape
change of composite shell (1998).
DMPC vesicle containing 2?M of actin (image a and b) and
7 ? M(image c and d) of actin,
脂质体的类型：
SUV,小单片层脂质体 (small unilaminar-)
MLV,多片层脂质体 (multilayer-)
LUV,大单片层脂质体 (large unilaminar-)
脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相
的闭合囊泡。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (1)：
方法一：将磷脂用氯仿溶解, 通氮气干燥, 用真空泵
或旋转蒸发器驱除残留溶剂 。 加入所需的水相, 使脂质
浓度在 mM范围 。 之后, 悬浮液在探头式或水浴式超声
仪中超声至透明 （ 温度视脂质而异, 保持在相变温度以
上, 但过高温度时脂质易氧化 ） 。 用探头式时仅带几分
钟, 用水浴式则右时长达 2小时 。 虽然用水浴式费时长,
但此时超声可在充氮气的密闭容器中进行 。
用负染电镜术, 可检验囊泡的大小, 其直径下限可达
20nm。 实用中往往要加入胆固醇成分, 此时直径至少
50nm。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (2):
第二种方法是将脂质的乙醇溶液快速注入
到缓冲液中，随即自发地形成 SUV。脂质的
最终浓度为 3—30mM。所形成的囊泡直径范
围为 30-110 nm，与脂质的浓度有关 。
这一方法的优点是避免了超声的损伤．且
快速、简单及温和，但脂质体的浓度相当稀，
需要进一步浓缩，另一个缺点是高浓度的乙
醇必须由随后的纯化阶段去除。
SUV(小单层囊泡 )的制备 (3):
方法三：将 MLV的悬浮液以 20,000磅／英
寸的压力,4℃ 时通过 French滤器挤排。四次
挤排后,94％囊泡的大小范围为 31.5－ 52.5纳
米。
该法所得囊泡较超声法的略大，能适用于各
种脂质。此外，操作简单、重复性好，亦无
超声损伤。
MLV(多层囊泡 )的制备 (1)：
根据 Bangham的方法,
在 100毫升圆底烧瓶中, 用氯仿溶解 10毫克含 5摩尔 ％ PA
的 eggPC,通氮气去除氯仿, 在烧瓶壁形成磷脂薄膜 。 将烧
瓶置于真空中, 过夜 （ 或数小时 ） 除去剩留的溶剂 。 然后加
入所需的水溶液 5毫升, 脂质水化数小时 （ 相变温度之上 ） 。
然后用旋涡混合器振摇, 即得 MLV的悬浮液 。
MLV中 各片层之间的间隔取决于 Van der Waais吸引力和
水化, 静电的排斥力之间的平衡 。 生理盐浓度条件下, PC组
成的 MLV中各片层之间的间距约 2.8纳米 。 脂质带负电时,
间距增加 （ 特别是在低离子强度时 ） 。 制备中加酸性磷脂 (如
PA)的道理就在于此 。
MLV适于包囊各种物质, 也适于各种脂膜 。 其制备法是
所有脂质体制备中最简单的 。 缺点是大小分布很不均匀, 包
裹效率也不高 。
MLV(多层囊泡 )的制备 (2)：
多层囊泡的脱水形成（脱水一再水化循环法 )
0.1微摩尔磷脂用超声分散于 1毫升水中。将待包裹的物质加
入，通干燥的氮气将水分蒸发。在干燥的过程中,SUV被浓缩，
彼此融合形成多片层的平板，因而将待包裹的物质夹在诸片层
之间。干燥毕，把湿棉花塞入试管或通以含水汽的氮气流几小
时以使脂质再水化。此时，多片层膨润，形成大的囊泡。从而
俘获大部分的溶质。然后加入水，将混合物轻轻振荡以分散脂
质囊泡。若再通过聚碳酸酯滤膜，则可分选大小。
该方法的最大优点是包裹效率极高，对 DNA分子能达 50％
（ 10毫克脂质包裹 1毫克 DNA)，也能有效地包裹蛋白质。制备
过程中酶的活性仍保持近 90％。此外，适用于几乎所有的磷脂。
但该法易受水相中无机离子的影响，此外不太适用于包裹较小
的分子。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (1):
注入法
将非极性溶剂中的脂质溶液在使溶剂能挥发的条件下注入到水
溶液中, 溶液中脂质即以薄膜的形式残留在气泡和液相的界面
上 。 可以计算出, 薄膜的组成仅是几个脂双层 。 当气泡通过水
相上升时, 片层分散后形成单片层的脂质体 。 最后用聚碳酸酯
滤膜分选大小 。
具体方法,4毫升戊烷或乙醚的脂质溶液 （ 1－ 2毫摩尔脂质 ）
缓慢地注入到 4毫升, 60℃ 的水相中 （ 0.2毫升／分 ） 。 水相中缓
慢地通氮气泡以促使溶液混匀, 同时给空气一溶液的界面上提
供惰性环境, 增加气泡的大小, 从而有利于单片层囊泡的形成 。
注入完全后, 将脂质体悬浮液通过聚碳酸酯滤膜以分选大小,
去除凝聚体 。 然后, 再用凝胶柱过滤 （ 例如 Sephadex。 G－ 25或
G－ 50,Biogel P－ 10） 进一步去除残留的溶剂 。
注入法的好处是适用于各种脂质, 而且在 1小时内即可完成 。
主要的限制是最终的制剂相当稀 （ 1一 15毫摩尔 ）, 因而包裹效
率低 。 该法能得直径为 150－ 250纳米的 LUV。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (2):
反相蒸发法（ REV）
Szoka等设计了另一种制备 LUV的方法。 该方法中，水一非极性溶剂
混合液中的脂质分子形成内翻型微团，此时脂质的尾部插入非极性相，
而头部基团包围水滴。当非极性溶剂在真空中蒸发后，微团彼此结合，
形成大的单片层的囊泡。
典型制备时,66微克分子（ 50毫克）脂质溶于 3毫升乙醚，加入 1毫升
水相（ PBS等缓冲液及待包物质），通氮气下水溶式超声 2－ 5分，直至
混合物变为清沏的一相悬浮液或均匀的乳白色液（超声后 30分内水和油
相不分离）。然后，移至旋转蒸器中，用水泵抽气驱除乙醚。当大部分
溶剂除去后，悬浮液呈凝胶状，经 2－ 3次旋涡振荡后再继续减压蒸发，
直至得到均一的悬浮液．最后进过孔直径 0.2微米的聚碳酸脂滤膜，即能
得到大小校均匀的 LUV。也可用透析或上 Sepharose 4B柱或离心等方法
除去未包裹的物质及残留的有机溶剂。
REV法的优点是,1.水相的包裹容积大（水相离子强度低时，如 0.01
摩尔 NaCI，能达 65％）； 2.能包裹大的生物高分子，如铁蛋白,25S
RNA； 3.制备过程中不受水溶性蛋白质存在的影响，也不受磷脂种类的
影响； 4.水相容积从 02毫升至 10毫升都可以处理。主要的缺点是待包物
质暴露于有机溶剂中，且要经短时间超声，这样可能导致某些蛋白质的
变性或 DNA断裂。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (3):
去垢剂稀释法
将过量去垢剂 (超过 CMC)加入到膜悬浮液中直到因形成去垢剂 -脂质 -
蛋白质的混合微团而变得澄清为止。此后缓慢降低去垢剂的浓度 (如透
析 )，致使脂质与膜蛋白形成囊泡状膜结构，这样就能达到重组蛋白的作
用。去垢剂如胆酸盐,TritonX－ 100等用于脂质体重组已取得很大成功。
现列举典型的去垢剂一 LUV法,eggPC和脱氧胆酸盐混合成 1毫升溶液
（ 20微克分子脂质,10微克分子去垢剂）。水浴超声数分，最初的浑浊
悬浮液即变为透明状（因混合微团的形成）。然后用凝胶过滤除去脱氧
胆酸盐。囊泡的直径约 100纳米，可认为是小的 LUV。俘获容积为 2－ 3
升／摩尔。用该法已成功地包裹了细胞色素 C和葡萄糖等。
去垢剂稀释法已广泛地应用于膜蛋白脂质体的重组。方法学上的限制
是，透析时需几小时甚至几天才能完成；此外，如果被包裹的溶质能够
通过透析膜，则包裹效率就非常低。
LUV(大单层囊泡 )的制备 (4),SUV融合法
1.钙促融合法
Panahadjonoulos等将负电荷磷脂的 SUV和 Ca2＋ 混和，再用 EDTA螯合 Ca2＋ 。
当 Ca2＋ 与含 PS的 SUV相互作用时，囊泡首先凝聚形成沉淀，融合形成多片
层结构。而后用 EDTA去除 Ca2＋ 时，该片层结构膨胀，形成大的单层囊泡。
典型实验中,1－ 10毫摩尔不饱和 PS用以制备 SUV。加入足量的 CaCI2，
使 Ca2＋ ／脂质之比为 1,2。此时 SUV沉淀。然后，加入稍过量的 EDTA，搅
拌直至沉淀物形成 LUV的透明悬浮液。这样所形成的囊泡，能够在相当温
和的条件下包裹诸如病毒、核酸及铁蛋白等结构。俘获容积约 7升／摩尔，
20毫摩尔脂质悬浮液中包裹效率约 10－ 15％。
2.冰冻一融化一超声法
第二种融合方法是冰冻一融化一超声的方法。典型步骤是,30毫克脂质在
1毫升缓冲液中超声形成 SUV。然后加进待包物质。混合物在液氮中冰冻，
然后再融化。冰冻一融化过程可根据情况一次或两次。再在水浴中超声 30
秒（超声目的主要是用以分散聚集体）。
最终所形成的囊泡对离子不易通透，俘获容积约 8升 /摩尔。该方法的优
点是简单且温和，且可用于膜蛋白重组。然而，在有蔗糖、高浓度离子或
有二价阳离子存在时效果不好。
Three methods for reconstitution,(1) Lipid and proteins solubilized
in detergents are mixed and then the detergent is removed by dialysis,
dilution,or gel filtration,(2) Delipidated proteins can sometimes be
spontaneously incorporated into a preformed bilayer,(3) Partially
delipidated proteins with a small amount of detergents sometimes
form discs that can fuse with preformed vesicles(胆酸盐法 ),
重组脂质体
right-side-out vesicles:
0.5?M Na2PO4 and 0.1 ?M Mg+.
inside-out vesicles:
0.5?M Na2PO4,
red blood cell
红细胞膜制备脂质体
生物膜的离体研究
脂单层方法
支撑脂双层方法
平面脂双层 (黑脂膜 )方法
脂质体方法
去污剂与膜的分离
对于生物膜结构与功能的研究，通常需
要将膜解聚成各种组分。
抽提分析膜脂，一般使用有机溶剂。对
于膜蛋白，有机溶剂也是可以使用的，但
是许多蛋白在有机溶剂中容易变性，沉淀。
因此，要针对不同类型的膜蛋白选择不同
的提取方法。溶解膜蛋白可以采用：螯合
剂，改变离子强度和 pH值，蛋白的变性剂
（如脲、胍等），酶解等方法,但对于膜
内在蛋白，上述方法分离效果都不好，只
能采用去污剂抽提的方法 。
Methods for solubilization of membrane proteins,Steps
usually involved are salt wash (which removes
electrostatically bound proteins) followed by sonication or
detergent treatment,or solubilization in an organic solvent,
用去污剂溶解膜内在蛋白
搞清去垢剂溶解膜磷脂和膜蛋白的先后次序
Klingenberg实验室利用 CAT(抑制剂 )饱和的线粒体膜研究
去垢剂对这种线粒体膜的作用机理 。
结果发现, 去垢剂与蛋白的比例为 1:1时, 当膜上的磷脂约
有 50％ 被溶解后, 才开始观察到 CAT－蛋白复合体被溶解 。
因此, 去垢剂对这种线粒体膜的作用, 首先是磷脂被溶解,
然后才是蛋白被溶解 。
由此可以设想, 去垢剂单体分子首先, 攻击, 磷脂的双分
子层, 使脂的双分子层变成松散, 然后才作用于 CAT－蛋白
复合体上 。 Detergent的 单体与团粒在溶液中处于动态平衡状
态 。 由于单体分子不断深入到磷脂双层中, 使团粒不断解离
成单体 。 当愈来愈多的去垢剂分子深入到脂双层而形成复合
的磷脂－去垢剂团粒时, 蛋白分子被包围, 最后被溶解下来 。
需要了解去污剂的性质及其作用机理
纯化鉴定膜蛋白, 使用去污剂是必须的 。 在使用去污剂溶解的
过程中, 膜被破坏, 蛋白与脂双层以及细胞骨架之间的作用被去
除, 取而代之的是蛋白与去污剂之间的作用 。 蛋白被去污剂溶解
后, 膜蛋白就如同水溶性蛋白一样可被进一步分离纯化 。
但是蛋白在去污剂－蛋白复合体中常难以保持稳定, 其机理尚
不够清楚, 可能与以下几个方面有关：
（ 1） 蛋白的亲水及疏水 domain与去污剂匹配不合适 。
（ 2） 蛋白之间相互作用导致的稳定性被破坏 。
（ 3） 脂双层粘滞性比去污剂强, 蛋白因微环境变化而导致稳定
性的破坏 。
分离膜蛋白使用的去污剂
1.非离子型去污剂
a.聚氧乙烯二醇衍生物
这类去污剂比较温和, 溶解过程对蛋白结构影响较
小, 是分离膜蛋白最常使用的 。 几种聚氧乙烯二醇衍
生物类去污剂示出如下：
b.以糖苷为亲水基团，以脂肪烃链为疏水基团的
去污剂
此类去污剂多有高的 c.m.c.值，在脂膜重组中
有优势。
辛基葡萄糖苷,
c.兼性离子去污剂
此类去污剂在生物反应所需的 PH范围内处于
非离子态。包括：溶血卵磷脂、硫代三甲胺乙
内酯、胺氧化物,CHAPS等。
CHAPS
2.胆盐类去污剂
去氧胆酸盐是一种有效的溶膜去污剂。在离子型去
污剂中此类去污剂是较温和的。这类去污剂容易由 2
至 10个分子通过非极性区相互作用发生二级聚集。
(去氧 )胆酸
膜蛋白－去污剂复合物
去污剂与膜蛋白的作用方式目前认为有两种 。
(1)被溶解的膜蛋白插在胶束结构中, 胶束取代脂双层膜
包裹蛋白的疏水区；
(2)去污剂形成单层膜结构包裹蛋白疏水区, 所有的去污
剂分子都充分靠近蛋白分子 。
这两种方式都在去污剂的浓度接近 c.m.c.时实现 。 当膜
蛋白较大, 超过了所用去污剂胶束的线度, 或者使用的
去污剂烷基链较短, 难于形成厚度与磷脂双层膜相当的
胶束时, 第二种方式占优势 。
(1) (2)
去污剂－蛋白复合物中的膜蛋白的构象
在使用去污剂溶解膜蛋白的过程中, 蛋白活性的保持与溶解
的效率通常为互补的 。 适宜的溶解条件可以延缓蛋白的失活 。
以下几个方法可以帮助保持蛋白的活性构象：
(1)向溶解体系中加入甘油, 蔗糖等多元醇类化合物 。 这种方法
有助于在溶液中稳定蛋白, 不仅仅针对去污剂溶解体系 。 其机
理可能是在多羟基化合物存在的条件下, 蛋白易于被水化, 有
利于保持其天然构象 。
(2)溶解过程中尽可能降低去污剂浓度 。
(3)蛋白活性的保持有时依赖于能与其特异结合的金属离子或小
分子化合物的存在 。 如, 使用胆盐溶解生物膜时, 较高的离子
强度 （ 0.4MKCl） 有助于稳定蛋白 。
分离膜蛋白时去垢剂选择的因素,
1.去垢剂的温和性 。 这对保持分离膜蛋白的天然构
象十分重要 。 例如 SDS是一种强离子去垢剂, 具有
很好的膜溶解能力, 但温和性不理想 。 去氧胆酸和
胆酸都是弱的离子型去垢剂, 它们的温和性相对好
一些 。
2.去垢剂的临界团粒浓度 （ CMC） 。 一般来说, 离
子型去垢剂 CMC高, 非离子去污剂的 CMC很低 。
非离子型去垢剂的 CMC低,因而使膜蛋白变性的作
用也小 。
登顶成功，可惜神仙都被一脸幸
福地俺们吓跑了。
膜分子生物学
游击队
