COOH
NH2
8.膜蛋白的结构研究
膜蛋白的结构研究
蛋白的膜拓扑学研究
蛋白质的晶体学研究, X-ray; EM
蛋白质的单颗粒研究, EM; AFM
蛋白质结构的波谱技术,荧光 ; CD; NMR
膜蛋白的结构研究
蛋白的膜拓扑学研究
蛋白质的晶体学研究, 3D; 2D
蛋白质的单颗粒研究, EM; AFM
蛋白质结构的波谱技术
蛋白的膜拓扑学 (membrane
protein topology)
蛋白质序列中的跨膜区段，即蛋白质
的哪些部位插入膜内
蛋白质在膜上的整体取向，一般即蛋
白质的哪一端位于细胞膜的外侧，哪
一端位于细胞膜的内侧，以及各部分
之间的相对取向
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
膜蛋白拓扑取向的基本原理
疏水性原则
视紫红质蛋白的嗜水性
分析图谱。图谱表明该
蛋白存在 7个大片疏水
区域，由此得出视紫红
质 7次跨膜的结论
膜蛋白拓扑取向的基本原理
正电氨基酸朝内 原则
?对已知结构的细菌内膜蛋白统计发现，带
正电的氨基酸一般位于朝向胞质侧
（ cytoplasmic），即大部分带正电菏的残
基在转运过程中都不能被转运过膜。
?只有对长度较短的蛋白片断，正电残基朝
内原则才成立（一般不超过 60氨基酸），
而且在这个范围内，正电氨基酸出现在膜
内侧的比例随着片断长度的增加而减少
根据 35个细菌内膜蛋白的统计结果，胞质腔蛋白 loop区与周
质腔蛋白 loop区中正电荷氨基酸 (Lys和 Arg)所占比例的比较
(A)；以及胞质腔蛋白 loop长度与周质腔蛋白 loop长度的分布
(B)。 其中，黑色表示蛋白胞质区片断 (cytoplasmic loop)而白色表示蛋白周质腔
片断 (periplasmic loop)，横坐标为 loop长度。
正电氨基酸朝内 原则
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
关于疏水作用
疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！
dS > 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！
当一个疏水性分子（与水分子之间不能形成更强的氢键）进
入水相时，由于影响系统自由能的主要是熵变过程，外来分
子会发生聚集，以尽量减少其周围有序水分子的数目。表观
上看，好象有一种力（疏水力）的作用使它们结合到了一起。
关于疏水作用
K.Kauzmann (1959)研究非极性残基从非极性溶剂转移
至水中的热力学性质,
模型系统：非极性分子 甲烷 (CH4)
非极性溶剂 苯或 CCl4
问题的提出,X mole 甲烷从 CCl4中移至水中 free
energy 如何变化？
由 dG = dH – TdS
转移过程,dH (enthalpy) < 0 放热导致 dG降低
dS (entropy) < 0 熵降低导致 dG增加
由于 dS对 dG的贡献达到 80%,故甲烷从 CCl4中移至水中
free energy 的增加主要来自熵的贡献。
疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！
dS > 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！
蛋白质嗜水性分析
当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时，溶质从
疏水性溶剂转移到水相中化学势变化 ?Gt可以求知，这
个参数常被用来来描述溶质的嗜水性。
?Gt=RTln（ Nnh/Nh）
Nnh,Nh分别为溶质在疏水性溶剂和水中的饱和溶解度
可用氨基酸残基从疏水性溶剂转移到水相的转移自由能 ?G来描述该侧链的嗜水性 。
根据热力学公式, 溶质在水中的化学势 ?h为：
?h=uh0+RTlnxh+RTlnfh
其中,xh是以溶质的摩尔分数为单位,?h0为此时溶质在水中的标准化学势,fh为活
度系数。
在疏水性溶剂中，类似有：
?nh=unh0+RTlnxnh+RTlnfnh
其中, xnh,unh0 和 fnh分别是在疏水性溶剂中溶质的摩尔分数, 标准化学势和活度系
数 。
现定义溶质从疏水性溶剂转移到水相中的转移自由能 ?Gt为无限稀释溶液中同
样溶质的摩尔分数从疏水性溶剂转移到水相中化学势的变化, 则 ?Gt为
?Gt= uh0- unh0
又当同一溶质在各种溶剂中饱和溶解时，化学势皆相等，故：
uh0+RTlnNh+RTlnfh= unh0+RTlnNnh+RTlnfnh
其中,Nnh,Nh分别为溶质在疏水性溶剂和水中的饱和溶解度，所以：
?Gt=RTln（ Nnh/Nh） +RTln（ fnh/fh）
忽略溶质分子之间的相互作用，则有：
?Gt=RTln（ Nnh/Nh）
由此可以得出结论, 当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时, 溶质从疏水
性溶剂转移到水相中化学势变化 ?Gt可以求知, 这个参数常被用来来描述溶质的嗜
水性 。
蛋白质嗜水性分析
蛋白质疏水性分析图的作法：
有了每个氨基酸残基侧链的嗜水性值，通过计算
机 可以 作出一个蛋白质的疏水性分析图。
需要注意的是，蛋白质疏水性分析图中每个氨基酸对
应的嗜水性值并非该独立氨基酸侧链的嗜水性值，而
是以该氨基酸为中心的一小段肽链嗜水性值的平均，
这是因为在蛋白质中，某点的疏水性情况显然要受到
周围残基侧链的影响，一般区段的长度选 7,9,11或
13个氨基酸均能获得理想的结果。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
? 蛋白水解法
将含有要研究蛋白的生物膜制成取向一致
的脂质体（如 Inside out Vescicle）
?
加入蛋白水解试剂（如 Trypsin,Thermolysin等）
?
加入抑制剂终止反应
?
去垢剂溶解膜
?
SDS－ PAGE电泳
?
片断分析
? 蛋白水解法 实验中还需要注意：
? 蛋白水解抑制剂必须有效，有些蛋白酶很难被抑制，
而且加入去垢剂后仍然保持活性，这样膜蛋白全部
被水解，得不到结果；
? 可选用多种水解试剂实验，综合所得信息，另外，
当实验出现阴性结果时，并不能说明蛋白没有膜外
片断，只能说明蛋白没有膜外部分或有膜外部分但
该部分没有水解位点；
? 在电泳检测方面，如果所研究蛋白本身占所用膜上
蛋白总量的大部分，则可直接分析各主要电泳带；
但若是研究蛋白只占膜蛋白总量的小部分，则必需
用单抗或特殊的共价标记物来找出正确的电泳带分
析。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
免疫方法,
? 免疫技术的基本思想是使处于脂质体内部的片断受到
保护不与外界接触而膜外部分不受保护。由于使用特
异性的单抗而使实验结果的分析相对简单。常用的方
法是将单抗首先进行同位素标记，反应完成以后将产
物电泳然后进行放射性自显影，根据显影带的位置判
断抗体是否与蛋白结合。另外如果使用胶体金标记的
抗体与蛋白结合后电镜观察，就可以看到其结合部位。
? 这种方法仍然具有很大的局限性，主要是不能保证抗
短肽的单抗一定能和相应的蛋白序列结合，因为该部
分序列可能受蛋白质其它部分的影响而采取与短肽完
全不同的构象，或者根本就被其它部分包埋而不能被
接触。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
化学标识法：
? 通过蛋白上特殊氨基酸能否被位于特定部位的化学标
记物标记，可以判断该残基所处位置的。常用的化学
标识试剂主要分两大类，即极性试剂和非极性试剂，
极性试剂一般认为不能过膜，位于脂质体外，所以可
以与蛋白质位于水相的部分反应。而非极性试剂则能
插入膜内将蛋白位于膜内的残基化学标记。通常我们
事先将化学标记物带上放射性同位素，因此在反应完
毕以后可以通过放射性自显影来判断蛋白是否与化学
标记物发生了反应。
? 该法的缺陷在于必须保证化学标记物所处位置的正确
性，而且有的标记物能使脂质体发生泄漏影响实验结
果。特别对于碘化试剂，由于实验过程中可能产生游
离 I2,I2能透膜使实验结果失去意义。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
特殊部位定位法：
? 蛋白上特殊部位相对膜的位置往往具有重要的意义。
如糖蛋白的糖基化位点通常位于细胞膜的外侧，所
以通过寻找蛋白质序列上的糖基化位点可基本判断
该段序列位于细胞膜的外侧；同样，通过修饰酶在
细胞中的位置可推知相应的修饰位点位于膜的哪一
侧，如磷酸化酶位于细胞基质内，所以膜蛋白上的
磷酸化位点一定位于朝向胞质的一面。这项技术曾
被成功地应用于 E.Coli外膜蛋白 OmpA,LamB的拓
扑取向研究，这两种蛋白上都含有与细菌噬菌体结
合的位点，通过突变体的与噬菌体亲和性的研究可
找到结合位点的位置，从而判断该段序列位于细胞
外膜的外侧。
? 这项技术的缺点在于局限性较大，应用面不广。
融合蛋白法,
? 近年来随着分子生物学技术的发展，基因融合
的方法越来越多地被应用到了蛋白质膜拓扑取
向的研究中来。该方法的基本原理是：在原蛋
白的编码基因的一端加上一段报导基因
（ reporter gene），这样编码产物为原蛋白与一
个报导蛋白连接的嵌合蛋白,
? 报导蛋白是经过精心选择的，它们具有一定的
生化活性，并且该活性依赖于其在细胞中所处
的特定位置，也就是只有当蛋白质处于特殊的
细胞部位时才有生化活性。这样根据报导蛋白
活性的有无可以得知它在细胞中所处的位置，
从而推知与其相连接的原蛋白片断所处的位置。
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
实际上，目前关于影响蛋白质拓扑取向因素的研究主要是指哪些因素
影响蛋白质在膜上的整体取向，即哪一端朝膜内，哪一端朝膜外。因
为我们知道，蛋白质插膜部分基本上是由蛋白质本身序列的疏水性决
定的，受外部因素的影响不大。但是插膜部分确定后蛋白质的膜上的
取向仍然有两种可能，这两种取向正好颠倒 。
影响蛋白拓扑取向的因素
研究方法：
目前研究材料一般选用 Inner membrane protein leader peptidase（ Lep）及其突变体。
这是一个 E.Coli内膜蛋白，在内膜上跨膜两次,N端,C端均朝向周质腔（ periplasm）
的一面。改变条件，这个蛋白在膜上的拓扑取向可能完全翻转，即造成 N端,C端都
朝向细胞质（ cytoplasm）。由于其 C端存在 Trypsin酶切位点，因此可通过酶解实验
来判断蛋白构象是否发生了翻转，即如果蛋白未发生翻转则外加蛋白酶 Trypsin可以
将蛋白水解，但发生翻转将导致酶切位点进入细胞质而无法与蛋白酶接触。根据蛋
白水解部分所占比例我们还可以定量测知翻转构象所占比例。
影响蛋白拓扑取向的因素
信号肽
跨膜电位
膜上负电脂所占比例
信号肽的影响
许多蛋白在刚被合成时 N端多出一条短肽，称, 信号肽,,长度 15－ 25氨
基酸，多带正电荷。目前关于信号肽的研究表明它可能有多种功能。首先
是阻止初生肽链过早折叠成型，使蛋白处于无规卷曲状态以利转运；其次
是与膜上特殊受体结合实现蛋白质的选择性跨膜转运。另外，最近的研究
表明，信号肽在保持蛋白质的正确拓扑取向方面也有很重要的作用，这一
作用的实现是因为信号肽多带正电荷，而正电荷富集区域很难被转运过膜
来，从而保证了蛋白质只能选择信号肽朝内的拓扑取向
跨膜电位
Andersson等人研究了跨膜电位 ??+对 Lep拓扑取向的影响，其实验思路
基本如下：构建 Lep突变体，在其 N端引入四个正电残基以强化正电荷
因素的影响。使用 Trp水解实验测定其翻转构象所占比例。当加入消除
膜电位的试剂 CCCP重复上述实验时，发现采取翻转构象的比例显著减
少，说明正电朝内原则是依赖于膜电位的。这一点从直观上也是比较
容易理解的，因为正常细胞都具有内负的跨膜电位，从能量上讲正电
荷富集区域位于内侧也是有利的。
膜上负电脂
所占比例
Kruijff等人研究了生物膜上负电脂所占比例对蛋白质拓扑取向的影响，其实验的
对象仍然是 Lep蛋白。他们首先构建了 E.Coli突变株 HDL11，在该突变株中,psg
基因前加入了一个 Lac promoter。 psg基因编码的蛋白是合成负电磷脂必须的一个
重要酶，在引入 promoter以后该基因的表达将受到 IPTG诱导调控。在加入 IPTG
的情况下，基因正常表达，细菌内膜上含有正常比例的负电脂（ PG16％,CL3
％）；而不加 IPTG时，基因基本上不表达，负电磷脂的合成受到影响。实验表明
PG含量下将至 2％,CL含量下将至 1％，虽然细胞会通过一些其它途径使酸性磷
脂含量略增，但总的来说，负电脂所占比例不超过 9％。在这种情况下，再利用 N
端增加了四个正电残基的 Lep突变体实验，发现加入 IPTG时，翻转构象比例较大，
而不加 IPTG时，翻转构象比例下将。这说明，正电朝内原则是依赖于生物膜上酸
性磷脂所占比例的
登顶成功，可惜神仙都被一脸幸
福地俺们吓跑了。
膜分子生物学
游击队
NH2
8.膜蛋白的结构研究
膜蛋白的结构研究
蛋白的膜拓扑学研究
蛋白质的晶体学研究, X-ray; EM
蛋白质的单颗粒研究, EM; AFM
蛋白质结构的波谱技术,荧光 ; CD; NMR
膜蛋白的结构研究
蛋白的膜拓扑学研究
蛋白质的晶体学研究, 3D; 2D
蛋白质的单颗粒研究, EM; AFM
蛋白质结构的波谱技术
蛋白的膜拓扑学 (membrane
protein topology)
蛋白质序列中的跨膜区段，即蛋白质
的哪些部位插入膜内
蛋白质在膜上的整体取向，一般即蛋
白质的哪一端位于细胞膜的外侧，哪
一端位于细胞膜的内侧，以及各部分
之间的相对取向
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
膜蛋白拓扑取向的基本原理
疏水性原则
视紫红质蛋白的嗜水性
分析图谱。图谱表明该
蛋白存在 7个大片疏水
区域，由此得出视紫红
质 7次跨膜的结论
膜蛋白拓扑取向的基本原理
正电氨基酸朝内 原则
?对已知结构的细菌内膜蛋白统计发现，带
正电的氨基酸一般位于朝向胞质侧
（ cytoplasmic），即大部分带正电菏的残
基在转运过程中都不能被转运过膜。
?只有对长度较短的蛋白片断，正电残基朝
内原则才成立（一般不超过 60氨基酸），
而且在这个范围内，正电氨基酸出现在膜
内侧的比例随着片断长度的增加而减少
根据 35个细菌内膜蛋白的统计结果，胞质腔蛋白 loop区与周
质腔蛋白 loop区中正电荷氨基酸 (Lys和 Arg)所占比例的比较
(A)；以及胞质腔蛋白 loop长度与周质腔蛋白 loop长度的分布
(B)。 其中，黑色表示蛋白胞质区片断 (cytoplasmic loop)而白色表示蛋白周质腔
片断 (periplasmic loop)，横坐标为 loop长度。
正电氨基酸朝内 原则
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
关于疏水作用
疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！
dS > 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！
当一个疏水性分子（与水分子之间不能形成更强的氢键）进
入水相时，由于影响系统自由能的主要是熵变过程，外来分
子会发生聚集，以尽量减少其周围有序水分子的数目。表观
上看，好象有一种力（疏水力）的作用使它们结合到了一起。
关于疏水作用
K.Kauzmann (1959)研究非极性残基从非极性溶剂转移
至水中的热力学性质,
模型系统：非极性分子 甲烷 (CH4)
非极性溶剂 苯或 CCl4
问题的提出,X mole 甲烷从 CCl4中移至水中 free
energy 如何变化？
由 dG = dH – TdS
转移过程,dH (enthalpy) < 0 放热导致 dG降低
dS (entropy) < 0 熵降低导致 dG增加
由于 dS对 dG的贡献达到 80%,故甲烷从 CCl4中移至水中
free energy 的增加主要来自熵的贡献。
疏水物质在水中聚集熵增加是自发过程！
dS > 0 贡献是主要的！ dH ? 0 minimal ！
蛋白质嗜水性分析
当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时，溶质从
疏水性溶剂转移到水相中化学势变化 ?Gt可以求知，这
个参数常被用来来描述溶质的嗜水性。
?Gt=RTln（ Nnh/Nh）
Nnh,Nh分别为溶质在疏水性溶剂和水中的饱和溶解度
可用氨基酸残基从疏水性溶剂转移到水相的转移自由能 ?G来描述该侧链的嗜水性 。
根据热力学公式, 溶质在水中的化学势 ?h为：
?h=uh0+RTlnxh+RTlnfh
其中,xh是以溶质的摩尔分数为单位,?h0为此时溶质在水中的标准化学势,fh为活
度系数。
在疏水性溶剂中，类似有：
?nh=unh0+RTlnxnh+RTlnfnh
其中, xnh,unh0 和 fnh分别是在疏水性溶剂中溶质的摩尔分数, 标准化学势和活度系
数 。
现定义溶质从疏水性溶剂转移到水相中的转移自由能 ?Gt为无限稀释溶液中同
样溶质的摩尔分数从疏水性溶剂转移到水相中化学势的变化, 则 ?Gt为
?Gt= uh0- unh0
又当同一溶质在各种溶剂中饱和溶解时，化学势皆相等，故：
uh0+RTlnNh+RTlnfh= unh0+RTlnNnh+RTlnfnh
其中,Nnh,Nh分别为溶质在疏水性溶剂和水中的饱和溶解度，所以：
?Gt=RTln（ Nnh/Nh） +RTln（ fnh/fh）
忽略溶质分子之间的相互作用，则有：
?Gt=RTln（ Nnh/Nh）
由此可以得出结论, 当溶质在疏水性溶剂及水中的溶解度已知时, 溶质从疏水
性溶剂转移到水相中化学势变化 ?Gt可以求知, 这个参数常被用来来描述溶质的嗜
水性 。
蛋白质嗜水性分析
蛋白质疏水性分析图的作法：
有了每个氨基酸残基侧链的嗜水性值，通过计算
机 可以 作出一个蛋白质的疏水性分析图。
需要注意的是，蛋白质疏水性分析图中每个氨基酸对
应的嗜水性值并非该独立氨基酸侧链的嗜水性值，而
是以该氨基酸为中心的一小段肽链嗜水性值的平均，
这是因为在蛋白质中，某点的疏水性情况显然要受到
周围残基侧链的影响，一般区段的长度选 7,9,11或
13个氨基酸均能获得理想的结果。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
? 蛋白水解法
将含有要研究蛋白的生物膜制成取向一致
的脂质体（如 Inside out Vescicle）
?
加入蛋白水解试剂（如 Trypsin,Thermolysin等）
?
加入抑制剂终止反应
?
去垢剂溶解膜
?
SDS－ PAGE电泳
?
片断分析
? 蛋白水解法 实验中还需要注意：
? 蛋白水解抑制剂必须有效，有些蛋白酶很难被抑制，
而且加入去垢剂后仍然保持活性，这样膜蛋白全部
被水解，得不到结果；
? 可选用多种水解试剂实验，综合所得信息，另外，
当实验出现阴性结果时，并不能说明蛋白没有膜外
片断，只能说明蛋白没有膜外部分或有膜外部分但
该部分没有水解位点；
? 在电泳检测方面，如果所研究蛋白本身占所用膜上
蛋白总量的大部分，则可直接分析各主要电泳带；
但若是研究蛋白只占膜蛋白总量的小部分，则必需
用单抗或特殊的共价标记物来找出正确的电泳带分
析。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
免疫方法,
? 免疫技术的基本思想是使处于脂质体内部的片断受到
保护不与外界接触而膜外部分不受保护。由于使用特
异性的单抗而使实验结果的分析相对简单。常用的方
法是将单抗首先进行同位素标记，反应完成以后将产
物电泳然后进行放射性自显影，根据显影带的位置判
断抗体是否与蛋白结合。另外如果使用胶体金标记的
抗体与蛋白结合后电镜观察，就可以看到其结合部位。
? 这种方法仍然具有很大的局限性，主要是不能保证抗
短肽的单抗一定能和相应的蛋白序列结合，因为该部
分序列可能受蛋白质其它部分的影响而采取与短肽完
全不同的构象，或者根本就被其它部分包埋而不能被
接触。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
化学标识法：
? 通过蛋白上特殊氨基酸能否被位于特定部位的化学标
记物标记，可以判断该残基所处位置的。常用的化学
标识试剂主要分两大类，即极性试剂和非极性试剂，
极性试剂一般认为不能过膜，位于脂质体外，所以可
以与蛋白质位于水相的部分反应。而非极性试剂则能
插入膜内将蛋白位于膜内的残基化学标记。通常我们
事先将化学标记物带上放射性同位素，因此在反应完
毕以后可以通过放射性自显影来判断蛋白是否与化学
标记物发生了反应。
? 该法的缺陷在于必须保证化学标记物所处位置的正确
性，而且有的标记物能使脂质体发生泄漏影响实验结
果。特别对于碘化试剂，由于实验过程中可能产生游
离 I2,I2能透膜使实验结果失去意义。
蛋白膜拓扑学研究常用方法
理论分析,蛋白质嗜水性分析
实验分析：
? 蛋白水解法
? 免疫方法
? 化学标识法
? 特殊部位定位法
? 融合蛋白法
特殊部位定位法：
? 蛋白上特殊部位相对膜的位置往往具有重要的意义。
如糖蛋白的糖基化位点通常位于细胞膜的外侧，所
以通过寻找蛋白质序列上的糖基化位点可基本判断
该段序列位于细胞膜的外侧；同样，通过修饰酶在
细胞中的位置可推知相应的修饰位点位于膜的哪一
侧，如磷酸化酶位于细胞基质内，所以膜蛋白上的
磷酸化位点一定位于朝向胞质的一面。这项技术曾
被成功地应用于 E.Coli外膜蛋白 OmpA,LamB的拓
扑取向研究，这两种蛋白上都含有与细菌噬菌体结
合的位点，通过突变体的与噬菌体亲和性的研究可
找到结合位点的位置，从而判断该段序列位于细胞
外膜的外侧。
? 这项技术的缺点在于局限性较大，应用面不广。
融合蛋白法,
? 近年来随着分子生物学技术的发展，基因融合
的方法越来越多地被应用到了蛋白质膜拓扑取
向的研究中来。该方法的基本原理是：在原蛋
白的编码基因的一端加上一段报导基因
（ reporter gene），这样编码产物为原蛋白与一
个报导蛋白连接的嵌合蛋白,
? 报导蛋白是经过精心选择的，它们具有一定的
生化活性，并且该活性依赖于其在细胞中所处
的特定位置，也就是只有当蛋白质处于特殊的
细胞部位时才有生化活性。这样根据报导蛋白
活性的有无可以得知它在细胞中所处的位置，
从而推知与其相连接的原蛋白片断所处的位置。
蛋白的膜拓扑学研究
膜蛋白拓扑取向的基本原理
蛋白膜拓扑学研究常用方法
影响蛋白拓扑取向的因素
实际上，目前关于影响蛋白质拓扑取向因素的研究主要是指哪些因素
影响蛋白质在膜上的整体取向，即哪一端朝膜内，哪一端朝膜外。因
为我们知道，蛋白质插膜部分基本上是由蛋白质本身序列的疏水性决
定的，受外部因素的影响不大。但是插膜部分确定后蛋白质的膜上的
取向仍然有两种可能，这两种取向正好颠倒 。
影响蛋白拓扑取向的因素
研究方法：
目前研究材料一般选用 Inner membrane protein leader peptidase（ Lep）及其突变体。
这是一个 E.Coli内膜蛋白，在内膜上跨膜两次,N端,C端均朝向周质腔（ periplasm）
的一面。改变条件，这个蛋白在膜上的拓扑取向可能完全翻转，即造成 N端,C端都
朝向细胞质（ cytoplasm）。由于其 C端存在 Trypsin酶切位点，因此可通过酶解实验
来判断蛋白构象是否发生了翻转，即如果蛋白未发生翻转则外加蛋白酶 Trypsin可以
将蛋白水解，但发生翻转将导致酶切位点进入细胞质而无法与蛋白酶接触。根据蛋
白水解部分所占比例我们还可以定量测知翻转构象所占比例。
影响蛋白拓扑取向的因素
信号肽
跨膜电位
膜上负电脂所占比例
信号肽的影响
许多蛋白在刚被合成时 N端多出一条短肽，称, 信号肽,,长度 15－ 25氨
基酸，多带正电荷。目前关于信号肽的研究表明它可能有多种功能。首先
是阻止初生肽链过早折叠成型，使蛋白处于无规卷曲状态以利转运；其次
是与膜上特殊受体结合实现蛋白质的选择性跨膜转运。另外，最近的研究
表明，信号肽在保持蛋白质的正确拓扑取向方面也有很重要的作用，这一
作用的实现是因为信号肽多带正电荷，而正电荷富集区域很难被转运过膜
来，从而保证了蛋白质只能选择信号肽朝内的拓扑取向
跨膜电位
Andersson等人研究了跨膜电位 ??+对 Lep拓扑取向的影响，其实验思路
基本如下：构建 Lep突变体，在其 N端引入四个正电残基以强化正电荷
因素的影响。使用 Trp水解实验测定其翻转构象所占比例。当加入消除
膜电位的试剂 CCCP重复上述实验时，发现采取翻转构象的比例显著减
少，说明正电朝内原则是依赖于膜电位的。这一点从直观上也是比较
容易理解的，因为正常细胞都具有内负的跨膜电位，从能量上讲正电
荷富集区域位于内侧也是有利的。
膜上负电脂
所占比例
Kruijff等人研究了生物膜上负电脂所占比例对蛋白质拓扑取向的影响，其实验的
对象仍然是 Lep蛋白。他们首先构建了 E.Coli突变株 HDL11，在该突变株中,psg
基因前加入了一个 Lac promoter。 psg基因编码的蛋白是合成负电磷脂必须的一个
重要酶，在引入 promoter以后该基因的表达将受到 IPTG诱导调控。在加入 IPTG
的情况下，基因正常表达，细菌内膜上含有正常比例的负电脂（ PG16％,CL3
％）；而不加 IPTG时，基因基本上不表达，负电磷脂的合成受到影响。实验表明
PG含量下将至 2％,CL含量下将至 1％，虽然细胞会通过一些其它途径使酸性磷
脂含量略增，但总的来说，负电脂所占比例不超过 9％。在这种情况下，再利用 N
端增加了四个正电残基的 Lep突变体实验，发现加入 IPTG时，翻转构象比例较大，
而不加 IPTG时，翻转构象比例下将。这说明，正电朝内原则是依赖于生物膜上酸
性磷脂所占比例的
登顶成功，可惜神仙都被一脸幸
福地俺们吓跑了。
膜分子生物学
游击队
