发酵工程 精品课程
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
华东理工大学 ·生物工程学院
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第七章 发酵过程的代谢控制
发酵过程控制是发酵的重要部分
控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次
会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复
杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的
差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别
都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵
过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的
发酵过程的代谢控制
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第一节 发酵过程工艺控制的
目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类
分批培养
补料分批培养
半连续培养
连续培养
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
1,分批发酵
简单的过程，培养基中接入菌种以后，
没有物料的加入和取出，除了空气的
通入和排气。整个过程中菌的浓度、
营养成分的浓度和产物浓度等参数都
随时间变化。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、
稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因
为当菌种接种入一个新的环境，细胞内
的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到
一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很
快，比生长速率几近常数。这个时期称为对
数生长期
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
随着细胞生长，培养液中的营养物减少，
废物积累，导致细胞生长速率下降，进入
减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大
于生成速率，进入死亡期
对于初级代谢产物，在对数生长期初期就
开始合成并积累，而次级代谢产物则在对
数生长期后期和稳定期大量合成。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
分批培养的优缺点
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产
过程和产品质量容易掌握
缺点 产率低，不适于测定动力学数据
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克
服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。
在此过程中只有料液的加入没有料液的取
出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开
始时有所增加。在工厂的实际生产中采用
这种方法很多。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓
度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补
料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以
利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产
工艺。
缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致
比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染
菌机会
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
3、半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉部分
发酵液（带放）称为半连续培养。某些
品种采取这种方式，如四环素发酵
优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，
使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，
提高了总产量 。
缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总
体积增大
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
4、连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量
的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓
度，限制性基质浓度都是恒定的。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
连续培养的优缺点
优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。
发酵周期长，得到高的产量。由于 μ＝ D，通过
改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动
力学
缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌
种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增
加。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二 发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长
的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来
目标是得到最大的比生产速率和最大的生产
率
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
?菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、
营养要求（酶系统）、代谢速率
?菌代谢与环境的相关性 温度,pH、渗透压、
离子强度、溶氧浓度、剪切力等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈
网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用
作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前
体，也可能合成副产物，而这些前体有可能
流向不同的反应方向，环境条件的差异会引
发代谢朝不同的方向进行。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物的生长与产物合成有密切相关性，
不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多
少，而且菌体生长正常与否，即前期的代
谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别
是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性
因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂
的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工
程水平全面的认识
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本
身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因
素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有
不确定性和复杂性。
为了全面的认识发酵过程，本章首先要告
诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上
再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及
进行优化放大。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
三 发酵过程研究的方法和层次
1、研究方法
单因子实验, 对实验中要考察的因子逐个进行试
验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实
验
优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较
快时间内得到的结果。
缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长
各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准
确性
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
数理统计学方法, 运用统计学方法设计实验和分
析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、
均匀设计、响应面设计。
优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过
数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，
大大提高了实验效率。
但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的
最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中
存在较大的误差就会得出错误的结果。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、研究的层次
初级层次的研究,
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株
生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最
适温度、最适 pH等要求。
摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几
十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优
化有较高的效率。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
代谢及工程参数层次研究,
一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的
基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参
数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利
用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发
酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和
方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以
得到的代谢情况比较可信。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
我们学院的国家生物工程中心创制的全参数发酵
罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧,pH电极，
得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，
补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，
有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期
科研成果的结晶，可以得到 14个发酵过程参数，
并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过
程的分析起到了重要的作用
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
鸟苷发酵过程曲线
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
生产规模放大,
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐
的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产
业化的实现。
一般来说微生物在不同体积的反应器中的生
长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造
成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，
剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同
所致。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第二节 发酵过程的中间分析
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显
示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为
微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它
的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所
以说中间分析是生产控制的眼睛。
这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映
发酵过程中菌的生理代谢状况，如 pH，溶氧，
尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数,温度、搅拌转速、空气压力、空气
流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）
浓度等
化学参数,基质浓度（包括糖、氮、磷）,pH、
产物浓度、、核酸量等
生物参数,菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速
率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
从检测手段分可分为：直接参数、间接
参数
直接参数,通过仪器或其它分析手段可以测得
的参数，如温度,pH、残糖等
间接参数,将直接参数经过计算得到的参数，
如摄氧率,KLa等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
直接参数又可分为, 在线检测参数和离
线检测参数
在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐上安装
的仪表上得到的参数，如温度,pH、搅拌转速；
离线检测参数 指取出样后测定得到的参数，如
残糖,NH2-N、菌体浓度。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一 发酵过程主要分析的项目
目前发酵过程主要分析项目如下
1,pH
pH与微生物的生命活动密切相关 ——酶
催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综合反
映 ——基质代谢、产物合成、细胞状态、
营养状况、供氧状况
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还
剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，
通过计算可以求得摄氧率（ OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生
物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入
代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧
并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降
解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的
氧。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，
生长阶段的不同而不同。测定 RQ值一方面可以了
解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料
CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二
氧化碳的量
呼吸熵＝
OUR
C E RRQ ?
呼吸熵反映了氧的利用状况
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有
意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，
维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这
种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在
补糖开始时，不但 CER,OUR大幅度提高，连 RQ
也提高约 10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳
源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关
酶活力也提高，产能增加。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况
反映产物合成的活力
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含
量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节
pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖。
总糖 指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的
淀粉、饴糖、单糖等各种糖 。
还原糖 指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄
糖。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
4、氨基氮和氨氮
氨基氮 指有机氮中的氮（ NH2-N），单位是 mg/100ml。
如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。
氨氮 指无机氨中的氮（ NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到
过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基
氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。
发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过
程。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐
为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物 ATP的
组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培
养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就
要采取补磷措施。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
6、菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌
体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓
基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量
补料量适合与否的一个参数。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
菌浓测定方法
测粘度
压缩体积法（离心）
静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵
母
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
7、产物浓度
在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积
累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓
度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要
参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比
生产速率，从而分析发酵条件如补料,pH对
产物形成的影响。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二 产物量的测定
（一） 产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，
效价大小用单位（ U）来表示
效价表示方法：重量折算法
重量单位
类似重量单位
特殊单位
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个
单位，如青霉素 0.6微克＝ 1U
重量单位：规定某些抗生素活性部分
1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等
定义活性部分 1μg＝ 1u
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
类似重量单位：规定抗生素的某种盐
1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一
为 1μg＝ 1u
特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位
制霉菌素 1mg=3700u
多粘菌素 B 1mg=10000u
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、酶活力的表示法
酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，
不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同
的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成
混乱，为此国际上作了统一规定，规定在
250C下,以最适的底物浓度，最适的缓冲液
离子强度，以及最适的 pH诸条件下，每分钟
能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性
单位。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（二） 产物量的测定
1、化学法
（ 1）滴定法
产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定
法
如青霉素在碱性条件下加入过量的 I2，反应生成青霉噻
唑酸碘，用 Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的
单位
计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素 滴定多余过量 ????? ?????? ?? ? 23222,IOSNAIOH
柠檬酸可以用 NaOH滴定来计算柠檬酸产量
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（ 2）比色法
产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓
度成正比，可以用比色法测定。
蓝色麦芽酚链霉素 加热，－ ? ?????? ?? ?? 22,FeOHOH
淀粉酶活力测定：在 1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉
酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（ 3,5-二硝基水
杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在 540nm
处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（ 3）测压法
产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力
变化，可以通过测定压力变化得知产物量。
2、物理法
许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋
光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或
抗生素的含量。
谷氨酸 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 γ－氨基丁酸＋ CO2
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程
分析
缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生
素成品的测定用生物法测定。
适用于抗生素效价的测定
生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准, 其
原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏
度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。
但此法得到结果比较慢，需经过 16~18小时培养。
生物法常用于发酵终了产品效价的测定。
3、生物法
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法
“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径
为 6mm，高 10mm的圆筒形管子，管子的重量尽
可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。
操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全
融化，倒在培养皿内，每碟 15ml（下层），待
其凝固。此外，将融化的培养基冷却到 500C左右
混入试验菌，将混有菌的培养基 5 ml加到已凝固
的培养基上待凝固（上层）。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样
品，加满后在 370C培养 16~18小时。在培养中,
一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩
散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生
素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低
抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透
明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，
抑菌圈越大，
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
r,抑菌圈的半径 (毫米）
M：抗生素在管中的量
（单位）
C：最低抑菌浓度（单
位 /毫升）
H：培养基的厚度（毫
米）
L：管子的高度（毫米）
D：抗生素的扩散系数
（毫米 /小时）
T：细菌生长到肉眼所
用的时间
（小时）
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系
logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)
抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方
呈正比。此外还受 C,H,D,T的影响
但是 C,H,D,T是无法测量的，在实际计
算中要设法消去
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一般的消去方法有
?二剂量法
?标准曲线法
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
KmMmM ??''
两剂量法,标准品低单位
总量,m
抑菌圈半径 SL
标准品高单
位
总量,M
抑菌圈半径：
SH
样品高单位
总量,M’
抑菌圈半径 UH
样品低单位
总量,m’
抑菌圈半径,UL
)4lo g ()21.9 1(lo g 2 D T HCSDTM H ????
)4log ()21.9 1('log 2 D T HCUDTM H ????
)4lo g ()21.9 1('lo g 2 D T HCSDTm L ????
)4log ()21.9 1(log 2 D T HCUDTm L ????
??MM '
? ?? ? K
USUS
SUSU
LLHH
LLHH lo glo g 2222
2222
???
?????
已知：
令：
得出,? ?? ? KUSUS SUSU
LLHH
LLHH lo glo g ??? ?????→
KWV loglog ??→
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM’—logM＝ D T HCDT U H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
_
D T HCDT S H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
logM’/M=
同理 logm’—logm=logm’/m=
)(21.9 1 22 SU HHDT ?=logθ
=logθ)(
21.9
1 22
LL SUDT ?
2logθ= )(
21.9
1 2222
LLHH SUSUDT ???
)( )(lo glo g 2222
2222
LHLH
LLHH SSUU SUSUK ??? ?????
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM’—logm’=logM’/m’= )(
21.9
1 22 UU
LHDT ?=logK
logM—logm=logM/m= )(
21.9
1 22
LH SSDT ?
=logK
2logK= )(
21.9
1 2222
LHLH SSUUDT ???
)(
)(
lo g
lo g
2222
2222
LHLH
LLHH
SSUU
SUSU
K ???
?????
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
标准曲线法
优点：在一个碟子上可以
同时做两个样品的效价，
当要做的样品量大时，采
取标准曲线法可以提高效
率。
假设选用的浓度为,3U,4U,5U，
6U,7U
中心点是 5U
1
1
2
2
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
每个浓度做三个碟子。
5U为中心点，每个碟
子中有 3个杯中加中心
点浓度，其余 3个加其
它浓度。测得抑菌圈
后，将浓度和抑菌圈
平均直径做标准曲线。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM
r
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
管碟法影响因素的讨论：
)4l og ()21.9 1(l og 2 D T HCrDTM ????
斜率小 D,T大,误差小
截距小 C,D,T,H小，误差小
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM
r
logM1
r1r1r1
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
?培养基厚度
H越小，其它条件相同时 r越大。
影响 H的因素：培养基的厚度
?细菌生长到肉眼所需的时间 T越大在其它条件
相同时,r越大
影响 T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条
件如：接种量，培养温度、及营养环境
其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的
温度、钢圈的放置、滴液
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
华东理工大学 ·生物工程学院
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第七章 发酵过程的代谢控制
发酵过程控制是发酵的重要部分
控制难点：过程的不确定性和参数的非线性
同样的菌种，同样的培养基在不同工厂，不同批次
会得到不同的结果，可见发酵过程的影响因素是复
杂的，比如设备的差别、水的差别、培养基灭菌的
差别，菌种保藏时间的长短，发酵过程的细微差别
都会引起微生物代谢的不同。了解和掌握分析发酵
过程的一般方法对于控制代谢是十分必要的
发酵过程的代谢控制
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第一节 发酵过程工艺控制的
目的、研究的方法和层次
一 发酵过程的种类
分批培养
补料分批培养
半连续培养
连续培养
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
1,分批发酵
简单的过程，培养基中接入菌种以后，
没有物料的加入和取出，除了空气的
通入和排气。整个过程中菌的浓度、
营养成分的浓度和产物浓度等参数都
随时间变化。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期 稳 定 期 死亡期
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物生长分为：迟滞期、对数生长期、
稳定期和死亡期
在迟滞期，菌体没有分裂只有生长，因
为当菌种接种入一个新的环境，细胞内
的核酸、酶等稀释，这时细胞不能分裂。
当细胞内的与细胞分裂相关的物质浓度达到
一定程度，细胞开始分裂，这时细胞生长很
快，比生长速率几近常数。这个时期称为对
数生长期
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
随着细胞生长，培养液中的营养物减少，
废物积累，导致细胞生长速率下降，进入
减速期和稳定期。最后当细胞死亡速率大
于生成速率，进入死亡期
对于初级代谢产物，在对数生长期初期就
开始合成并积累，而次级代谢产物则在对
数生长期后期和稳定期大量合成。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
分批培养的优缺点
优点 操作简单，周期短，染菌机会少，生产
过程和产品质量容易掌握
缺点 产率低，不适于测定动力学数据
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克
服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。
在此过程中只有料液的加入没有料液的取
出，所以发酵结束时发酵液体积比发酵开
始时有所增加。在工厂的实际生产中采用
这种方法很多。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
补料分批培养的优缺点
优点 在这样一种系统中可以维持低的基质浓
度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补
料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以
利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产
工艺。
缺点 由于没有物料取出，产物的积累最终导致
比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染
菌机会
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
3、半连续培养
在补料分批培养的基础上间歇放掉部分
发酵液（带放）称为半连续培养。某些
品种采取这种方式，如四环素发酵
优点 放掉部分发酵液，再补入部分料液，
使代谢有害物得以稀释有利于产物合成，
提高了总产量 。
缺点 代谢产生的前体物被稀释，提取的总
体积增大
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
4、连续培养
发酵过程中一边补入新鲜料液一边放出等量
的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。
达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓
度，限制性基质浓度都是恒定的。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
连续培养的优缺点
优点 控制稀释速率可以使发酵过程最优化。
发酵周期长，得到高的产量。由于 μ＝ D，通过
改变稀释速率可以比较容易的研究菌生长的动
力学
缺点 菌种不稳定的话，长期连续培养会引起菌
种退化，降低产量。长时间补料染菌机会大大增
加。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二 发酵过程工艺控制的目的
有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长
的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来
目标是得到最大的比生产速率和最大的生产
率
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发挥菌种的最大生产潜力考虑之点
?菌种本身的代谢特点 生长速率、呼吸强度、
营养要求（酶系统）、代谢速率
?菌代谢与环境的相关性 温度,pH、渗透压、
离子强度、溶氧浓度、剪切力等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物代谢是一个复杂的系统，它的代谢呈
网络形式，比如糖代谢产生的中间物可能用
作合成菌体的前体，可能用作合成产物的前
体，也可能合成副产物，而这些前体有可能
流向不同的反应方向，环境条件的差异会引
发代谢朝不同的方向进行。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
微生物的生长与产物合成有密切相关性，
不仅表现在菌体量的大小影响产物量的多
少，而且菌体生长正常与否，即前期的代
谢直接影响中后期代谢的正常与否。特别
是对于次级代谢产物的合成更具有复杂性
因此对发酵过程的了解不能机械的，割裂
的去认识，而要从细胞代谢水平和反应工
程水平全面的认识
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程受到多因素又相互交叉的影响如菌本
身的遗传特性、物质运输、能量平衡、工程因
素、环境因素等等。因此发酵过程的控制具有
不确定性和复杂性。
为了全面的认识发酵过程，本章首先要告
诉大家分析发酵过程的基本方面，在此基础上
再举一些例子，说明如何综合分析发酵过程及
进行优化放大。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
三 发酵过程研究的方法和层次
1、研究方法
单因子实验, 对实验中要考察的因子逐个进行试
验，寻找每个因子的最佳条件。一般用摇瓶做实
验
优点 一次可以进行多种条件的实验，可以在较
快时间内得到的结果。
缺点 如果考察的条件多，实验时间会比较长
各因子之间可能会产生交互作用，影响的结果准
确性
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
数理统计学方法, 运用统计学方法设计实验和分
析实验结果，得到最佳的实验条件。如正交设计、
均匀设计、响应面设计。
优点 同时进行多因子试验。用少量的实验，经过
数理分析得到单因子实验同样的结果，甚至更准确，
大大提高了实验效率。
但对于生物学实验要求准确性高，因为实验的
最佳条件是经过统计学方法算出来的，如果实验中
存在较大的误差就会得出错误的结果。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、研究的层次
初级层次的研究,
一般在摇瓶规模进行试验。主要考察目的菌株
生长和代谢的一般条件，如培养基的组成、最
适温度、最适 pH等要求。
摇瓶研究的优点是工作量大，可以一次试验几
十种甚至几百种条件，对于菌种培养条件的优
化有较高的效率。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
代谢及工程参数层次研究,
一般在小型反应器规模进行试验。在摇瓶试验的
基础上，考察溶氧、搅拌等摇瓶上无法考察的参
数，以及在反应器中微生物对各种营养成分的利
用速率、生长速率、产物合成速率及其它一些发
酵过程参数的变化，找出过程控制的最佳条件和
方式。由于罐发酵中全程参数的是连续的，所以
得到的代谢情况比较可信。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
我们学院的国家生物工程中心创制的全参数发酵
罐除了装备有常规发酵罐的温度、溶氧,pH电极，
得到发酵全过程的这些参数外，还有罐体称重，
补料计量装置和尾气采集分析系统，更重要的是，
有一套独特的数据处理软件，软件的开发是长期
科研成果的结晶，可以得到 14个发酵过程参数，
并且可以输入和绘制人工测定的参数，对发酵过
程的分析起到了重要的作用
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
鸟苷发酵过程曲线
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
生产规模放大,
在大型发酵罐规模进行试验。将小型发酵罐
的优化条件在大型反应器上得以实现,达到产
业化的实现。
一般来说微生物在不同体积的反应器中的生
长速率是不同的，原因可能是，罐的深度造
成氧的溶解度、空气停留时间和分布不同，
剪切力不同，灭菌时营养成分破坏程度不同
所致。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程工艺控制的目的、研究的方法和层次
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第二节 发酵过程的中间分析
发酵过程的中间分析是生产控制的眼睛，它显
示了发酵过程中微生物的主要代谢变化。因为
微生物个体极微小，肉眼无法看见，要了解它
的代谢状况，只能从分析一些参数来判断，所
以说中间分析是生产控制的眼睛。
这些代谢参数又称为状态参数，因为它们反映
发酵过程中菌的生理代谢状况，如 pH，溶氧，
尾气氧，尾气二氧化碳，粘度，菌浓度等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
代谢参数按性质分可分三类：
物理参数,温度、搅拌转速、空气压力、空气
流量、溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）
浓度等
化学参数,基质浓度（包括糖、氮、磷）,pH、
产物浓度、、核酸量等
生物参数,菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速
率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
从检测手段分可分为：直接参数、间接
参数
直接参数,通过仪器或其它分析手段可以测得
的参数，如温度,pH、残糖等
间接参数,将直接参数经过计算得到的参数，
如摄氧率,KLa等
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
直接参数又可分为, 在线检测参数和离
线检测参数
在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐上安装
的仪表上得到的参数，如温度,pH、搅拌转速；
离线检测参数 指取出样后测定得到的参数，如
残糖,NH2-N、菌体浓度。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一 发酵过程主要分析的项目
目前发酵过程主要分析项目如下
1,pH
pH与微生物的生命活动密切相关 ——酶
催化活性
pH的变化又是微生物代谢状况的综合反
映 ——基质代谢、产物合成、细胞状态、
营养状况、供氧状况
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
排气氧的浓度表征了进气的氧被微生物利用以后还
剩余的氧，因此排气氧的大小反映了菌生长的活性，
通过计算可以求得摄氧率（ OUR）。
排气二氧化碳反映了微生物代谢的情况，因为微生
物摄入的氧并不是全部变成二氧化碳的，有的进入
代谢中间物分子，进入细胞或产物，因此消耗的氧
并不等于排出的二氧化碳，此外，含氧的有机物降
解后会产生二氧化碳，使排气二氧化碳大于消耗的
氧。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，
生长阶段的不同而不同。测定 RQ值一方面可以了
解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料
CER表示单位体积发酵液单位时间内释放的二
氧化碳的量
呼吸熵＝
OUR
C E RRQ ?
呼吸熵反映了氧的利用状况
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有
意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，
维持产生次级代谢产物的速率在较高水平。对于这
种工艺，后期的补料控制是关键。过程中发现，在
补糖开始时，不但 CER,OUR大幅度提高，连 RQ
也提高约 10％，表明通过补糖不但提供了更多的碳
源，而且随着体系内葡萄糖浓度提高，糖代谢相关
酶活力也提高，产能增加。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
3、糖含量
微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。
糖的消耗 反映产生菌的生长繁殖情况
反映产物合成的活力
菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含
量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节
pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。
糖含量测定包括总糖和还原糖。
总糖 指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的
淀粉、饴糖、单糖等各种糖 。
还原糖 指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄
糖。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
4、氨基氮和氨氮
氨基氮 指有机氮中的氮（ NH2-N），单位是 mg/100ml。
如氨基酸中的氮，黄豆饼粉、花生饼粉中都有有机氮。
氨氮 指无机氨中的氮（ NH3-N）。
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。
但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到
过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基
氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。
发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过
程。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
5、磷含量
微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐
为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根。
磷是核酸的组成部分，是高能化合物 ATP的
组成部分，磷还能促进糖代谢。因此磷在培
养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就
要采取补磷措施。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
6、菌浓度和菌形态
菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。
菌形态 显微镜观察
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌
体量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓
基本恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量
补料量适合与否的一个参数。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
菌浓测定方法
测粘度
压缩体积法（离心）
静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵
母
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
7、产物浓度
在培养过程中，产生菌的合成能力和产物积
累情况都要通过产物量的测定来了解，产物浓
度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重要
参数。而且通过计算还可以得到生产速率和比
生产速率，从而分析发酵条件如补料,pH对
产物形成的影响。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二 产物量的测定
（一） 产物量的特殊表示法
1、抗生素效价的表示
抗生素效价表示抗生素的有效成分的多少，
效价大小用单位（ U）来表示
效价表示方法：重量折算法
重量单位
类似重量单位
特殊单位
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个
单位，如青霉素 0.6微克＝ 1U
重量单位：规定某些抗生素活性部分
1μg=1u 如链霉素、卡那霉素、红霉素等
定义活性部分 1μg＝ 1u
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
类似重量单位：规定抗生素的某种盐
1mg=1000u如金霉素、四环素的盐酸盐定一
为 1μg＝ 1u
特殊单位：药检所制定某些抗生素的单位
制霉菌素 1mg=3700u
多粘菌素 B 1mg=10000u
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
2、酶活力的表示法
酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯，
不能用重量来表示酶的量。同一种酶用不同
的方法测定会有不同的酶活单位，容易造成
混乱，为此国际上作了统一规定，规定在
250C下,以最适的底物浓度，最适的缓冲液
离子强度，以及最适的 pH诸条件下，每分钟
能转化一微克分子底物的酶定量为一个活性
单位。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（二） 产物量的测定
1、化学法
（ 1）滴定法
产物能使一定指示剂变色来指示反应终点的可用滴定
法
如青霉素在碱性条件下加入过量的 I2，反应生成青霉噻
唑酸碘，用 Na2S2O3滴定多余的碘，可计算出青霉素的
单位
计算青霉素效价青霉噻唑酸碘青霉素 滴定多余过量 ????? ?????? ?? ? 23222,IOSNAIOH
柠檬酸可以用 NaOH滴定来计算柠檬酸产量
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（ 2）比色法
产物经一定化学反应产生颜色，且颜色深浅与产物浓
度成正比，可以用比色法测定。
蓝色麦芽酚链霉素 加热，－ ? ?????? ?? ?? 22,FeOHOH
淀粉酶活力测定：在 1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉
酶，所释放出的麦芽糖与生色试剂（ 3,5-二硝基水
杨酸与酒石酸钾钠的碱溶液）产生颜色，它在 540nm
处所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
（ 3）测压法
产物特定反应放出或摄入气体，使系统有压力
变化，可以通过测定压力变化得知产物量。
2、物理法
许多酶、抗生素都有不对称碳原子，具有旋
光性，因此可以通过测定旋光度来测定酶或
抗生素的含量。
谷氨酸 ?????? ?? 谷氨酸脱氢酶 γ－氨基丁酸＋ CO2
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
化学和物理方法优点：快速、方便，经常用于过程
分析
缺点产品中存在的杂质会干扰测定结果，因此抗生
素成品的测定用生物法测定。
适用于抗生素效价的测定
生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准, 其
原理恰好与临床应用的要求相一致，而且此法灵敏
度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。
但此法得到结果比较慢，需经过 16~18小时培养。
生物法常用于发酵终了产品效价的测定。
3、生物法
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
常用的生物法测定抗生素，采用杯碟法
“杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径
为 6mm，高 10mm的圆筒形管子，管子的重量尽
可能相等。碟是摊布培养基的玻璃培养皿。
操作方法是：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全
融化，倒在培养皿内，每碟 15ml（下层），待
其凝固。此外，将融化的培养基冷却到 500C左右
混入试验菌，将混有菌的培养基 5 ml加到已凝固
的培养基上待凝固（上层）。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
在培养基表面垂直放上小杯，在杯中加入待检样
品，加满后在 370C培养 16~18小时。在培养中,
一方面试验菌开始生长另一方面抗生素呈球面扩
散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生
素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低
抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透
明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，
抑菌圈越大，
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
r,抑菌圈的半径 (毫米）
M：抗生素在管中的量
（单位）
C：最低抑菌浓度（单
位 /毫升）
H：培养基的厚度（毫
米）
L：管子的高度（毫米）
D：抗生素的扩散系数
（毫米 /小时）
T：细菌生长到肉眼所
用的时间
（小时）
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
抗生素浓度与抑菌圈的半径成一定数学关系
logM=(1/9.21DT)r2+log(C.4πDTH)
抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方
呈正比。此外还受 C,H,D,T的影响
但是 C,H,D,T是无法测量的，在实际计
算中要设法消去
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
一般的消去方法有
?二剂量法
?标准曲线法
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
KmMmM ??''
两剂量法,标准品低单位
总量,m
抑菌圈半径 SL
标准品高单
位
总量,M
抑菌圈半径：
SH
样品高单位
总量,M’
抑菌圈半径 UH
样品低单位
总量,m’
抑菌圈半径,UL
)4lo g ()21.9 1(lo g 2 D T HCSDTM H ????
)4log ()21.9 1('log 2 D T HCUDTM H ????
)4lo g ()21.9 1('lo g 2 D T HCSDTm L ????
)4log ()21.9 1(log 2 D T HCUDTm L ????
??MM '
? ?? ? K
USUS
SUSU
LLHH
LLHH lo glo g 2222
2222
???
?????
已知：
令：
得出,? ?? ? KUSUS SUSU
LLHH
LLHH lo glo g ??? ?????→
KWV loglog ??→
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM’—logM＝ D T HCDT U H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
_
D T HCDT S H ?4.lo g)21.9 1( 2 ?
logM’/M=
同理 logm’—logm=logm’/m=
)(21.9 1 22 SU HHDT ?=logθ
=logθ)(
21.9
1 22
LL SUDT ?
2logθ= )(
21.9
1 2222
LLHH SUSUDT ???
)( )(lo glo g 2222
2222
LHLH
LLHH SSUU SUSUK ??? ?????
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM’—logm’=logM’/m’= )(
21.9
1 22 UU
LHDT ?=logK
logM—logm=logM/m= )(
21.9
1 22
LH SSDT ?
=logK
2logK= )(
21.9
1 2222
LHLH SSUUDT ???
)(
)(
lo g
lo g
2222
2222
LHLH
LLHH
SSUU
SUSU
K ???
?????
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
标准曲线法
优点：在一个碟子上可以
同时做两个样品的效价，
当要做的样品量大时，采
取标准曲线法可以提高效
率。
假设选用的浓度为,3U,4U,5U，
6U,7U
中心点是 5U
1
1
2
2
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
每个浓度做三个碟子。
5U为中心点，每个碟
子中有 3个杯中加中心
点浓度，其余 3个加其
它浓度。测得抑菌圈
后，将浓度和抑菌圈
平均直径做标准曲线。
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM
r
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
管碟法影响因素的讨论：
)4l og ()21.9 1(l og 2 D T HCrDTM ????
斜率小 D,T大,误差小
截距小 C,D,T,H小，误差小
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
logM
r
logM1
r1r1r1
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
?培养基厚度
H越小，其它条件相同时 r越大。
影响 H的因素：培养基的厚度
?细菌生长到肉眼所需的时间 T越大在其它条件
相同时,r越大
影响 T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条
件如：接种量，培养温度、及营养环境
其它影响因素：上层铺得平整、菌液加入时的
温度、钢圈的放置、滴液
发酵过程的代谢控制
?发酵过程的中间分析
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
