发酵工程 精品课程
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第三节 微生物培养过程的参数检测
在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）
放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控
制提供依据 。
黑箱 灰箱?? ?? 参数检测
检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、
双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等
检测代谢中间物，分析代谢流向,RNA检测
一 参数在线检测
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由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，
因此对传感器有特殊要求：
? 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌
（材料、数据）
? 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染
菌（密封性好）
? 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。
（响应快、灵敏）
? 传感器性能要稳定，受气泡影响小。
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带计算机数据采集与控制的生物反应系统
P188
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原理：化学或物理信号 电信号
放大 记录显示仪
控制器（与设定参数比较）
发出调节信号 控制器动作
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介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理
?pH电极
?溶氧电极
它们是基础电极，以它们为基础可以制作各
种离子电极和酶电极
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（一） pH测量
pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过
程控制是一个非常重要的参数。
1,pH的定义
影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对
于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式
上的麻烦
引进 pH=-lg[H+]
[H+]=0.00001时 用 pH5表示
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2,pH测量方法
pH试纸曾经是一种广泛采用的方法
优点：方便，易操作
缺点：它主观性较强
质量差异，不同厂家不同批号的 pH试纸测
出的 pH值会有较大的差别，有时甚至达 0.5~1。
对于一些要求较高的场合就适用
pH试纸
pH电极
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（ 1） pH电极测量原理 pH电极实际上是由参比电极与指示
电极组成的一个自发电池，该电池
的表达式可写为：
参比电极 溶液 X 指示电极
该电池的参比电极的输出电位恒定，
指示电极的输出电位随被测体系中
氢离子活度而变化。因此整个自发
电池的电动势就是被测体系中氢离
子活度的函数。
E[α]=E0- ln1/ =E0-2.303 pH
F
RT aH?
F
RT
式中 E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从
电位差计的 E值可测出 pH值。
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甘汞电极（ a） 232型（ b） 217型
1－导线； 2－加液口； 3-KCl溶液； 4－素烧瓷芯； 5－铂丝； 6－
Hg； 7－ Hg2Cl2
一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小
玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端
有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘
汞不会漏失，小管和大管之间充满 KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入
到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。
?
参
比
电
极
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由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐 ——
氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半
电池可表示为 Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产
生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：
2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-
其电极电位为
εCl/HgCl,Hg=ε + ln1/α0,/ HgHgClCl
F
RT
?Cl
由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活
度有关而不受被测溶液的酸碱度影响
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（ 2）指示电极
对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变
化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的
电极都可用来测定溶液的 pH。
?离子选择性电极的结构
离子选择性电极的结构
其中敏感性膜部分随组成
材料的不同而各有特色。
测定 pH值的玻璃电极的
敏感膜是厚度为 10－ 1～
10－ 3mm的玻璃薄膜，其
电阻为 50～ 500mΩ。
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指示电极的关键是敏感膜
H+ H+
H+ H+ H+ H+
KCl溶液
待测溶液
浓度差引起电位差 —— 浓差电极
玻璃敏感膜
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（ 3）膜电位
膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可
看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在
水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并
且其中的一价阳离子（如 Na+离子）与水中 H+离子
发生离子交换反应。
SiO-Na++H+ SiO-H++Na+
使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，
厚度约为 10-4~10-5mm
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液
试
水
合
硅
胶
层
干
玻
璃
层
水
合
硅
胶
层
内
参
比
溶
液
α1 α1’ α2 ’ α2
ε1— --△ ε--— ε2
以 α1,α2分别表示试液
内与内参比溶液中 H+离
子活度,α1’,α2’分别表
示外侧与内侧硅胶层表
面 H+离子活度，
由于水合硅胶层表面与
内（内参比溶液）、外
（试液）溶液中的 H+离
子从活度大的一方向小
的一方迁移，使玻璃膜
的外、内侧分别产生相
界电位 ε1和 ε2。
经水浸泡
后的玻璃
膜截面成
为三层结
构，如图,
则有：
外侧, ε1=K1+ '
1
1
?
?Ln
F
RT
内侧,ε2=K2+
'
2
2
?
?Ln
F
RT
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可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故
K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质
子占据，故 α1’=α2’，于是玻璃膜内、外侧之间的
电位差
△ ε膜 =ε1-ε2=
2
1
?
?Ln
F
RT
由于内参比溶液的 H+活度 α2一定，故玻璃膜电位
与待测溶液的 H+离子活度（ pH值）成线性关系。
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△ ε膜 =常数 +
?HLnF
RT ?
在 25℃ 下：
△ ε膜 =常数 -0.0591pH（试液）
但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使
α1=α2时，△ ε膜 ≠0，这差别所产生的电位叫不对称电
位（ ε不对称 ），这样整个玻璃电极（指示电极）的电
位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。
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ε玻璃 =ε0 +△ ε膜 +ε不对称
其中,ε0 与 ε不对称 对于特定的电极是恒定的，
故玻璃电极的电极电位与试液 pH值呈线性关系。
（ 4）玻璃电极的性能
?存在不对称电势
不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外
表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、
敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以
用已知 pH值的标准缓冲液来校正
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?零电势或等电势点
电极电位为零时的溶液 pH值称为零电势 pH值，
该值取决于内参比溶液的 pH值。含有 0.025mol/l
的 KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势
点为 pH=7，在 pH<7和 pH>7时，玻璃电极的极性
发生改变。
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?玻璃电极的测量范围
玻璃电极的实际转换系数并不是在整个 pH
范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，
实际的 pH响应曲线如图
测量值
pH
在碱性范围内 pH>10 k降低，测量值偏高
在酸性范围内 pH<1 k升高，测量值偏低 …
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（ 5）玻璃电极的使用限制
?对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻
璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉
浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中
常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。
?强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟
酸溶液会破坏电极
?脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合
硅胶层
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（ 6）复合电极
将两支电极都装在
一根玻璃管中，这
种电极叫复合电极，
工业上在线检测大
都使用这种电极。
它结构紧凑，便于
安装。
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pH复合电极的结构
屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电
极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜 被测
体系 玻璃敏感膜 内参比电极之间达到电
导通，组成原电池，其原理与双电极 pH计的工
作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。
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（二） 敏化离子选择性电极
以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或
生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫
作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电
极等。
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气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极
在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透
气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间
溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被
测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压
相等。
进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中
间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发
生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接
表征被测气体含量的目的。
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能用气敏电极测定气体有 CO2,NH3,SO2、
NO2,H2S,HCN,HF,Cl2,Br2,I2的蒸气
等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。
1,NH4＋ 的测量
氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离
子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：
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1－电极管； 2－透气膜； 3－
0.1mol/LNH4Cl溶液； 4－ pH玻
璃电极； 5－ Ag/AgCl参比电极；
6,7－玻璃膜； 8－可卸电极头；
9－内参比溶液,10－内参比电
极
在电极管内装有玻璃
电极 —— Ag-AgCl电
极，底部装有一微孔
透气膜，玻璃电极的
敏感膜紧贴于透气膜
上，中间有一极薄的
液层，当氨通过透气
膜渗入内充液薄层，
即发生如下反应
NH3+H2O=NH4++OH-
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内充液中 NH4+远大于生成的 NH4+，故其变化
可以忽略不计，而薄层的 pH则由于 OH-的生
成而升高，因此由玻璃电极检出 OH-的浓度，
即可检出 NH3的浓度，电极电位与氨的浓度
是对数响应。
透气膜一般是 0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，
内充液为 0,1mol/L的 NH4Cl溶液。氨电极使
用的上限为 1mol/L,下限为 10-6mol/L。
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2,CO2的测量
（ 1） CO2电极（测溶液中的 CO2）
结构与氨电极类似。测量 CO2时，气体透
过电极膜,CO2和水反应，达到以下平衡：
CO2+H2O HCO3-+H+
产生的氢离子引起 pH的变化，就可以测出溶解
CO2的浓度。如果 CO2扩散在水或 NaHCO3的水
溶液中，它们的 pH值会依据下列的式子而变化：
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在纯水中 pH=常数＋ lg
2COp
在 NaHCO3溶液中 pH=常数 -lgpCO2
在 NaHCO3溶液中测量能方便地确定 pH和 pCO2
之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它
能够使 CO2扩散到 NaHCO3溶液中去，溶液中
pH变化就是 CO2实际分压的测量值
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(2)尾气 CO2的测量
常用的尾气测定仪是 不分光红外线二氧化碳测定
仪（简称 IR）,其精度高，可达 ± 0.5%，量程
的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞
培养时常被采用。
不分光红外线 CO2气体分析原理是：除了单原子
气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如
氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段
（即微米级）具有不同的红外吸收光谱,CO2的
红外吸收峰在 2.6~2.9μm和 4.1~4.5μm之间有两
个吸收峰，根据吸收峰值可以求出 CO2的所含浓
度。
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（ 3）尾气氧的仪器分析
采用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化
率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几
乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧
分析仪，就可测出排气氧的含量。
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通过 RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的
基质 —— 氧化型的或还原型的，分析微生物生长
阶段，分析补料的速率是否合理
例如，储炬等发现 RQ的变化与菌体生长、营养状况
以及产生抗生素密切相关。如 20h菌丝开始发生膨大，
而此时 RQ达到峰值开始下降； 40h左右 RQ降至谷底
开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于
RQ具有以上的关联特性，他们尝试在 avemectin发
酵过程中利用 RQ作为补料控制的参考之一。
3、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
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酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表
面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应
产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。
例如脲酶电极，把脲酶固定在 NH3气敏电极或 CO2
气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生
如下的分解反应：
CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2
通过 NH3或 CO2气敏电极测定 NH3或 CO2的分压
即可达到间接测定尿素的目的。
4、酶电极
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（三） 溶氧的测定
对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解
发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发
酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分
为极谱型和原电池型。
极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影
响小
原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受
气流和气泡影响大。
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现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用 极
谱型的复膜氧电极。
复膜氧电极可分为
敞口式
封闭式
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敞口式 在电极的玻璃管上有一个小孔，使
玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极
玻璃管内外压力相等，有利于保护电极
封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌
时玻璃管受压大
现在使用的大多数是敞口式电极
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1、复膜氧电极的工作原理
阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、
铝等组成 。当给电极施加极谱电压（ 0.6~0.8V负
电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生
的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电
流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度
与饱和电流成正比关系。
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在阴极表面发生的电极反应：
1/2O2+H2O+e- 2OH-
阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴
极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转
变成电信号。氧浓度越高，电流越大。
阳极上的反应是：
Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-
化学信号转变成电信号
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2、电极的构造
在阴极银（铂）
片的前面包一张
半透膜，氧可以
透过半透膜达到
阴极上进行电极
反应。该半透膜
固定在阴极表面。
小孔用于压力补
偿。
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3、溶氧电极的影响因素
（ 1）电极的灵敏度
电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当
膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输
出的稳态有以下对应式：
IS=NFA(pm/dm)pO2
式中 IS—— 电极电流
N—— 电子数
F—— 法拉第常数
A—— 阴极表面积
Pm—— 氧在复膜中的穿透系数
PO2—— 被测溶液中的氧分压
dm—— 膜的厚度
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增加灵敏度因素：
?增加膜穿透系数 pm
?减小膜厚度 dm
?增加阴极表面积 A
扩散速度 因为电极表面的氧浓度与液
体主流中的氧浓度存在浓度梯度
搅拌速度、通气量和培养液粘度
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（ 2）温度的影响
电极还会受温度的影响
?氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降
?温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增
加，增加了电化学反应速率。
由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，
电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补
偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。
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4、电极的标定
一般测定中应进行以下二点标定
（ 1）零点标定
用饱和 Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入
该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降
稳定后，调节零点旋钮显示零值。
（ 2）饱和校正（满刻度）
进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电
极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上
可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至
100%即为饱和值。
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5.摄氧率 r的测定
(1)用溶氧电极测定 r
要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。
测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表
的溶氧浓度：
残饱 － ii
C *
I饱 —— 在饱和氧浓度 C*时的电流值
I残 —— 氧浓度为零时电极所具有的电流
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若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持
搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由
于耗氧,CL下降，仪表上电流值也不断下降。
R= (-△ i/△ t)
残饱 － ii
C *
△ t—— 停止供气后 CL下降到最低点
时所需时间
△ i—— 在△ t时间内的电流变化
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(2)用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它
气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全
取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，
可以算出摄氧率
设进口氧含量为 21%
r=每小时通气量 × （ 0.21-出口氧 %）
*22.4× 1000*V
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6、氧传递系数 kLa的测定
设备的 KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它
是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发
酵过程中的 KLa值。其它测定方法有
(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定
在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示
此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)
式中 C*可以查得,CL可以用溶氧电极测得,r
也可算出，因此可求得 KLa值
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例,一装料为 7L的发酵罐，通气量 1l/L.m，操
作压力为 0.3Kg/cm2，在某发酵时间内发酵液
的溶氧浓度为饱和氧浓度的 25%，空气进入时
的氧含量为 21%，废气排出时的氧含量为
19.8%（ 1atm时氧饱和浓度 C*=0.2mmol/L）求
此时菌的摄氧率
r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7
KLa＝ r/0.26(0.21.0.198)
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(2)单用溶氧仪测定
用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和
需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止
通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。
由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一
段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢
复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线
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△ CL/△ t=KLa(C*-CL)-r
CL=-1/KLa(△ CL/△ t+r)+C*
将 CL对△ CL/△ t+r作图，得到一条直线，斜率
为 -1/KLa因此可求得 KLa,延长直线与纵坐标相
交点为 C*
溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取
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二 参数的离线检测进展
（一） 利用高效液相（ HPLC）分析代谢中间产
物
通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生
物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有
的放矢的控制发酵过程
发酵过程控制
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例,鸟苷生产
在鸟苷发酵中，发
现发酵到 40小时后
鸟苷合成速率下降，
但糖耗速率并未下
降，而且由于耗糖,
使发酵过程 pH下降，
补入氨水增多。那
么糖耗到哪里去了
呢？
于是进行以下一些
测定与分析
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什么因素导致 pH下降？
1、有机酸的积累
有机酸积累 pH下降 补加氨水
在正常代谢情况下，细胞通过 EMP途径和 TCA循
环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细
胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸
的积累
若发酵后期有机酸积累会引起加入的 [NH4+]积累，
相应出现产苷速率下降。 —— 代谢不正常
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测定以下中间物
发酵后期丙酮酸积累
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2、氨基酸的积累
在有机酸分析的基础上进一步通过 HPLC
测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，
结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有
机酸和 [NH4+]积累。
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氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度
比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程
的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在 8小时之前
已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在
48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液
中积累量达到初始量的 12.6倍之多，其它十余种
氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中
都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能
是导致代谢流迁移所致。
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3、分析原因
发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨
酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以
推断由于 EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的
积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸
丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（ GS）造成反馈
抑制和阻遏，使产苷速率降低。
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丙酮酸积累 氨水补加增加
[NH4+]积累 抑制 GS
抑制 TCA循环 丙酮酸积累
激活磷酸果糖激酶 EMP流量增加
恶性循环
丙氨酸
积累
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（二） 代谢流迁移的酶学证明
糖代谢途径关键酶
糖酵解途径（ EMP）
在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：
磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶
磷酸果糖激酶的时序分析
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12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，
所以 PFK的活力相对较低。 24小时后随着发酵过程进
入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活
力也基本保持平稳。但是到 40小时以后，鸟苷形成速
率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，
PFK相对酶活增加，这表明此时通过 EMP途径的糖代
谢通量已有了明显的增加。
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丙酮酸激酶时序分析
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丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在
24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定
的水平，这表明在糖代谢时 EMP途径代谢流增加
中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流
迁移的主要因素
磷酸戊糖途径（ HMP）关键酶
磷酸戊糖途径中主要的限速酶是 6－磷酸葡萄糖脱
氢酶，该酶催化 6－磷酸葡萄糖脱氢生成 6－磷酸葡
萄糖酸内酯 。
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6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析
由图可以看到，早期 6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，
这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过 HMP途径
合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，
从而保持 EMP和 HMP途径通量的平衡，此时稳定持续
的形成产物；但是到 40小时后,6－磷酸葡萄糖脱氢
酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过
程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖
代谢在 HMP途径通量下降而 EMP途径通量增加。
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三羧酸 (TCA)循环的关键酶
三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧
酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的
关键酶为 柠檬酸合成酶,其催化乙酰辅酶 A
与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环
的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制
点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸
循环中的第一个限速步骤。
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柠檬酸合成酶时序分析
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从图可以看到,TCA循环的关键酶柠檬酸合成
酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率
下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明
在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时,TCA
循环的通量并没有发生明显的增加。即 代谢流
迁移发生在 EMP和 HMP之间，主要是由
于 EMP和 HMP途径之间的分配平衡被打
破 所造成的。 EMP途径代谢流的增加造成了一
种代谢流的溢流现象。
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丙氨酸脱氢酶的时序分析
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在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明
显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成
丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的
时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢
流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节
点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓
解了 EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。
结果加入 EMP途径的抑制剂，克服了代谢流
迁移的问题，提高了鸟苷的产量
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（三）与产物合成相关的酶和中间物
测定
例,螺旋霉素生物合成的代谢研究
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图 3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径
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0
50
100
150
200
250
300
350
0 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间 ( h )
峰面积
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
峰面积
F O - Ⅰ
F O - Ⅱ
N S P - Ⅰ
N S P - Ⅱ
SP- Ⅰ
SP- Ⅱ
SP- Ⅲ
图 1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图
哪
个
代
谢
中
间
物
过
多
积
累
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在发酵后期有 FO-Ⅱ 积累, 要减少 FO-Ⅰ 转化为
FO-Ⅱ 必须降低 C3酰化酶的活力, 但这与 SPⅡ,
SPⅢ 合成有矛盾
在发酵结束时,SP-Ⅰ 还有一定的积累，如能最大
限度的转化为 SP-Ⅱ, SP-Ⅲ,即加强步骤 3对发酵
效率和发酵效价是有积极意义的。而 FO-Ⅱ, NSP-
Ⅱ 的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最
终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤 4的通
量。但由于这几个步骤的转化都是由 C3酰化酶催化
反应，这给改变通量带来一定的困难。
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0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间（h）
质量浓度（g/L）
乙酸
丁酸
图 2 有机酸前体的动态流量分布图
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在图 2中，乙酸和丁酸在从 40小时开始积累
并在 64小时达到最高值，对照图 3螺旋霉素
生物合成代谢网络途径 [9]，我们可以推测在
发酵中前期在图 3中的步骤 1也即大环成环步
骤有一定程度的, 瓶颈, 影响，从而导致乙
酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤
的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺
旋霉素的效价。
我们测定了内酯环合成相关的酶活 —— 前体
的活化
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酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
测定酶活并建立酶活趋势曲线 。
分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,
但 出现的时间相差很大 。
酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期
酰基 CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后
期 。 此外, 酰基 CoA合成酶的活性远小于酰基激酶
的活性 。
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图 1 酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
酰基激酶 酰基 CoA
合成酶
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酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其
参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，
且与酰基 CoA合成酶的第一个活力峰出现时间相
一致，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要
作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基 CoA合成
酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主
要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测
其可能是大环合成的, 瓶颈,,如果提高其活性，
就有可能大幅度提高发酵效价。
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采取措施：寻找酶的激活剂
添加 ZnSO4,MnCl2,CoCl2,CuSO4等无机盐,
研究了 Zn2+,Mn2+,Co2+,Cu2+等二价阳离子对
两种酶的影响 。
体外各阳离子对酶活性影响, 确定了各阳离子
对两种酶的最佳添加浓度 （ 表 1） 。
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0
200
400
600
800
1000
1200
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响
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0
20
40
60
80
100
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 3 二价阳离子对酰基 CoA合成酶活性的影响
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在最佳浓度下, 各离子对两种酶的影响程度
如图 2,3所示 。 对于酰基激酶, Co2+,Mn2+、
Zn2+离子都有明显的激活作用；而 Cu2+则几
乎完全抑制了激酶 。 对于酰基 CoA合成酶,
Cu2+却有很强的激活作用； Co2+,Mn2+有较高
的激活作用；而 Zn2+的作用不明显 。
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摇瓶发酵
根据酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势曲线,
分别在发酵 0h和 48h添加上述最佳浓度的离子,
测定螺旋霉素的平均发酵效价 （ 表 2） 。
表 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响
0h 48h
Control Mn2+ Co2+ Mn2+ Co2+ Cu2+
1# 2571 2612 2806 2498 3024 2956
2# 2606 3350 3224 2814 3498 3822
Average 2589 2981 3015 2656 3261 3389
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代谢过程检测的新进展 —— 转录谱
基因芯片 —— 微阵列检测 RNA含量
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思考题
1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？
2,pH电极的指示电极能测定 pH值的原理是什么？
3,pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪
些问题？
4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？
5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？
6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原
理是什么？
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第三节 微生物培养过程的参数检测
在线检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）
放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控
制提供依据 。
黑箱 灰箱?? ?? 参数检测
检测仪器：气相色谱、高效液相、离子色谱、
双向电泳、毛细管电泳、红外光谱、基因测序仪等
检测代谢中间物，分析代谢流向,RNA检测
一 参数在线检测
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由于微生物培养过程是纯培养过程，无菌要求高，
因此对传感器有特殊要求：
? 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌
（材料、数据）
? 传感器结构不能存在灭菌不透的死角，以防染
菌（密封性好）
? 传感器对测量参数要敏感，且能转换成电信号。
（响应快、灵敏）
? 传感器性能要稳定，受气泡影响小。
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带计算机数据采集与控制的生物反应系统
P188
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原理：化学或物理信号 电信号
放大 记录显示仪
控制器（与设定参数比较）
发出调节信号 控制器动作
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介绍几种常用的在线检测的传感器及其工作原理
?pH电极
?溶氧电极
它们是基础电极，以它们为基础可以制作各
种离子电极和酶电极
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（一） pH测量
pH值的测量在生物反应中普遍进行，对于生物过
程控制是一个非常重要的参数。
1,pH的定义
影响化学平衡的往往是活度，而不是浓度，但对
于稀溶液为了避免在氢离子活度很小时表达方式
上的麻烦
引进 pH=-lg[H+]
[H+]=0.00001时 用 pH5表示
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2,pH测量方法
pH试纸曾经是一种广泛采用的方法
优点：方便，易操作
缺点：它主观性较强
质量差异，不同厂家不同批号的 pH试纸测
出的 pH值会有较大的差别，有时甚至达 0.5~1。
对于一些要求较高的场合就适用
pH试纸
pH电极
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（ 1） pH电极测量原理 pH电极实际上是由参比电极与指示
电极组成的一个自发电池，该电池
的表达式可写为：
参比电极 溶液 X 指示电极
该电池的参比电极的输出电位恒定，
指示电极的输出电位随被测体系中
氢离子活度而变化。因此整个自发
电池的电动势就是被测体系中氢离
子活度的函数。
E[α]=E0- ln1/ =E0-2.303 pH
F
RT aH?
F
RT
式中 E0对某一给定电极为常数，是温度的函数，因此从
电位差计的 E值可测出 pH值。
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甘汞电极（ a） 232型（ b） 217型
1－导线； 2－加液口； 3-KCl溶液； 4－素烧瓷芯； 5－铂丝； 6－
Hg； 7－ Hg2Cl2
一般的参比电极是甘汞电极。电极的外壳是玻璃管，里面套一根小
玻璃管，其顶部伸出电极引线，引线的下端浸没在汞中，汞的下端
有糊状甘汞，汞和甘汞用棉花堵住，只有离子才能通过，而汞和甘
汞不会漏失，小管和大管之间充满 KCl溶液，末端用多孔陶瓷渗入
到溶液中，实现电极引线与溶液间的电导通。
?
参
比
电
极
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由此可见，甘汞电极是由金属汞及其难溶盐 ——
氯化亚汞以及含氯离子的电解质溶液组成。这种半
电池可表示为 Hg(L) Hg2Cl2(S) Cl-(L) 电极电位产
生于汞和甘汞的界面，其电极反应为：
2Cl-+2Hg Hg2Cl2+2e-
其电极电位为
εCl/HgCl,Hg=ε + ln1/α0,/ HgHgClCl
F
RT
?Cl
由此可见甘汞电极的电极电位只与氯化钾的活
度有关而不受被测溶液的酸碱度影响
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（ 2）指示电极
对指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变
化而变化。原则上讲，任何与氢离子可逆反应的
电极都可用来测定溶液的 pH。
?离子选择性电极的结构
离子选择性电极的结构
其中敏感性膜部分随组成
材料的不同而各有特色。
测定 pH值的玻璃电极的
敏感膜是厚度为 10－ 1～
10－ 3mm的玻璃薄膜，其
电阻为 50～ 500mΩ。
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指示电极的关键是敏感膜
H+ H+
H+ H+ H+ H+
KCl溶液
待测溶液
浓度差引起电位差 —— 浓差电极
玻璃敏感膜
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（ 3）膜电位
膜电位是由于膜两侧离子活度的差异而产生，故可
看作是一种浓差电位。玻璃电极在使用前必须先在
水中浸泡一段时间，玻璃膜表面吸收水分溶解，并
且其中的一价阳离子（如 Na+离子）与水中 H+离子
发生离子交换反应。
SiO-Na++H+ SiO-H++Na+
使膜表面形成以 SiO-H+为主要成分的水合硅胶层，
厚度约为 10-4~10-5mm
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液
试
水
合
硅
胶
层
干
玻
璃
层
水
合
硅
胶
层
内
参
比
溶
液
α1 α1’ α2 ’ α2
ε1— --△ ε--— ε2
以 α1,α2分别表示试液
内与内参比溶液中 H+离
子活度,α1’,α2’分别表
示外侧与内侧硅胶层表
面 H+离子活度，
由于水合硅胶层表面与
内（内参比溶液）、外
（试液）溶液中的 H+离
子从活度大的一方向小
的一方迁移，使玻璃膜
的外、内侧分别产生相
界电位 ε1和 ε2。
经水浸泡
后的玻璃
膜截面成
为三层结
构，如图,
则有：
外侧, ε1=K1+ '
1
1
?
?Ln
F
RT
内侧,ε2=K2+
'
2
2
?
?Ln
F
RT
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可以认为，玻璃膜两侧表面性状基本相同，故
K1=K2，水合硅胶层表面一价阳离子点已基本被质
子占据，故 α1’=α2’，于是玻璃膜内、外侧之间的
电位差
△ ε膜 =ε1-ε2=
2
1
?
?Ln
F
RT
由于内参比溶液的 H+活度 α2一定，故玻璃膜电位
与待测溶液的 H+离子活度（ pH值）成线性关系。
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△ ε膜 =常数 +
?HLnF
RT ?
在 25℃ 下：
△ ε膜 =常数 -0.0591pH（试液）
但实际上玻璃膜内外侧表面性状总有微小差别，即使
α1=α2时，△ ε膜 ≠0，这差别所产生的电位叫不对称电
位（ ε不对称 ），这样整个玻璃电极（指示电极）的电
位应是内参比电位、膜电位与不对称电位之和。
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ε玻璃 =ε0 +△ ε膜 +ε不对称
其中,ε0 与 ε不对称 对于特定的电极是恒定的，
故玻璃电极的电极电位与试液 pH值呈线性关系。
（ 4）玻璃电极的性能
?存在不对称电势
不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分，由于膜内外
表面状态不完全一样引起的，它与温度、玻璃组成、
敏感膜厚度及加工状况等因素有关。不对称电势可以
用已知 pH值的标准缓冲液来校正
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?零电势或等电势点
电极电位为零时的溶液 pH值称为零电势 pH值，
该值取决于内参比溶液的 pH值。含有 0.025mol/l
的 KCl和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势
点为 pH=7，在 pH<7和 pH>7时，玻璃电极的极性
发生改变。
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?玻璃电极的测量范围
玻璃电极的实际转换系数并不是在整个 pH
范围都是常数，因而响应曲线会偏离直线，
实际的 pH响应曲线如图
测量值
pH
在碱性范围内 pH>10 k降低，测量值偏高
在酸性范围内 pH<1 k升高，测量值偏低 …
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（ 5）玻璃电极的使用限制
?对于蛋白质等粘度较大的测量体系，容易在玻
璃电极敏感膜上产生沉积，应设法缩短电极的沉
浸时间或设法对电极表面进行清洗，工业测试中
常用特制毛刷或超声波清洗电极表面。
?强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液，如氢氟
酸溶液会破坏电极
?脱水性介质，如无水乙醇、浓硫酸会破坏水合
硅胶层
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（ 6）复合电极
将两支电极都装在
一根玻璃管中，这
种电极叫复合电极，
工业上在线检测大
都使用这种电极。
它结构紧凑，便于
安装。
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pH复合电极的结构
屏蔽引线用于减少噪声（电磁波、感应）。当电
极插入被测溶液中后，参比电极 隔膜 被测
体系 玻璃敏感膜 内参比电极之间达到电
导通，组成原电池，其原理与双电极 pH计的工
作原理完全相同，只是结构更紧凑，使用更方便。
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（二） 敏化离子选择性电极
以离子选择性电极为基础电极，通过化学反应或
生化反应使离子选择性电极的响应得到敏化，叫
作敏化离子选择性电极。包括有气敏电极和酶电
极等。
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气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极
在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透
气膜，在透气膜和这种离子选择性电极之间充以中间
溶液，透气膜不允许溶液中的离子通过，而只允许被
测定的气体通过，直到透气膜内外两边该气体的分压
相等。
进入透气膜的气体与中间溶液起反应，从而使中
间溶液中的某一被离子选择性电极响应的物质的量发
生变化，并通过选择性电极电位反映出来，达到间接
表征被测气体含量的目的。
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能用气敏电极测定气体有 CO2,NH3,SO2、
NO2,H2S,HCN,HF,Cl2,Br2,I2的蒸气
等，其中以氨电极比较成熟，应用较广。
1,NH4＋ 的测量
氨是酶反应中最常见的产物和反应物，氨离
子可用氨气敏电极来测定。常用的氨电极为：
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1－电极管； 2－透气膜； 3－
0.1mol/LNH4Cl溶液； 4－ pH玻
璃电极； 5－ Ag/AgCl参比电极；
6,7－玻璃膜； 8－可卸电极头；
9－内参比溶液,10－内参比电
极
在电极管内装有玻璃
电极 —— Ag-AgCl电
极，底部装有一微孔
透气膜，玻璃电极的
敏感膜紧贴于透气膜
上，中间有一极薄的
液层，当氨通过透气
膜渗入内充液薄层，
即发生如下反应
NH3+H2O=NH4++OH-
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内充液中 NH4+远大于生成的 NH4+，故其变化
可以忽略不计，而薄层的 pH则由于 OH-的生
成而升高，因此由玻璃电极检出 OH-的浓度，
即可检出 NH3的浓度，电极电位与氨的浓度
是对数响应。
透气膜一般是 0.1mm厚的微孔聚四氟乙烯，
内充液为 0,1mol/L的 NH4Cl溶液。氨电极使
用的上限为 1mol/L,下限为 10-6mol/L。
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2,CO2的测量
（ 1） CO2电极（测溶液中的 CO2）
结构与氨电极类似。测量 CO2时，气体透
过电极膜,CO2和水反应，达到以下平衡：
CO2+H2O HCO3-+H+
产生的氢离子引起 pH的变化，就可以测出溶解
CO2的浓度。如果 CO2扩散在水或 NaHCO3的水
溶液中，它们的 pH值会依据下列的式子而变化：
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在纯水中 pH=常数＋ lg
2COp
在 NaHCO3溶液中 pH=常数 -lgpCO2
在 NaHCO3溶液中测量能方便地确定 pH和 pCO2
之间的对应关系。使用特殊的气体渗透膜，它
能够使 CO2扩散到 NaHCO3溶液中去，溶液中
pH变化就是 CO2实际分压的测量值
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(2)尾气 CO2的测量
常用的尾气测定仪是 不分光红外线二氧化碳测定
仪（简称 IR）,其精度高，可达 ± 0.5%，量程
的线性范围大，虽然仪器价格高，但在生物细胞
培养时常被采用。
不分光红外线 CO2气体分析原理是：除了单原子
气体（如氖、氩等）和无极性的双原子气体（如
氧、氢、氮等）外，几乎所有气体都在红外波段
（即微米级）具有不同的红外吸收光谱,CO2的
红外吸收峰在 2.6~2.9μm和 4.1~4.5μm之间有两
个吸收峰，根据吸收峰值可以求出 CO2的所含浓
度。
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（ 3）尾气氧的仪器分析
采用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性。在磁场中，氧气的磁化
率比其它气体高几百倍，故混合气体的磁化率几
乎完全取决于含氧气的多少。将排气通入热磁氧
分析仪，就可测出排气氧的含量。
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通过 RQ值的测定，可以分析微生物可能利用的
基质 —— 氧化型的或还原型的，分析微生物生长
阶段，分析补料的速率是否合理
例如，储炬等发现 RQ的变化与菌体生长、营养状况
以及产生抗生素密切相关。如 20h菌丝开始发生膨大，
而此时 RQ达到峰值开始下降； 40h左右 RQ降至谷底
开始回升，正是在这段时间产生抗生素启动。由于
RQ具有以上的关联特性，他们尝试在 avemectin发
酵过程中利用 RQ作为补料控制的参考之一。
3、排气氧、排气 CO2和呼吸熵
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酶电极与气敏电极相似，是在离子选择性电极的表
面覆盖一个涂层，把酶固定在涂层内，通过酶反应
产生的物质的测定，可以推算出反应物的量。
例如脲酶电极，把脲酶固定在 NH3气敏电极或 CO2
气敏电极的表面，在脲酶的催化下，尿素可以发生
如下的分解反应：
CO(NH2)2+H2O 2NH3+CO2
通过 NH3或 CO2气敏电极测定 NH3或 CO2的分压
即可达到间接测定尿素的目的。
4、酶电极
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（三） 溶氧的测定
对于好氧微生物来说氧的供应十分重要，了解
发酵过程中溶氧情况是发酵控制的关键方面。现在发
酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定。溶氧电极可分
为极谱型和原电池型。
极谱型 需极化电压及放大器，耗氧少，受气流影
响小
原电池型 简单便宜，适于中小罐。耗氧较大，受
气流和气泡影响大。
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现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用 极
谱型的复膜氧电极。
复膜氧电极可分为
敞口式
封闭式
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敞口式 在电极的玻璃管上有一个小孔，使
玻璃管与环境相通，这样在蒸汽灭菌时电极
玻璃管内外压力相等，有利于保护电极
封闭式的电极玻璃管上没有小孔，蒸汽灭菌
时玻璃管受压大
现在使用的大多数是敞口式电极
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1、复膜氧电极的工作原理
阴极由铂、银、金等贵金属组成，阳极由铅、锡、
铝等组成 。当给电极施加极谱电压（ 0.6~0.8V负
电压）时，溶液中的氧就在阴极被还原。当产生
的电流与溶液中氧含量成正比时，此时的电极电
流为饱和电流，此时的电压为极谱电压。氧浓度
与饱和电流成正比关系。
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在阴极表面发生的电极反应：
1/2O2+H2O+e- 2OH-
阴极上失去电子后，阳极反应产生的电子流向阴
极，于是在二电极之间形成电流，将氧的信号转
变成电信号。氧浓度越高，电流越大。
阳极上的反应是：
Pb+2ACO- Pb(ACO)2+2e-
化学信号转变成电信号
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2、电极的构造
在阴极银（铂）
片的前面包一张
半透膜，氧可以
透过半透膜达到
阴极上进行电极
反应。该半透膜
固定在阴极表面。
小孔用于压力补
偿。
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3、溶氧电极的影响因素
（ 1）电极的灵敏度
电极的阴极表面覆盖了半透膜之后，在一定条件下当
膜成为氧扩散的控制因素时，氧分压的变化与电流输
出的稳态有以下对应式：
IS=NFA(pm/dm)pO2
式中 IS—— 电极电流
N—— 电子数
F—— 法拉第常数
A—— 阴极表面积
Pm—— 氧在复膜中的穿透系数
PO2—— 被测溶液中的氧分压
dm—— 膜的厚度
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增加灵敏度因素：
?增加膜穿透系数 pm
?减小膜厚度 dm
?增加阴极表面积 A
扩散速度 因为电极表面的氧浓度与液
体主流中的氧浓度存在浓度梯度
搅拌速度、通气量和培养液粘度
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（ 2）温度的影响
电极还会受温度的影响
?氧在溶液中的溶解度随温度上升而下降
?温度上升使膜穿透系数增加，且氧的内相扩散增
加，增加了电化学反应速率。
由于后者影响比较显著，因此随着温度的上升，
电极输出电流呈指数上升。所以电极须有温度补
偿功能，才能真正反映出氧溶解度变化的情况。
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4、电极的标定
一般测定中应进行以下二点标定
（ 1）零点标定
用饱和 Na2SO3作无氧状态的溶液，将氧电极放入
该溶液中，显示仪表上可见溶氧浓度下降，待下降
稳定后，调节零点旋钮显示零值。
（ 2）饱和校正（满刻度）
进行简便测定时，可以采取空气饱和方式。将电
极放入培养液中，通气搅拌一段时间，显示仪上
可见溶氧上升，待上升稳定，调节满刻度旋钮至
100%即为饱和值。
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5.摄氧率 r的测定
(1)用溶氧电极测定 r
要求电极响应时间短，能跟上摄氧率的变化。
测定前先用纯水标定电极，得到单位电流代表
的溶氧浓度：
残饱 － ii
C *
I饱 —— 在饱和氧浓度 C*时的电流值
I残 —— 氧浓度为零时电极所具有的电流
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若测定某培养时间的摄氧率，则关闭通气阀，保持
搅拌，在罐顶通氮气，赶走上面的空气。此时，由
于耗氧,CL下降，仪表上电流值也不断下降。
R= (-△ i/△ t)
残饱 － ii
C *
△ t—— 停止供气后 CL下降到最低点
时所需时间
△ i—— 在△ t时间内的电流变化
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(2)用热磁氧分析仪测定
原理是氧具有高顺磁性，氧气的磁化率比其它
气体高几百倍，故混合气体的磁化率几乎完全
取决于含氧气的多少，根据排气中的氧含量，
可以算出摄氧率
设进口氧含量为 21%
r=每小时通气量 × （ 0.21-出口氧 %）
*22.4× 1000*V
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6、氧传递系数 kLa的测定
设备的 KLa可以用亚硫酸钠法来测定，但它
是在非发酵过程中测定的，不能完全代表发
酵过程中的 KLa值。其它测定方法有
(1)用溶氧电极和热磁氧分析仪共同测定
在发酵过程中如果溶氧浓度恒定在一定值表示
此时供氧和需氧达到平衡，即 r=KLa(C*-CL)
式中 C*可以查得,CL可以用溶氧电极测得,r
也可算出，因此可求得 KLa值
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例,一装料为 7L的发酵罐，通气量 1l/L.m，操
作压力为 0.3Kg/cm2，在某发酵时间内发酵液
的溶氧浓度为饱和氧浓度的 25%，空气进入时
的氧含量为 21%，废气排出时的氧含量为
19.8%（ 1atm时氧饱和浓度 C*=0.2mmol/L）求
此时菌的摄氧率
r=1*7*60/22.4*103*(0.21-0.198)/7
KLa＝ r/0.26(0.21.0.198)
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(2)单用溶氧仪测定
用溶氧仪测定发酵过程的溶氧，开始时供氧和
需氧达到平衡，溶氧是一条水平线。这是停止
通气，保持搅拌，在罐顶通入氮气，赶掉氧气。
由于微生物对氧的利用，溶氧迅速下降，过一
段时间溶氧下降缓慢，待溶氧到最低点后在恢
复通气。这样可以得到溶氧随时间变化的曲线
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△ CL/△ t=KLa(C*-CL)-r
CL=-1/KLa(△ CL/△ t+r)+C*
将 CL对△ CL/△ t+r作图，得到一条直线，斜率
为 -1/KLa因此可求得 KLa,延长直线与纵坐标相
交点为 C*
溶解氧浓度随通气变化的情况 KLa的求取
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二 参数的离线检测进展
（一） 利用高效液相（ HPLC）分析代谢中间产
物
通过中间代谢产物的测定可以深入了解微生
物代谢的流向，依此来分析代谢的情况。从而有
的放矢的控制发酵过程
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例,鸟苷生产
在鸟苷发酵中，发
现发酵到 40小时后
鸟苷合成速率下降，
但糖耗速率并未下
降，而且由于耗糖,
使发酵过程 pH下降，
补入氨水增多。那
么糖耗到哪里去了
呢？
于是进行以下一些
测定与分析
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什么因素导致 pH下降？
1、有机酸的积累
有机酸积累 pH下降 补加氨水
在正常代谢情况下，细胞通过 EMP途径和 TCA循
环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细
胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸
的积累
若发酵后期有机酸积累会引起加入的 [NH4+]积累，
相应出现产苷速率下降。 —— 代谢不正常
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测定以下中间物
发酵后期丙酮酸积累
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2、氨基酸的积累
在有机酸分析的基础上进一步通过 HPLC
测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，
结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有
机酸和 [NH4+]积累。
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氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度
比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程
的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在 8小时之前
已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在
48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液
中积累量达到初始量的 12.6倍之多，其它十余种
氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中
都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能
是导致代谢流迁移所致。
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3、分析原因
发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨
酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以
推断由于 EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的
积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸
丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（ GS）造成反馈
抑制和阻遏，使产苷速率降低。
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丙酮酸积累 氨水补加增加
[NH4+]积累 抑制 GS
抑制 TCA循环 丙酮酸积累
激活磷酸果糖激酶 EMP流量增加
恶性循环
丙氨酸
积累
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（二） 代谢流迁移的酶学证明
糖代谢途径关键酶
糖酵解途径（ EMP）
在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：
磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶
磷酸果糖激酶的时序分析
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12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，
所以 PFK的活力相对较低。 24小时后随着发酵过程进
入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活
力也基本保持平稳。但是到 40小时以后，鸟苷形成速
率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累，
PFK相对酶活增加，这表明此时通过 EMP途径的糖代
谢通量已有了明显的增加。
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丙酮酸激酶时序分析
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丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在
24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定
的水平，这表明在糖代谢时 EMP途径代谢流增加
中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流
迁移的主要因素
磷酸戊糖途径（ HMP）关键酶
磷酸戊糖途径中主要的限速酶是 6－磷酸葡萄糖脱
氢酶，该酶催化 6－磷酸葡萄糖脱氢生成 6－磷酸葡
萄糖酸内酯 。
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6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析
由图可以看到，早期 6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，
这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过 HMP途径
合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，
从而保持 EMP和 HMP途径通量的平衡，此时稳定持续
的形成产物；但是到 40小时后,6－磷酸葡萄糖脱氢
酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过
程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖
代谢在 HMP途径通量下降而 EMP途径通量增加。
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三羧酸 (TCA)循环的关键酶
三羧酸循环是“消耗”丙酮酸的途径，三羧
酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的
关键酶为 柠檬酸合成酶,其催化乙酰辅酶 A
与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环
的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制
点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸
循环中的第一个限速步骤。
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柠檬酸合成酶时序分析
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从图可以看到,TCA循环的关键酶柠檬酸合成
酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率
下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明
在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时,TCA
循环的通量并没有发生明显的增加。即 代谢流
迁移发生在 EMP和 HMP之间，主要是由
于 EMP和 HMP途径之间的分配平衡被打
破 所造成的。 EMP途径代谢流的增加造成了一
种代谢流的溢流现象。
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丙氨酸脱氢酶的时序分析
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在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明
显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成
丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的
时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢
流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节
点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓
解了 EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。
结果加入 EMP途径的抑制剂，克服了代谢流
迁移的问题，提高了鸟苷的产量
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（三）与产物合成相关的酶和中间物
测定
例,螺旋霉素生物合成的代谢研究
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图 3 螺旋霉素生物合成代谢网络途径
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0
50
100
150
200
250
300
350
0 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间 ( h )
峰面积
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
峰面积
F O - Ⅰ
F O - Ⅱ
N S P - Ⅰ
N S P - Ⅱ
SP- Ⅰ
SP- Ⅱ
SP- Ⅲ
图 1 螺旋霉素生物合成中间物动态流量分布图
哪
个
代
谢
中
间
物
过
多
积
累
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在发酵后期有 FO-Ⅱ 积累, 要减少 FO-Ⅰ 转化为
FO-Ⅱ 必须降低 C3酰化酶的活力, 但这与 SPⅡ,
SPⅢ 合成有矛盾
在发酵结束时,SP-Ⅰ 还有一定的积累，如能最大
限度的转化为 SP-Ⅱ, SP-Ⅲ,即加强步骤 3对发酵
效率和发酵效价是有积极意义的。而 FO-Ⅱ, NSP-
Ⅱ 的最终积累则导致流量浪费，因为这两种物质最
终不能转化为目的产物。因此必须减小步骤 4的通
量。但由于这几个步骤的转化都是由 C3酰化酶催化
反应，这给改变通量带来一定的困难。
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0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96
发酵时间（h）
质量浓度（g/L）
乙酸
丁酸
图 2 有机酸前体的动态流量分布图
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在图 2中，乙酸和丁酸在从 40小时开始积累
并在 64小时达到最高值，对照图 3螺旋霉素
生物合成代谢网络途径 [9]，我们可以推测在
发酵中前期在图 3中的步骤 1也即大环成环步
骤有一定程度的, 瓶颈, 影响，从而导致乙
酸、丁酸有一定的积累。若能加强这一步骤
的通量，应能提高代谢网络的通量，提高螺
旋霉素的效价。
我们测定了内酯环合成相关的酶活 —— 前体
的活化
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酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
测定酶活并建立酶活趋势曲线 。
分析：两种酶在发酵过程中都有两个活性高峰期,
但 出现的时间相差很大 。
酰基激酶的活性高峰期主要集中在发酵中前期
酰基 CoA合成酶的活性高峰期主要集中在发酵中后
期 。 此外, 酰基 CoA合成酶的活性远小于酰基激酶
的活性 。
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图 1 酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势
酰基激酶 酰基 CoA
合成酶
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酰基激酶在发酵初期出现一个活性高峰，推测其
参与了初级代谢；后一个活力峰出现在发酵中期，
且与酰基 CoA合成酶的第一个活力峰出现时间相
一致，意味着酰基激酶对次级代谢同样有着重要
作用。在螺旋霉素的生物合成中，酰基 CoA合成
酶的活性主要集中在发酵中后期，推测合成酶主
要参与次级代谢。由于合成酶的活性较小，推测
其可能是大环合成的, 瓶颈,,如果提高其活性，
就有可能大幅度提高发酵效价。
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采取措施：寻找酶的激活剂
添加 ZnSO4,MnCl2,CoCl2,CuSO4等无机盐,
研究了 Zn2+,Mn2+,Co2+,Cu2+等二价阳离子对
两种酶的影响 。
体外各阳离子对酶活性影响, 确定了各阳离子
对两种酶的最佳添加浓度 （ 表 1） 。
发酵过程控制
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0
200
400
600
800
1000
1200
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 2 二价阳离子对酰基激酶活性的影响
发酵过程控制
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0
20
40
60
80
100
Divaledt metal ion
Enzyme activity(u/g)
Control
Co2+
Zn2+
Mn2+
Cu2+
图 3 二价阳离子对酰基 CoA合成酶活性的影响
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在最佳浓度下, 各离子对两种酶的影响程度
如图 2,3所示 。 对于酰基激酶, Co2+,Mn2+、
Zn2+离子都有明显的激活作用；而 Cu2+则几
乎完全抑制了激酶 。 对于酰基 CoA合成酶,
Cu2+却有很强的激活作用； Co2+,Mn2+有较高
的激活作用；而 Zn2+的作用不明显 。
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摇瓶发酵
根据酰基激酶和酰基 CoA合成酶活性趋势曲线,
分别在发酵 0h和 48h添加上述最佳浓度的离子,
测定螺旋霉素的平均发酵效价 （ 表 2） 。
表 2 不同时间添加二价阳离子对螺旋霉素效价的影响
0h 48h
Control Mn2+ Co2+ Mn2+ Co2+ Cu2+
1# 2571 2612 2806 2498 3024 2956
2# 2606 3350 3224 2814 3498 3822
Average 2589 2981 3015 2656 3261 3389
发酵过程控制
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代谢过程检测的新进展 —— 转录谱
基因芯片 —— 微阵列检测 RNA含量
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思考题
1、用于在线检测的传感器必须符合哪些要求？
2,pH电极的指示电极能测定 pH值的原理是什么？
3,pH电极的测量范围有没有限制？使用时应注意哪
些问题？
4、溶氧电极能够测定液体中溶氧浓度的原理是什么？
5、影响溶氧电极测定的灵敏度和准确性的因素有哪些？
6、哪些仪器可以测定尾气氧和尾气二氧化碳？测定原
理是什么？
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