白血病分子生物学
白血病分子生物学
?白血病的分子机制
?白血病的分子检测
?白血病分子检测的临床应用
白血病的分子机制
? 基因 (gene),合成有功能的蛋白质多肽链或 RNA所
必需的全部核酸序列。
? 癌基因 (oncogene),细胞或病毒中存在的，能诱导
正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。
? 癌基因活化的方式,
点突变
染色体重排
基因扩增
? 抑癌基因 (tumor suppressor genes),指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑
制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
?增殖 过度
?分化 阻断
?凋亡 受抑
“二次打击”学说
D.Gary Gilliland Best Practice & Research
Clinical Haematology.2003;16:409-417
白血病的分子检测
? Southern blot
? Northern blot
? Western blot
? FISH
? PCR
?测序
?芯片
白血病的分子检测
? PCR反应原理
N = N0 x (1+E)n
N,扩增子数量
N0,起始模板数量
E,扩增效率
n,循环数
白血病的分子检测
? PCR理论方程
白血病的分子检测
? PCR方法优点
快速
灵敏
特异
? PCR方法缺点
假阳性
假阴性
白血病的分子检测
? PCR,仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（ <2kb）,如 T-ALL中 SIL-TAL1。
? RT-PCR,可用于染色体 断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
?巢式 RT-PCR,可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
? RQ-PCR,可定量扩增产物。
白血病的分子检测
? RQ-PCR（ Real-time Quantitative PCR）
荧光标记扩增产物
荧光标记 引物
特异性荧光标记 探针
TaqMan探针、分子信标、杂交双探针
荧光染料直接结合 扩增产物
SYBR Green I与 DNA双链结合
动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
?特异性高
?多重基因定量
?成本较高
SYBR Green I 法
?成本低
?最适合初步筛查
?熔解曲线功能
?无法多重检测
?无模板特异性
?灵敏度低
白血病的分子检测
? CT值：荧光信号有统计学意义显著增长
（穿过阈值线）时的循环次数
? CT值与起始模板量成反比
白血病的分子检测
RQ-PCR的检测系统,
? 该系统内置了 96孔 PCR仪，且在每个反应孔上
均有一个监测探头用于检测 PCR反应管中的荧
光强度。平均每 8-12秒就检测一次，以达到实
时检测的目的。
? 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系
统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，
并最终得到 CT值。
? 该系统可以根据标准品的 CT值和拷贝数自动绘
制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷
贝数。
白血病的分子检测
? RQ-PCR方法优点,
灵敏而特异
起点定量
闭管化学（污染的风险低）
没有 PCR后处理（无需走胶，拍照等）
高度自动化
定性：单数据点测定
定量：多数据点测定
能做基因分型及 SNP鉴定
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提 DNA或 RNA
用 PCR或 RT-PCR扩增特异片段
将 PCR产物克隆到合适的载体上
纯化，定量和系列稀释质粒 DNA或 RNA
体外转录成 RNA片段（仅用于 RNA样品）
构建标准曲线（ CT υ lgcopy）
样品的定量检测
校正样品基因拷贝数
白血病分子检测的临床应用
白血病的分子生物学检查对白血病诊断分
型及预后判断有以下几方面意义,
?补充 MIC检查的不足
?发现新的亚型
?监测白血病的微小残留病灶（ MRD）
?为研究白血病的发病机制打下基础
白血病分子检测的临床应用
PCR方法检测 MRD常用的分子标志
AML1-ETO
? t(8;21)(q22;q22)
? 6~8%原发性 AML,在 M2中的阳性率为
20~40%，在 M2b中阳性率为 90%
? 少见于 M4和 M1,极少见于 MDS和骨髓增生综
合症
? AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能
力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性
粒细胞，且对化疗反应较敏感
? AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果
好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后
较其他 AML亚型（ M3除外）好
AML1-ETO
?对初发患者进行 t(8;21)和 AML1-ETO融
合基因的检测对其预后判断及治疗方案
的制定相当重要
? AML1-ETO定性结果不能用于评价患者
MRD情况
? RQ-PCR能实时反映体内 AML1-ETO水
平。连续定量 AML1-ETO转录本水平可
判定有高复发风险的患者，以便及早治
疗干预以防血液学复发
AML1- 阴性
ETO+
C-KIT基因突变
? C-KIT为 III型受体酪氨酸激酶家族（还包括 c-
FMS,PDGFRβ和 c-KIT） 成员之一
? AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不
导致白血病发生
? C-KIT突变可见于伴 inv(16)的 M4以及伴 t(8;21)
的 M2患者
? 26/54例 (48.1%) M2b患者中检测到 C-KIT基因
突变
? 57例不伴 t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未
检测到 C-KIT基因突变
? 以上结果提示 C-KIT突变与 M2b密切相关
(R=0.94,P<0.01)
C-KIT基因突变
? C-KIT基因结构
JM
C-KIT基因突变
?外周血白细胞计数
C-KIT基因突变
?生存曲线
PML-RARα
? t(15;17)(q22;q21)
? 98%M3患者
? 继 t(15;17)之后，又先后发现 4种 M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位,t(11;17)(q23;q21)，
t(5;17)(q35;q21),t(11;17)(q13;q21)以及
dup(17)(q21.3;q23),分别产生 PLZF-RARα，
NPM-RARα,NuMA-RARα和 STAT5b-RARα融
合基因
? 临床上，具有 PLZF-RARα或 STAT5b-RARα融
合基因患者对 ATRA治疗不敏感，其余三种染
色体易位患者经 ATRA治疗可获完全缓解
PML-RARα
APL累及的 RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
?由于 PML基因断裂点 不同产生 3种不同的
PML-RARα异构体
?约 55%的 M3患者为 L型,40%为 S型，
5%为 V型，且每位患者只表达一种 PML-
RARα融合蛋白
?形态学上 S型白血病细胞常为低分化的并
且这些患者可见继发细胞遗传学异常,V
型 APL患者的白血病细胞体外对 ATRA
的敏感度低
PML-RARα
? RT-PCR检测 PML-RARα是敏感且特异的
APL诊断方法，还能用于治疗后 MRD监
测。 PML-RARα阳性提示的分子复发常
早于临床复发 3-6个月，为临床采取进一
步治疗措施提供了保障
? RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、
缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，
在 MRD监测中比 RT-PCR具有更高价值
L+ 阴性 S+
FLT3基因突变
? Fms-related tyrosine kinase 3
? FLT3为 III型受体酪氨酸激酶家族（还包括 c-
FMS,PDGFRβ和 c-KIT） 成员之一，该类受
体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发
挥重要调控作用
? 综合国外各研究报道,FLT3-ITD和 D835突变
在 AML中阳性率分别为 24%(385/1585)和
7%(30/429)，总阳性率超过 30%，使其成为
AML中最普遍发生突变的靶基因
? 许多临床研究发现,FLT3突变还与临床预后
密切相关，尤对 60岁以下的 AML患者,FLT3
突变患者预后较差，且可独立于核型之外
FLT3基因突变
FLT3基因突变
? FLT3基因主要突变类型
FLT3基因突变
? mut-FLT3信号通路
FLT3基因突变
?外周血白细胞计数
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FLT3-ITD- FLT3-ITD+
A
P
L
患者初发时外周血W
B
C
计数
(x10
9
)
CBFβ-MYH11
? inv(16)(p13;q22)及 t(16;16)(p13;q22)
?主要见于 M4Eo,10%不伴异常嗜酸细胞
M4,少见于 M2
? CBFβ-MYH11融合蛋白通过干扰核心结
合因子（ core binding factor,CBF） 的
转录激活作用而致病
?具有 CBFβ-MYH11的患者对化疗敏感，
预后较好，故提高检测率尤具临床意义
CBFβ-MYH11
? CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最
常见的为 A型，占 80%
? RT-PCR检测 CBFβ-MYH11进行 MRD监
测显示，大部分患者在完全缓解时 PCR
转阴，但仍有小部分长期存活者 PCR仍
为阳性
?最新研究采用 RQ-PCR检测 CBFβ-
MYH11转录本水平来评价 M4Eo患者
MRD情况，预示复发
NPM基因突变
? Nucleophosmin,为核 -浆穿梭蛋白，调控 p53-
ARF通路
? 见于 ~50%核型正常的 AML患者，而在伴低危 /
高危核型患者中极少见
? 主要见于 M4/M5中
? 第 12号外显子的插入 /缺失
? 伴此突变患者 WBC计数高
? 目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，
尚待进一步证实
DEK-CAN
? t(6;9)(p23;q34)
? 主要见于 M2或 M4，也见于 M1,MDS-RAEB
? 伴 DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较
差
? 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，
调整治疗方案
N-RAS基因突变
? 为 RAS基因家族成员之一，染色体定位于
1p32.2。 具有 GTP/GDP结合和 GTPase活性，
调控正常细胞的生长
? 此基因突变存在于 11-30%AML
? 突变热点位于 codon12,13和 61
? 在 inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，
而在 t(15;17)中低
? 伴此突变患者外周血 WBC计数低
? 该突变预后意义尚不明
WT-1基因高表达
? Wilms tumor 1
?是无特异分子异常的急性白血病患者理
想的 MRD检测指标
?伴此基因高表达者预后差，且表达程度
与预后相关
BCR-ABL
? t(9;22)(q34;q11)
? 15~30%成人 ALL及 3~5%儿童 ALL
? 9号染色体的断裂点与 CML相同，但 22号染色
体断裂点具有异质性
? 此融合蛋白 p190刺激细胞增殖的能力比 p210要
强。在转基因试验中观察到 p190诱发的白血病
具有起病早、发展快和恶性程度高的特点
? BCR-ABL+ALL患者预后差,5年存活率 <20%，
因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗
BCR-ABL
?对于自体或异体移植 ALL患者，移植前
后 BCR-ABL的有无以及 BCR-ABL的转录
本类型与预后有关
e1a2+ 阴性
E2A-PBX1
? t(1;19)(q23;p13)
? 5~6%儿童 ALL和 3%成人 ALL
? 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无
病生存期（ DFS） 仅 6个月,3年 DFS为 20%，
需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后
? 核型和 E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治
疗方案的选择至关重要
? E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实
TEL-AML1
? t(12;21)(p13;q22)
? 25%儿童 ALL,是儿童 ALL中最常见的分子异
常
? 目前为止尚未在 T-ALL,AML或 NHL中发现
t(12;21),在婴儿白血病中极少报道，在成人
白血病患者中频率很低（ <2%）
? 此类患者发病年龄小（ 2岁 ~10岁）,WBC计
数低（ <50 000/L）,免疫表型为前 B-ALL
? 此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预
后好
TEL-AML1
?由于 12p和 21q末端在常规显带中很相似，
因此常规细胞遗传学方法检出率仅 0.05%，
需应用 FISH或 RT-PCR方法提高检测阳
性率
? TEL基因重排是独立预后因素,RT-PCR
检测 TEL-AML1融合基因能将低危险度
与高危险度的 ALL患者区分开来。因此
早期检测 TEL-AML1融合基因对临床预
后，确定合适的治疗方案都有重要意义
MLL相关融合基因
? 累及 MLL基因的分子异常见于 5.2%AML，
22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可
见于治疗相关白血病，尤接受 topoisomerase II
抑制剂治疗的患者
? MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同
的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血
病表型相关。最常见的有,
t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4融合基因 ALL
t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9融合基因 AML
t(11;19)(p13;q23) MLL-ENL融合基因 AML及 ALL
MLL相关融合基因
?至今,MLL相关融合蛋白的致病性还不
清楚，推测其可能具有双重作用,
——融合蛋白可能获得新的功能，促使
细胞转化
——MLL发生断裂后，缺失锌指结构域
的 MLL不能与 DNA结合，失去其转录活
化功能，使受 MLL调节的靶基因（ HOX
基因）表达异常，也影响造血细胞的发
育
MLL-AF4
? t(4;11)(q21;q23)
? t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴
儿 ALL中最多见，为 50~70%，而在儿童和成
人中较低，分别为 2%和 3~6%
? 此类患者发病年龄低（通常 <2岁），白细胞计
数高，常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统
? 此类患者病情凶险，预后差。患者对标准治疗
方案很可能无效，需给予强化治疗。目前应用
高剂量 Ara-C治疗，使这些患者预后有所提高
MLL-AF4
?对 ≤2岁的婴幼儿急性白血病患者应常规
进行 MLL-AF4融合基因的检测以筛选出
高危患者，给予强化治疗提高生存率
? RT-PCR可在所有 t(4;11)患者初发时检测
到 MLL-AF4融合基因。由于该融合基因
累及的 2个基因的断裂点变异性较大，因
此 PCR应包括所有断裂点以免产生假阴
性结果
TAL1基因重排
? t(1;14)(p32;q11),TAL1-TCRδ融合基因
? 3%T-ALL
?易位使 TAL1基因与 TCRδ位点并置，其
5′端正常转录调节被 TCRδ 5′部分所取
代，而后者在 T细胞中有高表达
TAL1基因重排
? 1p32缺失,SIL-TAL1融合基因
? 16~26%T-ALL
? 该重组仅见于 T-ALL，是 T-ALL的一个有用的
克隆标志
? 缺失部分可能为 TAL1基因的调控序列，使
TAL1基因表达失控，导致与染色体易位相似
的表型
? 常规遗传学方法检测不到这一异常，而 SIL-
TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异
的分子标志用于 PCR检测
TAL1基因重排
? TAL1异常仅见于 T-ALL,尚未见于 B-ALL，
AML和 T细胞 NHL,是儿童 T-ALL中最常见非
随机遗传缺陷，是监测大多数 T-ALL的侯选基
因
? 伴 TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数，
高血红蛋白含量，免疫表型为 CD2+/CD10–
? 尽管在治疗反应上，有 TAL1重排患者和无
TAL1重排患者无显著差异，但伴 TAL1重排患
者 4年无事件生存率（ EFS） 高于不伴 TAL1重
排的患者，分别为 59± 11%和 44± 7%，提示
伴 TAL1重排患者预后较好
HOX11基因异常表达
? t(10;14)(q24;q11), t(7;10)(q34;q24)
? 7%的 T-ALL
?易位使 HOX11基因受控于 TCRδ和 TCRβ
基因调控序列，导致其异常 表达
?另有部分 HOX11高表达患者核型正常
?伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，
预后也较其他 T-ALL患者要好，完全缓
解率为 100%，平均无病生存期为 46个月，
3年无病生存率为 75%
HOX11L2基因异常表达
? t(5;14)(q35;q32)
? 20%的儿童 T-ALL
? 易位使 HOX11L2基因处于 CTIP2调控元件的控
制下，而 CTIP2基因在 T淋巴细胞分化时高度
表达
? 在随访患者中检测到高水平 HOX11L2说明白血
病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患
者 HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个
低水平。可见 HOX11L2的表达水平可作为
MRD检测的标志
NOTCH1基因突变
? NOTCH1信号对 CLP(common lymphoid
progenitors)向 T细胞定向以及前 T细胞受体复
合物组装是必须的
? 35-50% T-ALL患者存在此基因突变
? 伴 NOTCH1基因突变的成年 T-ALL患者预后较
差
NOTCH1基因突变
? NOTCH1基因结构
NOTCH1基因突变
?生存曲线
BCR-ABL
? t(9;22)(q34;q11)
? >90% CML患者
? BCR-ABL融合蛋白（ p210） 的酪氨酸蛋白激
酶活性较正常 ABL高，可能是 BCR对 ABL激酶
活性调节区的作用所致
? 由于 <5%CML患者为隐匿性 Ph染色体，因此
无 Ph染色体 CML患者还需使用更灵敏的分子
检测手段如 FISH或 RT-PCR检测 BCR-ABL融
合基因
? RT-PCR还能区分 e1-a2和 b2-a2/b3-a2二种
BCR-ABL转录本，从而区分 ALL患者与 CML
急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不
同的治疗方案
BCR-ABL
?巢式 RT-PCR检测 BCR-ABL融合基因用
于 CML移植患者移植后 MRD监测。可在
患者血液学复发前的 6~24个月骨髓检测
就呈阳性。
? RQ-PCR还能动态观察患者治疗后 BCR-
ABL转录本水平变化情况，反映疗效。
b3a2+ b2a2+ 阴性
GATA2基因突变
? 调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维
持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力
? CML急变患者中新发现 GATA2基因突变,而
CML慢性期、加速期,AML（ M1-M7），
MDS,ALL,CLL,淋巴瘤和骨髓瘤患者，
以及正常对照均未发现该突变，可见 GATA2
基因突变仅与 CML急变相关，是 CML疾病进
展过程中的获得性突变。总发生率为 12.5%
（ 5/40）,且均造成 CML急粒单变
? GATA2基因 突变与 CML患者疾病进展和预后
的关系有待进一步阐明
JAK2基因突变
? Janus kinase 2
?此基因突变主要见于 MPD和 MDS,另可
存在于部分 AML尤 M2
?突变为 V617F
?突变去除了 JAK2 JH2负性调控，导致该
基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优
势
? JAK2可成为靶向治疗的靶点
MDS相关基因异常
? Delta样 (Dlk)基因编码 Dlk蛋白在 MDS明
显增高者 55%，而 AML仅 10%，可能是
MDS特异性基因，但作为诊断 MDS的标
志基因尚待进一步确定
MDS相关基因异常
? RAS
? 此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶
(GTPase)调节细胞生长相关信号
? ras癌基因的活化，尤其是 N-ras的激活可在约
35%的 MDS患者中发生
? FMS
? 为集落刺激因子 1，控制单核 -巨噬细胞生长、
分化及功能
? fms基因的突变可在 16%的 MDS患者中发现
? ras和 fms突变主要见于粒 -单细胞分化的疾病，
即 MDS中的 CMML,患者生存期短，转 AML
多
MDS相关基因异常
? p53
? 在 MDS时,p53突变较少见 (<5%)，但在较为
进展的病例中可高达 15%
? p53突变意味着化疗耐药和生存期缩短，因而
是一种有意义的预后指标
? FLT3
? 10%MDS有 FLT3点突变，加快进展为 AML，
但 FLT3-ITD少见
? AML1(RUNX1)
? 为 MDS较常见的点突变，发生率 25%，导致核
心结合因子 (CBF)亚单位正常功能缺失，易转
化 AML
Ig/TCR基因重排
? Ig/TCR基因重排检测，对决定白血病的细胞来源系列
乃至分化阶段，有重大意义
? 在 B系 ALL中分别有 95%,54%,55%和 33%的患者
有 IgH,TCRδ,TCRγ和 TCRβ基因重排，在 T-ALL中
相应的基因重排率分别为 14%,68%,91%和 89%
? 由于重排的多样性，重排的 Ig和 TCR基因连结区序列
在各淋巴 (前体 )细胞中是不同的，因而每位患者有其
各自特异的 Ig/TCR基因重排序列，这一特定的 Ig/TCR
基因重排序列可作为该恶性克隆的分子标志，在分子
水平进行诊断分型，还可通过 PCR检测缓解期患者有
无初发时的 Ig/TCR基因重排来追踪残余白血病细胞,
用于预后判断
Ig/TCR基因重排
? Ig的基因由 Lκ,Lλ和 H三个基因组组成，分别编码 Lκ
链,Lλ链和 H链。 L和 H基因又由编码 Ig分子的 V区和
C区基因构成。
B细胞分化,
IgH重排 κ重排 IgH/κ表达
IgH重排 λ重排 IgH/λ表达
κ错误重排 /缺失
Ig/TCR基因重排
? TCR由两条肽链组成,αβ链或 γδ链，不论是哪一种肽
链，其胞膜外区均包括两部分，即 V区和 C区。相应的
编码基因为 TCRA,TCRB,TCRG和 TCRD。
T细胞分化,
TCRD重排 TCRG重排 TCRγδ表达
TCRB重排 TCRA重排 TCRαβ表达
TCRD缺失
Ig/TCR基因重排
? Ig/TCR基因多样性的机制
组合造成的多样性
~2x106 Ig,~3x106 TCRαβ,~5x103TCRγδ
连接造成的多样性
>1012 Ig和 TCR
体细胞高频突变造成的多样性
仅限于成熟 B淋巴细胞
Ig/TCR基因重排
V-D-J重排,IgH,TCRB,TCRD
V-J重排,Lκ,Lλ,TCRA,TCRG
Ig/TCR基因重排
谢 谢！
白血病分子生物学
?白血病的分子机制
?白血病的分子检测
?白血病分子检测的临床应用
白血病的分子机制
? 基因 (gene),合成有功能的蛋白质多肽链或 RNA所
必需的全部核酸序列。
? 癌基因 (oncogene),细胞或病毒中存在的，能诱导
正常细胞转化并使之获得新生物特征的基因。
? 癌基因活化的方式,
点突变
染色体重排
基因扩增
? 抑癌基因 (tumor suppressor genes),指一类基因，
其产物对细胞生长增殖起负调控的作用，并能潜在抑
制细胞的恶变。
白血病的分子机制
白血病的分子机制
?增殖 过度
?分化 阻断
?凋亡 受抑
“二次打击”学说
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Clinical Haematology.2003;16:409-417
白血病的分子检测
? Southern blot
? Northern blot
? Western blot
? FISH
? PCR
?测序
?芯片
白血病的分子检测
? PCR反应原理
N = N0 x (1+E)n
N,扩增子数量
N0,起始模板数量
E,扩增效率
n,循环数
白血病的分子检测
? PCR理论方程
白血病的分子检测
? PCR方法优点
快速
灵敏
特异
? PCR方法缺点
假阳性
假阴性
白血病的分子检测
? PCR,仅适用于染色体断裂点丛集于相对小
的范围内（ <2kb）,如 T-ALL中 SIL-TAL1。
? RT-PCR,可用于染色体 断裂点跨越很大的
区域的融合基因。
?巢式 RT-PCR,可显著提高反应的特异性，
增加扩增效率。
? RQ-PCR,可定量扩增产物。
白血病的分子检测
? RQ-PCR（ Real-time Quantitative PCR）
荧光标记扩增产物
荧光标记 引物
特异性荧光标记 探针
TaqMan探针、分子信标、杂交双探针
荧光染料直接结合 扩增产物
SYBR Green I与 DNA双链结合
动态监测荧光信号变化
TaqMan探针法
?特异性高
?多重基因定量
?成本较高
SYBR Green I 法
?成本低
?最适合初步筛查
?熔解曲线功能
?无法多重检测
?无模板特异性
?灵敏度低
白血病的分子检测
? CT值：荧光信号有统计学意义显著增长
（穿过阈值线）时的循环次数
? CT值与起始模板量成反比
白血病的分子检测
RQ-PCR的检测系统,
? 该系统内置了 96孔 PCR仪，且在每个反应孔上
均有一个监测探头用于检测 PCR反应管中的荧
光强度。平均每 8-12秒就检测一次，以达到实
时检测的目的。
? 系统中的电脑系统同时不断地分析来自检测系
统的信息，不断计算每个反应管中的荧光强度，
并最终得到 CT值。
? 该系统可以根据标准品的 CT值和拷贝数自动绘
制标准曲线，并计算未知样品中的目的基因拷
贝数。
白血病的分子检测
? RQ-PCR方法优点,
灵敏而特异
起点定量
闭管化学（污染的风险低）
没有 PCR后处理（无需走胶，拍照等）
高度自动化
定性：单数据点测定
定量：多数据点测定
能做基因分型及 SNP鉴定
RQ-PCR的操作流程
从细胞或组织中抽提 DNA或 RNA
用 PCR或 RT-PCR扩增特异片段
将 PCR产物克隆到合适的载体上
纯化，定量和系列稀释质粒 DNA或 RNA
体外转录成 RNA片段（仅用于 RNA样品）
构建标准曲线（ CT υ lgcopy）
样品的定量检测
校正样品基因拷贝数
白血病分子检测的临床应用
白血病的分子生物学检查对白血病诊断分
型及预后判断有以下几方面意义,
?补充 MIC检查的不足
?发现新的亚型
?监测白血病的微小残留病灶（ MRD）
?为研究白血病的发病机制打下基础
白血病分子检测的临床应用
PCR方法检测 MRD常用的分子标志
AML1-ETO
? t(8;21)(q22;q22)
? 6~8%原发性 AML,在 M2中的阳性率为
20~40%，在 M2b中阳性率为 90%
? 少见于 M4和 M1,极少见于 MDS和骨髓增生综
合症
? AML1-ETO+白血病细胞有一定程度的分化能
力，能分化至较成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性
粒细胞，且对化疗反应较敏感
? AML1-ETO+患者对大剂量阿糖胞苷治疗效果
好，具有较高的缓解率，无病生存期长，预后
较其他 AML亚型（ M3除外）好
AML1-ETO
?对初发患者进行 t(8;21)和 AML1-ETO融
合基因的检测对其预后判断及治疗方案
的制定相当重要
? AML1-ETO定性结果不能用于评价患者
MRD情况
? RQ-PCR能实时反映体内 AML1-ETO水
平。连续定量 AML1-ETO转录本水平可
判定有高复发风险的患者，以便及早治
疗干预以防血液学复发
AML1- 阴性
ETO+
C-KIT基因突变
? C-KIT为 III型受体酪氨酸激酶家族（还包括 c-
FMS,PDGFRβ和 c-KIT） 成员之一
? AML1-ETO可诱导性表达的转基因小鼠，并不
导致白血病发生
? C-KIT突变可见于伴 inv(16)的 M4以及伴 t(8;21)
的 M2患者
? 26/54例 (48.1%) M2b患者中检测到 C-KIT基因
突变
? 57例不伴 t(8;21)的其他类型血液肿瘤患者均未
检测到 C-KIT基因突变
? 以上结果提示 C-KIT突变与 M2b密切相关
(R=0.94,P<0.01)
C-KIT基因突变
? C-KIT基因结构
JM
C-KIT基因突变
?外周血白细胞计数
C-KIT基因突变
?生存曲线
PML-RARα
? t(15;17)(q22;q21)
? 98%M3患者
? 继 t(15;17)之后，又先后发现 4种 M3特异的累及
RARα的变异性染色体易位,t(11;17)(q23;q21)，
t(5;17)(q35;q21),t(11;17)(q13;q21)以及
dup(17)(q21.3;q23),分别产生 PLZF-RARα，
NPM-RARα,NuMA-RARα和 STAT5b-RARα融
合基因
? 临床上，具有 PLZF-RARα或 STAT5b-RARα融
合基因患者对 ATRA治疗不敏感，其余三种染
色体易位患者经 ATRA治疗可获完全缓解
PML-RARα
APL累及的 RARα基因及其伙伴基因结构示意图
PML-RARα
?由于 PML基因断裂点 不同产生 3种不同的
PML-RARα异构体
?约 55%的 M3患者为 L型,40%为 S型，
5%为 V型，且每位患者只表达一种 PML-
RARα融合蛋白
?形态学上 S型白血病细胞常为低分化的并
且这些患者可见继发细胞遗传学异常,V
型 APL患者的白血病细胞体外对 ATRA
的敏感度低
PML-RARα
? RT-PCR检测 PML-RARα是敏感且特异的
APL诊断方法，还能用于治疗后 MRD监
测。 PML-RARα阳性提示的分子复发常
早于临床复发 3-6个月，为临床采取进一
步治疗措施提供了保障
? RQ-PCR能有效反映患者在发病、治疗、
缓解、复发整个过程的白血病细胞负荷，
在 MRD监测中比 RT-PCR具有更高价值
L+ 阴性 S+
FLT3基因突变
? Fms-related tyrosine kinase 3
? FLT3为 III型受体酪氨酸激酶家族（还包括 c-
FMS,PDGFRβ和 c-KIT） 成员之一，该类受
体因在造血过程中造血细胞的增殖和存活中发
挥重要调控作用
? 综合国外各研究报道,FLT3-ITD和 D835突变
在 AML中阳性率分别为 24%(385/1585)和
7%(30/429)，总阳性率超过 30%，使其成为
AML中最普遍发生突变的靶基因
? 许多临床研究发现,FLT3突变还与临床预后
密切相关，尤对 60岁以下的 AML患者,FLT3
突变患者预后较差，且可独立于核型之外
FLT3基因突变
FLT3基因突变
? FLT3基因主要突变类型
FLT3基因突变
? mut-FLT3信号通路
FLT3基因突变
?外周血白细胞计数
0
20
40
60
80
100
120
140
160
FLT3-ITD- FLT3-ITD+
A
P
L
患者初发时外周血W
B
C
计数
(x10
9
)
CBFβ-MYH11
? inv(16)(p13;q22)及 t(16;16)(p13;q22)
?主要见于 M4Eo,10%不伴异常嗜酸细胞
M4,少见于 M2
? CBFβ-MYH11融合蛋白通过干扰核心结
合因子（ core binding factor,CBF） 的
转录激活作用而致病
?具有 CBFβ-MYH11的患者对化疗敏感，
预后较好，故提高检测率尤具临床意义
CBFβ-MYH11
? CBFβ-MYH11具有多种变异型，其中最
常见的为 A型，占 80%
? RT-PCR检测 CBFβ-MYH11进行 MRD监
测显示，大部分患者在完全缓解时 PCR
转阴，但仍有小部分长期存活者 PCR仍
为阳性
?最新研究采用 RQ-PCR检测 CBFβ-
MYH11转录本水平来评价 M4Eo患者
MRD情况，预示复发
NPM基因突变
? Nucleophosmin,为核 -浆穿梭蛋白，调控 p53-
ARF通路
? 见于 ~50%核型正常的 AML患者，而在伴低危 /
高危核型患者中极少见
? 主要见于 M4/M5中
? 第 12号外显子的插入 /缺失
? 伴此突变患者 WBC计数高
? 目前，此突变的预后价值各研究组报道不一，
尚待进一步证实
DEK-CAN
? t(6;9)(p23;q34)
? 主要见于 M2或 M4，也见于 M1,MDS-RAEB
? 伴 DEK-CAN的患者年龄一般较轻，且预后较
差
? 此类患者进行分子监测有助于判断患者预后，
调整治疗方案
N-RAS基因突变
? 为 RAS基因家族成员之一，染色体定位于
1p32.2。 具有 GTP/GDP结合和 GTPase活性，
调控正常细胞的生长
? 此基因突变存在于 11-30%AML
? 突变热点位于 codon12,13和 61
? 在 inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突变率较高，
而在 t(15;17)中低
? 伴此突变患者外周血 WBC计数低
? 该突变预后意义尚不明
WT-1基因高表达
? Wilms tumor 1
?是无特异分子异常的急性白血病患者理
想的 MRD检测指标
?伴此基因高表达者预后差，且表达程度
与预后相关
BCR-ABL
? t(9;22)(q34;q11)
? 15~30%成人 ALL及 3~5%儿童 ALL
? 9号染色体的断裂点与 CML相同，但 22号染色
体断裂点具有异质性
? 此融合蛋白 p190刺激细胞增殖的能力比 p210要
强。在转基因试验中观察到 p190诱发的白血病
具有起病早、发展快和恶性程度高的特点
? BCR-ABL+ALL患者预后差,5年存活率 <20%，
因此这些患者在缓解后需进行骨髓移植治疗
BCR-ABL
?对于自体或异体移植 ALL患者，移植前
后 BCR-ABL的有无以及 BCR-ABL的转录
本类型与预后有关
e1a2+ 阴性
E2A-PBX1
? t(1;19)(q23;p13)
? 5~6%儿童 ALL和 3%成人 ALL
? 此类患者具有高的白细胞计数，高的血清乳酸
脱氢酶及中枢神经系统症状，预后差，平均无
病生存期（ DFS） 仅 6个月,3年 DFS为 20%，
需给予这些患者强化治疗才能获得较好的预后
? 核型和 E2A-PBX1检测对此类患者的诊断和治
疗方案的选择至关重要
? E2A-PBX1的预后价值需更多的临床研究证实
TEL-AML1
? t(12;21)(p13;q22)
? 25%儿童 ALL,是儿童 ALL中最常见的分子异
常
? 目前为止尚未在 T-ALL,AML或 NHL中发现
t(12;21),在婴儿白血病中极少报道，在成人
白血病患者中频率很低（ <2%）
? 此类患者发病年龄小（ 2岁 ~10岁）,WBC计
数低（ <50 000/L）,免疫表型为前 B-ALL
? 此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预
后好
TEL-AML1
?由于 12p和 21q末端在常规显带中很相似，
因此常规细胞遗传学方法检出率仅 0.05%，
需应用 FISH或 RT-PCR方法提高检测阳
性率
? TEL基因重排是独立预后因素,RT-PCR
检测 TEL-AML1融合基因能将低危险度
与高危险度的 ALL患者区分开来。因此
早期检测 TEL-AML1融合基因对临床预
后，确定合适的治疗方案都有重要意义
MLL相关融合基因
? 累及 MLL基因的分子异常见于 5.2%AML，
22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，还可
见于治疗相关白血病，尤接受 topoisomerase II
抑制剂治疗的患者
? MLL基因涉及五十余种染色体易位，产生不同
的融合蛋白，且每种融合蛋白都与特定的白血
病表型相关。最常见的有,
t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4融合基因 ALL
t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9融合基因 AML
t(11;19)(p13;q23) MLL-ENL融合基因 AML及 ALL
MLL相关融合基因
?至今,MLL相关融合蛋白的致病性还不
清楚，推测其可能具有双重作用,
——融合蛋白可能获得新的功能，促使
细胞转化
——MLL发生断裂后，缺失锌指结构域
的 MLL不能与 DNA结合，失去其转录活
化功能，使受 MLL调节的靶基因（ HOX
基因）表达异常，也影响造血细胞的发
育
MLL-AF4
? t(4;11)(q21;q23)
? t(4;11)的发生率在不同年龄段是不同的，在婴
儿 ALL中最多见，为 50~70%，而在儿童和成
人中较低，分别为 2%和 3~6%
? 此类患者发病年龄低（通常 <2岁），白细胞计
数高，常伴有内脏巨大并累及中枢神经系统
? 此类患者病情凶险，预后差。患者对标准治疗
方案很可能无效，需给予强化治疗。目前应用
高剂量 Ara-C治疗，使这些患者预后有所提高
MLL-AF4
?对 ≤2岁的婴幼儿急性白血病患者应常规
进行 MLL-AF4融合基因的检测以筛选出
高危患者，给予强化治疗提高生存率
? RT-PCR可在所有 t(4;11)患者初发时检测
到 MLL-AF4融合基因。由于该融合基因
累及的 2个基因的断裂点变异性较大，因
此 PCR应包括所有断裂点以免产生假阴
性结果
TAL1基因重排
? t(1;14)(p32;q11),TAL1-TCRδ融合基因
? 3%T-ALL
?易位使 TAL1基因与 TCRδ位点并置，其
5′端正常转录调节被 TCRδ 5′部分所取
代，而后者在 T细胞中有高表达
TAL1基因重排
? 1p32缺失,SIL-TAL1融合基因
? 16~26%T-ALL
? 该重组仅见于 T-ALL，是 T-ALL的一个有用的
克隆标志
? 缺失部分可能为 TAL1基因的调控序列，使
TAL1基因表达失控，导致与染色体易位相似
的表型
? 常规遗传学方法检测不到这一异常，而 SIL-
TAL1融合处特异的序列能作为这类患者特异
的分子标志用于 PCR检测
TAL1基因重排
? TAL1异常仅见于 T-ALL,尚未见于 B-ALL，
AML和 T细胞 NHL,是儿童 T-ALL中最常见非
随机遗传缺陷，是监测大多数 T-ALL的侯选基
因
? 伴 TAL1异常的患者血象表现为高白细胞计数，
高血红蛋白含量，免疫表型为 CD2+/CD10–
? 尽管在治疗反应上，有 TAL1重排患者和无
TAL1重排患者无显著差异，但伴 TAL1重排患
者 4年无事件生存率（ EFS） 高于不伴 TAL1重
排的患者，分别为 59± 11%和 44± 7%，提示
伴 TAL1重排患者预后较好
HOX11基因异常表达
? t(10;14)(q24;q11), t(7;10)(q34;q24)
? 7%的 T-ALL
?易位使 HOX11基因受控于 TCRδ和 TCRβ
基因调控序列，导致其异常 表达
?另有部分 HOX11高表达患者核型正常
?伴有此种异常的患者对联合化疗反应好，
预后也较其他 T-ALL患者要好，完全缓
解率为 100%，平均无病生存期为 46个月，
3年无病生存率为 75%
HOX11L2基因异常表达
? t(5;14)(q35;q32)
? 20%的儿童 T-ALL
? 易位使 HOX11L2基因处于 CTIP2调控元件的控
制下，而 CTIP2基因在 T淋巴细胞分化时高度
表达
? 在随访患者中检测到高水平 HOX11L2说明白血
病细胞的存在，强烈预示复发，而完全缓解患
者 HOX11L2表达水平迅速降低，并维持在一个
低水平。可见 HOX11L2的表达水平可作为
MRD检测的标志
NOTCH1基因突变
? NOTCH1信号对 CLP(common lymphoid
progenitors)向 T细胞定向以及前 T细胞受体复
合物组装是必须的
? 35-50% T-ALL患者存在此基因突变
? 伴 NOTCH1基因突变的成年 T-ALL患者预后较
差
NOTCH1基因突变
? NOTCH1基因结构
NOTCH1基因突变
?生存曲线
BCR-ABL
? t(9;22)(q34;q11)
? >90% CML患者
? BCR-ABL融合蛋白（ p210） 的酪氨酸蛋白激
酶活性较正常 ABL高，可能是 BCR对 ABL激酶
活性调节区的作用所致
? 由于 <5%CML患者为隐匿性 Ph染色体，因此
无 Ph染色体 CML患者还需使用更灵敏的分子
检测手段如 FISH或 RT-PCR检测 BCR-ABL融
合基因
? RT-PCR还能区分 e1-a2和 b2-a2/b3-a2二种
BCR-ABL转录本，从而区分 ALL患者与 CML
急淋变患者，进而分别对两种不同患者采用不
同的治疗方案
BCR-ABL
?巢式 RT-PCR检测 BCR-ABL融合基因用
于 CML移植患者移植后 MRD监测。可在
患者血液学复发前的 6~24个月骨髓检测
就呈阳性。
? RQ-PCR还能动态观察患者治疗后 BCR-
ABL转录本水平变化情况，反映疗效。
b3a2+ b2a2+ 阴性
GATA2基因突变
? 调控早期造血干细胞增殖分化的转录因子，维
持造血干祖细胞的增殖和自我更新能力
? CML急变患者中新发现 GATA2基因突变,而
CML慢性期、加速期,AML（ M1-M7），
MDS,ALL,CLL,淋巴瘤和骨髓瘤患者，
以及正常对照均未发现该突变，可见 GATA2
基因突变仅与 CML急变相关，是 CML疾病进
展过程中的获得性突变。总发生率为 12.5%
（ 5/40）,且均造成 CML急粒单变
? GATA2基因 突变与 CML患者疾病进展和预后
的关系有待进一步阐明
JAK2基因突变
? Janus kinase 2
?此基因突变主要见于 MPD和 MDS,另可
存在于部分 AML尤 M2
?突变为 V617F
?突变去除了 JAK2 JH2负性调控，导致该
基因的持续活化，赋予细胞增殖存活优
势
? JAK2可成为靶向治疗的靶点
MDS相关基因异常
? Delta样 (Dlk)基因编码 Dlk蛋白在 MDS明
显增高者 55%，而 AML仅 10%，可能是
MDS特异性基因，但作为诊断 MDS的标
志基因尚待进一步确定
MDS相关基因异常
? RAS
? 此原癌基因超家族编码鸟苷三磷酸水解酶
(GTPase)调节细胞生长相关信号
? ras癌基因的活化，尤其是 N-ras的激活可在约
35%的 MDS患者中发生
? FMS
? 为集落刺激因子 1，控制单核 -巨噬细胞生长、
分化及功能
? fms基因的突变可在 16%的 MDS患者中发现
? ras和 fms突变主要见于粒 -单细胞分化的疾病，
即 MDS中的 CMML,患者生存期短，转 AML
多
MDS相关基因异常
? p53
? 在 MDS时,p53突变较少见 (<5%)，但在较为
进展的病例中可高达 15%
? p53突变意味着化疗耐药和生存期缩短，因而
是一种有意义的预后指标
? FLT3
? 10%MDS有 FLT3点突变，加快进展为 AML，
但 FLT3-ITD少见
? AML1(RUNX1)
? 为 MDS较常见的点突变，发生率 25%，导致核
心结合因子 (CBF)亚单位正常功能缺失，易转
化 AML
Ig/TCR基因重排
? Ig/TCR基因重排检测，对决定白血病的细胞来源系列
乃至分化阶段，有重大意义
? 在 B系 ALL中分别有 95%,54%,55%和 33%的患者
有 IgH,TCRδ,TCRγ和 TCRβ基因重排，在 T-ALL中
相应的基因重排率分别为 14%,68%,91%和 89%
? 由于重排的多样性，重排的 Ig和 TCR基因连结区序列
在各淋巴 (前体 )细胞中是不同的，因而每位患者有其
各自特异的 Ig/TCR基因重排序列，这一特定的 Ig/TCR
基因重排序列可作为该恶性克隆的分子标志，在分子
水平进行诊断分型，还可通过 PCR检测缓解期患者有
无初发时的 Ig/TCR基因重排来追踪残余白血病细胞,
用于预后判断
Ig/TCR基因重排
? Ig的基因由 Lκ,Lλ和 H三个基因组组成，分别编码 Lκ
链,Lλ链和 H链。 L和 H基因又由编码 Ig分子的 V区和
C区基因构成。
B细胞分化,
IgH重排 κ重排 IgH/κ表达
IgH重排 λ重排 IgH/λ表达
κ错误重排 /缺失
Ig/TCR基因重排
? TCR由两条肽链组成,αβ链或 γδ链，不论是哪一种肽
链，其胞膜外区均包括两部分，即 V区和 C区。相应的
编码基因为 TCRA,TCRB,TCRG和 TCRD。
T细胞分化,
TCRD重排 TCRG重排 TCRγδ表达
TCRB重排 TCRA重排 TCRαβ表达
TCRD缺失
Ig/TCR基因重排
? Ig/TCR基因多样性的机制
组合造成的多样性
~2x106 Ig,~3x106 TCRαβ,~5x103TCRγδ
连接造成的多样性
>1012 Ig和 TCR
体细胞高频突变造成的多样性
仅限于成熟 B淋巴细胞
Ig/TCR基因重排
V-D-J重排,IgH,TCRB,TCRD
V-J重排,Lκ,Lλ,TCRA,TCRG
Ig/TCR基因重排
谢 谢！
