高效液相色谱特点
?高压
–高效
?高速
–高灵敏度
第一节 高效液相色谱仪
第二节 液相色谱分析
第三节 色谱类型选择
第四节 流动相的选择
第五节 液相色谱方法的建立
第六节 方法举例
第一节 高效液相色谱仪
1、高压输液系统,贮液罐、过滤器、高压输液泵
要求高压输液泵：
? 压力输出够
– 流量恒定
? 流量可调
– 压力平稳
2、进样系统
3、色谱柱
4、检测系统
检测器
（ 1） 紫外 -可见吸收检测器
（ 2）示差折光检测器
（ 3）荧光检测器
（ 4）二级管 陈列检测器
（ 5）电导检测器
第二节 液相色谱分析
（一） 吸附色谱（液 -固色谱）
流动相：液体 固定相：吸附剂
应用：分离分子量中等的脂溶性组分，对
由不同官能团的化合物和异构体
（二）液液色谱
流动相：液体 固定相：液体
1、正相液 -液色谱
流动相的极性小于固定相的极性，即固
定相采用亲水性固定液
流动相,极性小于固定液的溶液。
应用,甾醇类、类脂化合物、磷脂化合物、
脂肪酸
2、反相液液色谱
以强疏水性的填料为固定液，以可以与水向混合的有机
溶剂为流动相的色谱。
特点,流动相的极性大于固定相。
（ 1） 色谱柱的类型,
以硅胶为基质：硅胶上键合 C18,C8
氧化物,一氧化钛、二氧化锆
聚合物,苯乙烯 -二乙烯基苯的聚合物
（ 2） 流动相,水、甲醇、乙晴的溶液
（ 3） 应用,应用广泛
3、离子交换色谱
利用固定相和流动相对待测组分离子交换能力的
差异进行分离的色谱。
固定相,阴、阳离子交换剂
流动相,含盐的水溶液，有时加入适量的有机溶
剂
应用,分离可离子或者可离解的化合物 。
4、体积排阻色谱
原 理,分子的体积排阻作用。
固定液,具有不同孔径的多孔凝胶。
典型色谱柱, TSK-G-W,TSK-G-SW Superose、
Zorbax Bio Series GF
应用,多肽、蛋白质、多糖、聚合物、病
毒、
DNA,RNA
5、疏水作用色谱
利用样品中多组分具有不同疏水作用的性质进行分离的
方法。
应用,分离蛋白质
固定相,表面为疏水作用基团的物质，其疏水性仅为反
相色谱的 1/10-1/100。
流动相,高离子强度的盐
影响因素,
（ 1）固定相的疏水性：过大会引起不可逆性吸附。
（ 2）离子强度：大的洗脱能力强、峰形尖锐
（ 3）酸度：
（ 4）温度：升温会增加保留时间，但会降低蛋白质的溶
解度和活性
第三节、色谱柱的选择
每一色谱柱都不是万能的！
每一种分离类型都不是万能,各自只适合于一定
的分离对象，因此，在进行分离时要根据样品
本身的特性来选择一种合适的分离方法 。
可根据组分的分子量范围、溶解度、分子结构等
性质探索合适的分离方法。
根据组分的分子量范围选择分离方法
分子量 分离方法
小、易挥发 气相色谱
200-2000 标准液液色谱
〉 2000 空间排阻色谱
根据组分的溶解性选择分离方法
类型 水溶 离解 异辛
烷
苯溶 二氯
甲烷
溶
异丙
醇溶
离子
交换 ★ ★
吸附 ★ ★
正相 ★ ★ ★
反相 ★
第四节、流动相的选择
选择流动相须考虑的因素：
1、纯度：分析纯、色谱纯
2、避免使用柱效损失或者保留特性变
化的溶剂；
3、溶解度：对试样有一定的溶解度；
4、溶剂的粘度：要小。
第五节
液相色谱分析
1、流动相的配制、过滤（溶剂过滤器）、脱气、恒温
2、氦气的准备？
3、机器的准备：电源、色谱柱的连接与平衡、管道的漏
水或堵塞？、检测器预热
4、方法的建立：
（ 1）计算机的准备：电源、工作站 Shortcut to Millog
（ 2）系统的连接,600-2487? 600-423?
（ 3）方法的建立：
方法组的建立
分析条件的设定,Run Samples -Develop Methods
-Greate New –
色谱泵工作条件的设定,W600-Flow –T
检测器工作条件的设定,channel1 -?-c enable
event stort,on Injection,Time,0.00,Function：
pulse；
方法保存,Save,Save as
5、方法连接：方法名 -Set-Ideal
6,进样
7、检测器关闭 -管路的清洗、色谱柱的更换与保管、流
动相及废液的处理 -色谱 泵 关闭
8、数据计算与处理
9、结果打印 -工作站、计算机、关闭
第六节 液相色谱分析举例
有机酸分析
色谱柱,Shim-Pack SCR-102H,80mm?30cm
流动相,pH 2.1 高氯酸溶液
流速,0.8 ml/min
柱温,40℃
检测器：紫外 -可见吸收检测器波长,210 nm
无机阴离子分析
色谱柱,IC-Pak A HC
流动相,Soldium Borate/Gluconate
流速,1 ml/min
检测器：电导检测器 430
Gain:0.01
Range:500 μ s
T:35 ℃
Polarity:+
Backrround cound:274μs
Thanks