第二章 发酵过程的生物学基础 发酵过程与微生物（自学） 微生物的营养与培养基的设计（自学） 微生物的生长模式及其动力学（自学） 环境对微生物的影响（自学） 代谢产物的代谢调控 在生物进化过程中，微生物细胞形成了愈来愈完善的代谢调节机制，使细胞内复杂的生化反应能高度有序地进行，并对外界环境的改变迅速作出反应，因而在代谢繁殖过程中，能量的利用以及对细胞生长繁殖过程中所需的各种物质的形成是非常合理和经济的，需要多少合成多少，不需要的不合成或合成量很少，细胞经常处于平衡生长状态，不会有代谢产物的积累。从进化角度看，代谢产物的过量产生，对细胞能量的利用和细胞组成物质的合成都是一种浪费。在自然环境中，只有当条件改变时才会造成微生物积累某些代谢产物，如在厌氧条件下酒精、乳酸和醋酸的大量形成。通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径；改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生，正是现代发酵工业要研究的主要内容。其方法大体可分为两类，一是改变产生菌的基因型而改变代谢途径；二是改变控制代谢速率，即影响基因型的表达。 代谢调节是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。包括酶量的调节和酶活性的调节。 微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。 一、代谢调节方式 1，细胞透性的调节 细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收。 例如，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌吸收乳糖是由渗透酶和环状AMP(cAMP)协同控制来完成的。cAMP的浓度是由腺苷酸环化酶(AC)的活性控制的，也就是说，乳糖的吸收受渗透酶和AMP环化酶的控制，调节蛋白通过磷酸化的形式和腺苷酸环化酶（AC）或渗透酶结合，分别使腺苷酸环化酶活化或使渗透酶失活。当有葡萄糖时，乳糖的渗透酶以无活性状态存在，而腺苷酸环化酶也以非活性状态存在。 2，代谢途径区域化 原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。 在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。 细胞具有复杂的膜结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行，即代谢活动是区域化的，其实质是控制酶与底物接触，使各个反应有序地进行。3，代谢流向的调控微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。它包括两种形式：由一个关键酶控制的可逆反应和由两种酶控制的逆单向反应。（1）由一个关键酶控制的可逆反应 同一个酶可以通过不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。例如，谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时，主要是催化谷氨酸的合成，当以NAD+为辅酶时，则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同的辅基来控制代谢物的流向。（2）由两种酶控制的逆单向反应 逆单向反应是在生物体代谢的关键部位的某些反应，它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一种酶催化正反应，而另一种酶则催化逆反应。例如，葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反应则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反应则由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。4，代谢速度的调控在不可逆反应中，微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。微生物在不同条件下能按照需要，通过酶活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原科进行生长繁殖。 二、酶合成的调节 1，酶合成的诱导 根据酶合成与底物的关系将酶分为组成型与诱导型两类。 组成酶是细胞固有的酶，其合成受相应基因控制，与底物、底物结构类似物及环境条件无关，它主要用于调节初级代谢。 诱导酶是细胞为适应外来底物或底物结构类似物而临时合成的酶。如E.coli在含乳糖培养基上产生的β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶就是由乳糖存在而诱导产生的。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物。底物、难以代谢的底物结构类似物及底物前体均可作为诱导物。 -酶合成的诱导分为协同诱导与顺序诱导两种类型。协同诱导指一种底物能同时诱导几种酶的 合成。顺序诱导指先合成分解底物的酶，再依次合成分解各中间产物的酶，达到对复杂代谢途径的分段调节。 2，酶合成的诱导的机制 在没有诱导物存在时，调节基因R编码的阻遏蛋白与操纵基因O相结合，使附着于启动基因P上的RNA聚合酶不能通过，从而阻止了RNA聚合酶对结构基因S的转录；当诱导物存在时，阻遏蛋白因受诱导物作用而构型发生变化，失去与操纵基因的结合能力，从操纵基因上解脱下来，使RNA聚合酶能对结构基因进行转录，进而翻译成酶蛋白。 3，酶合成的阻遏 在微生物的代谢过程中，当某途径的末端产物过量时，可通过阻碍该代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，彻底控制代谢和末端产物合成。阻遏作用有利于微生物从合成源头节省有限的养料与能量。 （1）终产物阻遏 末端产物阻遏指某代谢途径末端产物过量累积引起的阻遏。在直线反应途径中，末端产物阻遏较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使这些酶不能合成。 （2）分解代谢产物阻遏 分解代谢物阻遏指细胞内同时存在两种底物(碳源或氮源)时，易利用底物会阻遏难利用底物分解酶系的合成。其实质并非易利用底物直接导致，而是易利用底物分解过程中产生的中间代谢物或末端代谢物的过量累积，阻遏了代谢途径中一些酶的合成。导致所谓“二次生长现象”。 4，酶合成的阻遏的机制 终产物的反馈阻遏在转录水平上进行，终产物为辅阻遏物，它可激活由调节基因R生成的无活性阻遏蛋白。辅阻遏物与阻遏蛋白结合形成活化阻遏物，它能与操纵基因O结合，阻止RNA聚合酶对结构基因S的转录。 三、酶活性的调节 1，概念酶活性调节：是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。 2，影响因素 影响酶活性的因素有： （1）底物和产物的性质和浓度 （2）环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等) （3）其他的酶的存在 3，调节方式 酶活性的调节方式有两种：激活已有酶的活性和抑制已有酶的活性 （1）激活激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。 代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。 前体激活，指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。 代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用（2）抑制抑制和激活相反。由于某些物质的存在，降低酶活性，称为抑制。抑制可以是不可逆的，这将造成代谢作用的停止；抑制也有可逆的，当抑制剂除去后，酶活性又恢复。在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多属于反馈抑制。 （2）反遗抑制：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑 制。反馈抑制作用在生物体内普通存在，它在维持细胞正常代谢、经济有效地利用代谢原料、以及适应环境的变化，都具有重要作用。包括无分支代谢途径的调节和有分支代谢途径的调节。 ①无分支代谢途径的调节通常是在线形的代谢途径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。例如，在大肠杆菌中，由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时，异亮氨酸对催化反应途径中的第一步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作用。 苏氨酸 α-酮丁酸 异亮氨酸 ②有分支代谢途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用，分支代谢的反馈调节方式有多种: 酶的顺序反馈抑制 分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。 例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT)，酪氨酸(Tyr)抑制预苯酸脱氢酶(PD)，预苯酸和分支酸又部分地抑制7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶(DS)。 EP：磷酸烯醇丙酮酸；E4P：4-磷酸赤藓糖；DAHP：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸；CA：分支酸；Per：预苯酸；AA：邻氨基苯甲酸；HPPA：对羟基苯丙酮酸；PPA：苯丙酮酸；Tyr：酪氨酸；Try：色氨酸；Phe：苯丙氨酸；I：7-磷酸-2-酮-3-脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸变位酶；IV：预苯酸脱氢酶；V：预苯酸脱水酶 同工酶的反馈抑制 同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。 例如，大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、甲硫氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)的代谢途径中有三种天门冬氨酸激酶的同功酶(AKI、AKII和AKIII)和两种高丝氨酸脱氢酶的同功酶(HSDHI和HSDHII)。其中AKI和HSDHI受到苏氨酸、异亮氨酸的反馈抑制和阻遏，AKII和HSDHII受甲硫氨酸的反馈抑制和阻遏；AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。  协同反馈抑制 在分支代谢系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。 例如，荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中，天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。 Asp：天门冬氨酸；Asp-Pi：天门冬酰磷酸；Asa：天门冬氨酸半醛Thr：苏氨酸；Lys：赖氨酸； AK：天门冬氨酸激酶 累积反馈抑制 在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。 例如，大肠杆菌谷氨酰胺合成酶(GS)活性的调节是一个典型的累积反馈调节的例子。谷氨酰胺由谷氨酸、铵和ATP合成。谷氨酰胺中的酰胺基是色氨酸、组氨酸、氨基甲酰磷酸、6—磷酸葡萄糖胺、CTP、AMP、GMP等化合物生物合成过程中的氮源。谷氨酰胺合成酶被谷氨酰胺代谢的每种末端产物以及丙氨酸和甘氨酸所累积抑制。谷氨酰胺合成酶对这些抑制物中的每一种末端产物均有特异的结合部位。当上述8种末端产物同时过量都与酶结合时，谷氨酰胺合成酶的活性将受到最大的抑制。  超相加反馈抑制超相加反馈抑制是一种既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。对一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。 例如，在嘌呤核苷酸的生物合成途径中，催化第一步反应的酶，5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的酰胺基转移酶，可被各种嘌呤核苷酸产物(如AMP、GMP)所抑制。例如，一定量的GMP或AMP仅能抑制5-磷酸核糖-1-焦磷酸酰胺基转移酶活力的10％，而当二者混合时，则可抑制其酶活力的50％。因为这些嘌呤核苷酸与5-磷酸核糖-1-焦磷酸并无结构相似性，又因该酶是一种调节酶，GMP和AMP可能分别结合在该酶的不同部位上。 4，酶活性调节的分子机制解释酶活性调节机制的理论： （1）别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变) （2）酶分子的化学修饰理论(其核心是酶分子结构的改变)。 四、初级代谢的调节初级代谢的调节方式有： 1，产能代谢的调节：能荷调节 能荷：即指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度 能荷的大小与细胞中ATP、ADP和AMP的相对含量有关。当细胞中全部腺苷酸均以ATP形式存在时，则能荷最大，为100%，即能荷为满载。当全部以AMP形式存在时，则能荷最小，为零。当全部以ADP形式存在时，能荷居中，为50%。若三者并存时，能荷则随三者含量的比例不同而表现不同的百分值。 研究证明，细胞中能荷高时，抑制了ATP的生成，但促进了ATP的利用，也就是说，高能荷可促进分解代谢，并抑制合成代谢。相反，低能荷则促进合成代谢，抑制分解代谢。 能荷调节是通过ATP、ADP和AMP分子对某些酶分子进行变构调节进行的。例如糖酵解中，磷酸果糖激酶是一个关键酶，它受ATP的强烈抑制，但受ADP和AMP促进。丙酮酸激酶也是如此。在三羧酸环中，丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶等，都受ATP的抑制和ADP的促进。呼吸链的氧化磷酸化速度同样受ATP抑制和ADP促进。 2，核蛋白体合成的调节 3，氨基酸、核苷酸合成代谢的调节 五、次级代谢的调节次级代谢的调节方式有： 1，初级代谢对次级代谢的调节 许多次级代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的。因此次级代谢必然会受到初级代谢的调节。例如青霉素的合成会受到赖氨酸的强烈抑制，而赖氨酸合成的前体 a- 氨基己二酸可以缓解赖氨酸的抑制作用，并能刺激青霉素的合成。这是因为 a- 氨基己二酸是合成青霉素和赖氨酸的共同前体。如果赖氨酸过量，它就会抑制这个反应途径中的第一个酶，减少 a- 氨基己二酸的产量，从而进一步影响青霉素的合成。 2，碳代谢物的调节作用 碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源(葡萄糖)或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶(包括分解酶和合成酶)的调节。分为分解产物阻遏和抑制两种。 葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。 3，氮代谢物的调节作用 在初级代谢中，氮分解代谢产物调节，即被迅速利用的氮源(氨)抑制作用于含底物的酶(蛋白酶、硝酸盐还原酶、酰胺酶、脲酶、组氨酸酶)的合成。在次级代谢中，其阻遏作用也确实存在。在抗生素生产中使用黄豆饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨，防止或减弱氮分解代谢产物阻遏作用的结果。 4，磷酸盐的调节作用 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节抗生素生物合成的重要参数。其机制按效应剂说有直接作用，即磷酸盐自身影响抗生素合成，和间接作用，即磷酸盐调节胞内其他效应剂(如ATP、腺苷酸能量负荷和cAMP)，进而影响抗生素合成。 已发现过量磷酸盐对四环素、氨基糖苷类和多烯大环内酯等32种抗生素的合成产生阻抑作用。 5，次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用 6，次级代谢中细胞膜透性调节 外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输，如发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响产物合成，使产量下降。 如在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加，硫源供应允足，合成青霉素的量就增多。 第六节 微生物代谢产物的过量产生 一，提高初级代谢产物产量的方法 我们知道，初级和次级代谢产物在遗传控制、合成时期、合成途径等方面是存在差异的，因而获得发酵产物过量生产的方法也不同。由于次级代谢产物的合成远离初级代谢的主要途径，微生物细胞对其合成控制较弱，因此，改变环境条件易于影响其表达，基因型改变后的产量变异幅度也较大，而初级代用产物则与此相反。这在选择提高代谢产物方法时应予考虑。提高初级代谢产物产量的方法主要有以下几种： 1，使用诱导物 与糖类和蛋白质降解有关的水解酶类大都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。如加入槐糖(1，2—β—D—葡二糖)诱导木霉菌的纤维素酶的生成，木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成等。但诱导物的价格往往比较贵，经济上未必合算。加入廉价的含有诱导物的原料，如槐豆英等某些种籽皮中含有槐糖，玉米芯富含木聚糖，培养过程中可陆续被水解产生槐糖、木糖，这都是经常采用的方法。但是，玉米芯等这类不溶性聚合物的分解过程缓慢，以其为唯一碳源时，培养周期比较长，产品的体积生产率仍难大幅度提高。可考虑先使微生物在廉价的可溶性碳源中迅速生长，形成大量菌体后，再加入诱导物诱导水解酶类生成的方法。 诱导物的浓度过高及能被迅速利用时，也会发生酶合成的阻遏，这在纤维二糖对纤维素酶的产生，木二糖对半纤维素酶产生中都己观察到，这也是使用诱导物时应予注意的。 2，除去诱导物——选育组成型产生菌 在发酵工业中，要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的，分批限量加入诱导物在工艺上也多不便，更为有效的方法是改变菌株的遗传特性，除去对诱导物的需要，即选育组成型突变株。通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，都可达到此目的。迄今尚未见由于结构基因发生改变而得到组成型的报道。 已设计出多种选育组成型突变株的方法，其主要原则是创造一种利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌落的方法，从而把产生的组成型突变株选择出来。例如把大肠杆菌半乳糖苷酶的诱导型菌株经诱变处理后，先在含乳糖的培养基中培养，由于组成型突变株半乳糖苷酶的合成不需诱导即能产生，因此可较诱导型的出发菌株较早开始生长，在一定时期内菌数的增加便较快，如持续进行培养时，由于诱导酶形成后，原菌株生长速率亦逐渐增加，这种选择性造成的差别就会减少，可用交替在乳糖、葡萄糖培养基中进行培养的方法。两者利用葡萄糖时的生长速率是相同的，乳糖为碳源造成的组成型菌株的优势生长会持续下去，最后由平板分离就易于得到组成型突变株。以乳糖为限制性生长因子进行连续培养时，生长速率较低的诱导型菌株就会被冲洗掉，也是利用了上述原理。诱导型菌株不经诱变处理，利用其自发突变，用连续培养方法，也能得到组成型突变株。 在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当的底物进行反应显示酶活加以识别。经常使用酶解后可以有颜色变化的底物，便于迅速捡出组成型菌落。如甘油培养基平板中培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶，组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻硝基苯半乳糖苷，组成型菌株的菌落由于能水解它而呈现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化。另如羧甲基纤维素被内切纤维素酶水解后，由于暴露出更多的还原性末端而能被刚果红所染色。可由此方便地检出纤维素酶产生菌。 3，降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生 高分子的多糖类、蛋白质等的分解代谢产物(如能被迅速利用的单糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸盐等)都会阻遏分解其聚合物的水解酶类的生成。因此用限量流加这类物质或改用难以被水解的底物的方法，都可减少阻遏作用的发生，而获得较高的酶产量。但是由于它并未改变产生菌的遗传特性，只是暂时地改变了酶的合成速率，因此结果往往不稳定。更有效的方法是筛选抗降解物阻遏的突变栋。 4，解除分解代谢阻遏——筛选抗分解代谢阻退突变株 从遗传学角度来考虑，如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活；不能与末端分解代谢产物结合，或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。前者为隐性突变，后者为显性突变，都能由此导致酶的过量产生。 可以直接以末端代谢产物为底物来筛选抗阻遏突变株，如以葡萄糖、甘油为碳源筛选纤维系酶抗阻遏突变株。但更多地是利用选育结构类似物抗性菌株的方法。 它所依据的机制是，结构类似物由于在分子结构上与分解代谢的未端产物相类似，因此、它也能与阻遏蛋白相结合，如调节基因发生突变而使阻遏蛋白不能与结构类似物结合，即出现抗性菌株。由于分子结构上的类似，这种抗性菌株产生的阻遏蛋白也不能与正常的分解代谢产物相结合，即同时也具有对相应的分解代谢产物阻遏作用的抗性，而能导致相应酶类的过量生产。 由于结构类似物与正常代谢产物结构上的差异，它与阻遏蛋白的结合往往是不可逆的。氨基酸类的结构类似物也不能用以合成具有正常功能的蛋白质，因此它在细胞中会达到较高的浓度。这都是用结构类似物为底物筛选抗阻遏菌株，较之用正常的分解代谢末端产物更为有效的原因。 如果结构类似物与调节酶相结合，所获得的便是抗反馈抑制的抗性菌株。筛选抗阻遏和抗反馈的双重突变则更易于获得高产菌株。对一末端产物的生成途径了解的愈加清楚，就能定向选育多重突变株，而得到过量生产。 菌种选育中常用的结构类似物列于表4—1。表中的类似物未区分其在作用机制上是抗阻遏或抗反馈，这是由于有的作用机制尚未完全弄清楚，有的则因菌种而异。 有些酶的合成可为铵盐、磷酸盐类所阻遏，用筛选对这类化合物的结构类似物有抗性的突变株的方法，也可达到脱阻遏的效果。如构巢曲霉的蛋白酶的合成可为铵盐所阻遏，筛选抗甲基铵盐的抗性突变株，其蛋白酶合成即不为铵盐所阻遏。 表4—1 结构类似物及代谢末端产物  5，解除反馈抑制——筛选抗反馈抑制突变株 如上所述，在生物合成途径中广泛存在着反馈抑制调节——末端产物抑制合成途径(包括分枝途径)中第一个酶的活力，因此，降低末端产物的浓度就能积累代谢途径中间体，如同由培养物中去除阻遏物一样，这种方法的实施比较困难，比较有效的方法是选育对末端产物有抗性的突变株。如天冬氨酸激酶是赖氨酸生物合成途径中的调节酶，由黄色短杆菌分离到对赖氨酸的类似物(2—氨基半胱氨酸)有抗性的突变株，它对天冬氨酸激酶的反馈抑制不敏感，赖氨酸的产量可达57mg／m1。 解除反馈抑制的另一种方法是选育营养缺陷型。即筛选丧失了合成途径中某种酶，而必需供给某一中间代谢产物才能生长的突变株。限量供给此中间代谢产物就能降低或解除末端产物的反馈抑制，而获得另—中间产物的过量产生。这在较简单的直线式合成途径中已获得不少成功的实例。 谷氨酸经过乙酰谷氨酸、乌氨酸、瓜氮酸而合成精氨酸(图4—7)。经诱变处理后得到的瓜氨酸营养缺陷型失去了合成催化鸟氨酸合成瓜氨酸的鸟氨酸转氨甲酰酶的能力，必需供给瓜氨酸或精氨酸时，此菌株才能生长。控制供给亚适量的精氨酸或瓜氨酸使菌体生长，但又不致引起反馈抑制时(精氨酸抑制N一乙酰谷氨酸激酶活力)，就能使鸟氨酸大量产生。如选育丧失精氨酸琥珀酸合成酶的精氨酸缺陷型，就能得到瓜氨酸的过量生产。 上述的直线式合成途径中，用营养缺陷型方法只能使中间代谢产物积累而不能使末端产物积累。在分枝途径中则能得到使末端产物过量产生的营养缺陷型突变。谷氨酸棒状杆菌的苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的合成是与分枝途径相联系的(图4-8)，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用，而获得赖氨酸的过量生产。这是因为仅有赖氨酸或苏氨酸存在时，天冬氨酸激酶不被抑制，只有两者的协同效应才能造成抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。 6，防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株 经诱变产生的高产菌株。在生产过程中易于发生回复突变，使生产不稳定。双重营养缺陷型发生回复突变的机率较小，易于获得遗传性较稳定的菌株；如筛选得到的是抗结构类似物的高产菌株，可在培养液中加入适量结构类似物，以防止回复突变株的增殖。利用高产株和回复突变株对抗生素敏感性的不同，加适量抗生素防止回复株增殖，也是一类方法。 负变菌株的回复突变株亦可用来提高代谢产物的过量产生。 在无阻遏物或末端代谢产物存在条件下选育不产酶的负变株，继续进行诱变后转接在阻遏物或末端产物存在的条件下筛选产酶突变株，有可能获得高产菌株。对其机制尚缺少深入研究。有的研究结果表明，抗阻遏突变株是启动基因突变的结果，抗反馈突变株是调节酶的变构中心发生了改变而催化中心未改变。 7，改变细胞膜的通透性 微生物细胞吸收作为代谢所需要的底物和离子是依靠定位在细胞膜上的主动物送系统来进行，与产能代谢过程相偶联。输送系统有高度的专一性，这主要取决于其蛋白质的组成，即透性酶。透性酶的合成与由其输送的酶类一样，也受着调节控制。细胞内形成的代谢产物排出细胞时，也与细胞膜的结构有关，有各种类型的排出方式。细胞质膜和细胞壁的结构也影响物质的进出。当控制物理、化学条件或者筛选细胞膜、细胞壁结构组成的突变株以改进物质的进出速率。影响代谢过程时，都有可能造成代谢产物的过量生产。 微生物细胞分泌到细胞外的蛋白质特别是水解酶类，大多数是糖蛋白。酶分子中结合糖类与酶的催化活力无关，估计主要是利于分泌至胞外。同一类酶系中的不合糖类的酶组分，往往是结合在细胞膜上而很少分泌至胞外。加入表面活性剂，则有可能因改变细胞膜的通透性而获得水解酶类的高产。由于表面活性剂种类繁多，性质各异，尚未有规律可循。如加入吐温80可增加里氏木霉纤维素酶产量，但对其它菌株就末得到同样效果。 8，筛选抗生素抗性突变株 抗生素种类繁多，其抑制微生物代谢的机制各不相同，一些主要抗生素的作用机制已比较清楚。筛选抗生素抗性突变体，也能取得由此而改变代谢调节，获得过量生产的结果。 衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的α—淀粉酶的产量较亲株提高了5倍，研究结果表明，是由于分泌机制改变的结果。抗利福平的蜡状芽抱杆菌的无芽孢突变株的β—淀粉酶产量提高了7倍，这是由于芽孢形成的延迟利于β—淀粉酶的形成，而抗利福平的突变株往往失去了形成芽抱的能力。谷氨酸捧杆菌的抗青霉素突变株的谷氨酸产量亦会增加。 对金属离子的抗性和对有丝分裂的抑制剂抗性的突变株，也被用于改变细胞代谢调节以 得到代谢产物的高产。 9，选育条件抗性突变株 因环境不同，能表现为“野生型”菌株的特性和突变型菌株特性的突变被称为条件抗性 突变或称为条件致死突变。其中温度敏感型突变常被用于提高代谢产物的产量。 适于在中温条件下(如37℃左右)生长的细菌，经诱变后可得到在较低温度下生长而在较高温度(如37℃以上)不能生长的突变株，即温度敏感型突变株。这是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温条件下活力丧失的缘故。如此酶为蛋白质、核苷合成途径上的酶，则此突变株在高温条件下的表型就是营养缺陷型。诱变处理乳糖发酵短杆菌，得到的温度敏感突变株，在30℃生长良好，在32℃生长微弱，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸，而野生型菌株却受生物素的反馈抑制。在富含生物素的天然培养基中进行发酵时，可先在正常温度下进行培养以得到大量菌体，适当时间后提高温度，就能获得谷氨酸的过量生产。经多次诱变后得到的高产菌株，往往是孢子形成能力减弱或丧失，这给保种传代都带来困难。筛选在低温下能形成芽孢的温度敏感突变株，就能解决此困难。 10，调节生长速率 在酶的诱导合成研究中发现，一些物质具有诱导效应及难被利用；与其只能维持较低的生长速率有关。而起阻遏作用的物质则部是易被迅速利用和能维持高的生长速率。估计这是因为诱导、阻遏的发生都与产能代谢有关而造成的。因此，改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率，也能获得一定效果。 里氏木霉纤维素酶的大量合成是在菌体大量形成时，如控制它的比生长速率近于零，则能在一较长时间内持续合成纤维素酶并获得高产。 11， 加入酶的竞争性抑制剂 生物化学上把底物和抑制剂与酶相结合时呈现的互相排斥现象称为竞争性抑制，即酶与抑制剂结合后就不能与底物相结合，反之亦然。 葡萄糖经不完全氧化(酵解)生成丙酮酸，脱羧生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环。乙酰辅酶A与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化，把乙酰基由乙酰辅酶A转移至草酰乙酸而成为柠檬酸。柠檬酸又因乌头酸酶的存在而和它的异构体顺乌头酸、异柠檬酸呈平衡。单氟乙酸在微生物细胞内可转变为单氟柠檬酸，此酸与乌头酸酶有竞争性抑制，因此，向培养基中加入单氟乙酸可导致柠檬酸的积累，减少异柠檬酸的生成。由此，筛选不能利用柠檬酸或对单氟 乙酸敏感的突变袜，都达到了提高柠檬酸产量和减少异柠檬酸生成的结果。这些突变株的乌头酸酶的活力都比较低。 二、提高次级代谢产物产量的方法 次级代谢产物是指细胞生长不必需的、无明显生理功能的微生物代谢产物。其结构往往比较复杂，虽对产生菌的生长不是必需的，但在自然环境中对产生菌的存活还是有益的。从分子结构上看，次级代谢产物可分为糖苷类、多肽类、酰基类、核苷类及混杂类。它们均来自初级代谢产物，为其直接衍生物，或者经分子结构上的修饰，或进一步装配、聚合而成。其合成过程远较初级代谢产物复杂。 初级代谢产物的形成一般只需简单的营养条件，在化学成分确定的培养基中即可生成。而次级代谢产物则需要复杂的营养条件，往往需要供给营养成分复杂的天然物质时才能形成。在各种条件下，初级代谢产物都能形成，而次级产物则往往仅在一特定培养条件下才能形成，尤其过量生产。在分批培养条件下，次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。在发酵过程中如何使次级代谢产物进入分化期，即次级代谢产物形成的诱导或引发，是发酵工艺研究中的热门之一。生理学上的研究表明，在菌体生长峰值过后，培养基中可利用的C、N、P、S等主要元素已基本耗完，与这些原料的利用有关的酶活力趋于下降，与次级代谢产物形成有关的酶类逐渐出现。但是，菌体生长与产物合成两个时期的划分及相应的这些生理特性的变化还取决于培养条件。’ 目前，次级代谢产物的生产都还是沿用分批发酵方法，抗生素类的产物在此条件下又多为在菌体生长速率下降后才积累，但又难以长期持续合成。因此，通过控制培养条件以尽量 维持次级代谢产物的合成期，亦是获得过量生产的重要途径。常用的提高次级代谢产物产量的方法有以下几种： 1，补加前体类似物 在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。如青霉素G的生产中，苯乙酰—CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。青霉素分子是6-APA环形成后，再形成不同侧链。加入不同的前体就可以得到不同种类的青霉索，补加苯氧乙酸即得到青霉素V。多肽类和放线菌素类抗生索的合成中，也都能通过加入不同前体而得到不同种类的抗生素。这也可以称之为定向合成 。 加入硝酸盐可提高利福霉索的产量，其原因在于它抑制了脂肪酸的合成，使合成脂肪的前体丙二酰-CoA转为利福霉素分子的脂肪环提供前体。 次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这部是在生产应用中需综合考虑的。 2，加入诱导物 把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量，如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。 3，防止碳分解代谢阻退或抑制的发生 青霉索发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，早已是一项很有效的提高产量的方法。 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解阻遏的发生。 加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。 4，防止氮代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。 使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。 为防止碳、氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 5，筛选耐前体或前体类似物的突变抹 加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体育抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产；如抗苯乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。 半胱氨酸、缬氨酸是 内酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的类似物，三氟亮氨酸、DL-缬氨酸的抗性菌株，其β-内酰胺类抗生索产量会提高。 6，选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生索产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生索的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果已有不少报道。 7，筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代谢产物都来自初级代谢产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低，但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不清楚，估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。在金霉素产生菌选育中，运用此方法曾获得高产菌株。 8，抗毒性突变株的选育 重金属离子、羟胺类物质对β-内酰胺类抗生素产生菌有毒，但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗生素类物质过量产生的突变株。曾由头孢霉素C对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。 以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。但是，微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的，研究得比较清楚的只是少数。因此，上述方法的应用往往也是经验性的。 在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。 三、高浓度微生物的培养 1，为什么要采用高浓度微生物的培养？ 微生物液体发酵大都采用分批培养，这种培养方式的缺点是：发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大大提高发酵设备的利用率，降低生产成本。基于这种目的，人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。例如用高细胞浓度连续培养技术，培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2)，可得到95g／L的菌体。用同样的方法培养酒精酵母可得到219g／L的菌体。而一般用分批法培养酵母和细菌，得到的菌体浓度仅为10g／L左右。2，高细胞浓度培养技术的原理： 采用一定的工艺技术，保证微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。 3，高细胞浓度培养技术的优点 （1）可大大提高发酵设备的利用率 （2）节省能源 4，高浓度细胞培养的方法 （1）流加培养 要保持微生物生长的适宜环境条件以达到高菌体浓度，就必须采用恰当的流加补料方式，补充生长所需的所有营养物。 因渗透压的影响，在分批式培养中，不能靠过高地提高培养基浓度来获取高浓度的细胞采用流加技术，可不断地满足菌体生长繁殖的需要，最终可以获得高浓度的细胞。采用流加培养技术，还可以实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等。这类技术还有一大优点是，无需增添设备，只需改进工艺就可以在生产上广泛应用。流加培养技术还可解决以下问题： 底物抑制：在许多发酵过程中，某些底物如乙醇和苯环类化合物，只有在低浓度情况下，才不抑制菌体的生长。在分批培养中，若提高这些底物的浓度，就会出现底物对生长的抑制。而在发酵过程中流加这类底物，控制它们在发酵液中的浓度，使之一方面能不断满足菌体生长的需要，另一方面又不会抑制菌体的生长，这样，底物抑制就能被消除。 分解代谢阻遏：如果微生物利用葡萄糖等易于代谢的碳源，代谢产生的物质会使细胞内的环腺苷酸浓度降低，造成某些酶终止合成，这种现象称分解代谢阻遏。在流加培养过程中，缓慢流加这种碳源，可消除分解代谢阻遏作用。 葡萄糖效应：培养面包酵母时，存在一临界葡萄糖浓度，培养基中葡萄糖高于此浓度时，会部分代谢成乙醇，甚至在有充足溶解氧的条件下也会产生乙酵，此现象称葡萄糖效应。采用流加技术，可以控制葡萄糖浓度在此临界浓度以下，这样就可以防止乙醇产生，得到高浓度的面包酵母。 为了实现需氧微生物的高浓度培养，需要一个能供给大量氧气的高性能发酵罐。溶解氧浓度[DO]需要保持在每升几个微克以上，但也不能过高。大体上应该保持在10-9g／L以下。不过，需氧微生物培养中，最容易缺乏的营养物仍然是[DO]。完全可以说[DO]是高菌体浓度培养生长速率的控制因素。 碳源是最重要的营养物，要用恰当的方式自动流加。氮源可结合pH控制与碳源一起流加，并利用氨气传感器或铵离子选择电极等实行自动流加控制。微生物生长至少需要十几种无机离子，很难对这么多离子的浓度进行连续检测，因而无法对其浓度进行反馈控制，可以与碳源或氮源同时自动流加。加料流量根据物料衡算确定，所有营养物都可通过计算机控制自动流加。流加培养的控制方式无反馈控制 恒速流加 变速流加 指数流加 反馈控制 DO-恒定控制pH-恒定控制CO2生成速率控制细胞浓度控制底物浓度控制 （2）高细胞浓度连续培养 原理：无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心。膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。 除去抑制物质的方法：透析培养：通过半透膜使培养液与培养基接触，培养液中的细胞不能透过半透膜，只有反应产物透过膜进入培养基溶液。在透析培养中，透析装置有两个作用。一是将生长抑制性物质透过膜排出培养罐，从而减少或排除抑制作用。二是使培养基贮罐中的营养物透过膜进入微生物培养罐，以补充其消耗。 萃取发酵：就是向发酵罐内加入难溶于水的有机溶剂，选择性地萃取抑制生长的物质，从而减轻有毒产物对发酵速率的抑制作用。这种操作方式的主要目的是获得尽量多的代谢产物，同时可减轻有毒产物对微生物生长的抑制作用，从而提高菌体浓度。这时需要选择分配系数大、对微生物毒性小的廉价溶剂。有人用这种方法对丙酮及丁醇发酵进行了研究。 过滤培养：是利用一种只能使培养液通过而不能使微生物通过的微滤膜边过滤边培养的方法。过滤的同时还必须同时流加物料。作为微滤膜可采用能够灭菌的精密陶瓷或合成高分子材料。培养液高速流过膜表面，滤液沿着与过滤膜垂直的方向通过膜流出，因此称为错流过滤。有人将这种培养方式用于乳酸菌和二裂殖茵培养的研究中。 菌体循环利用 这种方法大致过程是：待分批发酵终了将菌体与发酵液分离，收集的菌体经去杂菌等处理后返回发酵罐，再加入无菌培养基进行第二批发酵，因发酵液中菌体浓度很高，故发酵时间可大大缩短。第二批发酵终了，进行同样处理，然后再开始第三批发酵；这种技术与前面所述两种技术原理不同，但也能起到缩短发酵时间、提高设备利用率的作用。 （3）高细胞浓度培养中的问题 A，培养基流加控制与其他条件控制 培养基的流加控制分反馈控制与无反馈控制两类。反馈控制依据反馈控制参数如溶解氧、pH、呼吸商等数据变化，通过改变流加速度从外部控制。无反馈控制是根据微生物的代谢特征及生产要求制定流加曲线，井按曲线进行流加。由于高浓度细胞的积累，pH、溶解氧等都需要进行调节以满足菌体生长与产物合成的最优条件。 B，菌体分离装置的效能 在高细胞浓度连续培养中，采用的各种细胞分离设备存在一些问题。例如，用膜分离菌体时，菌体在膜表面沉积会造成膜过滤效率降低；用离心机分离菌体容易造成污染；这些问题都需要新工艺新材料来解决。 C，菌种退化 对基因工程菌来说，这一问题尤为重要。因为工程菌中的重组质粒往往不稳定，容易在传代中丢失，丢失掉重组质粒的工程菌不产生目的产物。因此，用高细胞浓度培养法培养工程菌时，还要考虑能保持质粒稳定的工艺条件。