发酵工程 精品课程
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
华东理工大学 ·生物工程学院
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
第二章：菌种的来源
? 微生物的特性及工业微生物的要求
? 一些工业化产品生产菌种的特点
? 自然界中有目的微生物分离的原则
? 菌种选育、分子育种
菌种的来源
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第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性
? 有些微生物能在厌氧的条件下生长
? 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自
身的生长
? 有些微生物能进行复杂的代谢
? 有些微生物能利用较复杂的化合物
? 有些微生物能在极端的环境下生长
菌种的来源
?微生物的特性及工业微生物的要求
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二：工业化菌种的要求
?能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物
?有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的
可操作性要强
?遗传性能要相对稳定
?不易感染它种微生物或噬菌体
?产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
?生产特性要符合工艺要求
菌种的来源
?微生物的特性及工业微生物的要求
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放线菌（链霉素
四环素；红霉素
等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，
目前发现的生物来源如下：
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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二、氨基酸生产有关的微生物
代谢控制发酵, 用 人工诱变的方法,有意识地改变微生
物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地
称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是
发酵工业发展历史上的一个转折点：
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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HD:高丝氨酸脱氢酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸 和异亮氨酸的合成
调节机制
HT:高丝氨酸转乙酰酶
AK:天冬氨酸激酶
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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氨基酸生产菌的要求,代谢途径比较清楚，
代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种：
其它氨基酸生产菌：
棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小
杆菌属的棒型细菌
常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌
选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯
草芽孢杆菌
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于
食品用酶，美国需要得到 FDA的批准。目前已同意使用的
仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌
和地衣牙孢杆菌
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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三、常用的基因表达系统
(一 )原核生物,大肠杆菌 (1977年 Boyer)、枯草牙胞杆菌
沙门氏菌
? 生长迅速、蛋白产量高 ;
? 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；
? 外源基因的导入相对容易；
? 已建立了整套表达理论及技术,
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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(二 ) 真核细胞表达系统
? 酵母 (既是微生物又是真核细胞 )
? 生长迅速，营养要求不高，易培养；
? 安全性好；
? 比哺乳动物细胞操作简单；
? 具有一定的修饰蛋白的能力。
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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? 中国仓鼠卵巢细胞（ CHO细胞）表达系统
? 具有准确的转录后修饰功能；
? 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；
? 具有重组基因的高效扩增和表达能力；
? 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；
? CHO很少分泌自身的内源蛋白。
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产
我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生
产对于某一种特定的产品，只有特定的微生
物才具有大量表达的潜力。
问题,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
礼来 (Eli lilly),花了 10年的时间从 40万株微
生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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第三节 自然界中有目的微生物分离的原则
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
→ 产品的鉴定
如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的操作中使这种可能性实现
目的,高效地获取一株高产目的产物的微生物
问题,
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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二、采样时要注意的问题
?气候、水分、空气
?来源要广
?结合产品的特点
?标签：地点、时间、气候等
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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?富集的三种方案：
? 定向培养,采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。
三、目的微生物富集的一些基本方法
?富集的目的,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变
得可能。
? 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
类学中考虑，
? 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
时只能通过随机分离的办法
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等，表 2-2 （ P31）
但主要是通过培养的方法
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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定向培养的富集方法
1,底物 2,pH条件
3,培养时间 4,培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速
度的手段，培养（固体、液体；分批
连续）后使目的微生物在种群中占优
势。
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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四, 菌落的选出
? 从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单, 快速的鉴定方法, 如抗生素 （ P35）
? 从形态的角度
菌落的外观形态, 是微生物的一个重要表征 。 如多糖
产生菌在适当的培养基上生长, 从具有粘液性的菌落外观
上就可以初步识别 。
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 （ 国家七五攻关项目 ）
采样 （ 造纸厂 ） → 80度 30分钟处理
文献,产生菌为中性牙孢杆菌, 嗜碱牙孢杆菌, 放线菌及霉菌
0.0075%曲利本蓝＋ 1%CMC（ 羧甲基纤维素 ）, pH10.5
培养 3～ 4天, 选择有凹陷圈的菌落
从 285个土样中获得 62株
26株为组成型
36株为诱导型
↓
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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例：醛肟水解酶的筛选 --Journal of biotechnology 94(2002),65-72
培养基中含 0.05% of Z-PAOx
每隔 2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基
不断分析样品,2-3个月后 Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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五, 目的微生物富集方法的研究进展
?分子生物学的实验手段, 在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用 。 如,16SRNA同
源性分析, 基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等
? 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的 1%。 微生物的
多样性及资源的开发 仍然是今后若干年的研究重点 。
2002,陈文新（科学院院士）
? In contrast to this traditional approach,modern molecular biology
techniques allow for DNA library expression screening,which also
enables access to enzymes of `nonculturable' organisms,By this strategy,
for instance,the company Diversa (San Diego,CA,USA) identised 120
unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from
an alkaline soil sample.
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～ 81
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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第四节 菌株选育, 分子改造
目的
? 提高生产能力
? 提高产品质量
? 开发新产品
? 解决生产实际问题
? 防止菌种退化
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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方法
基因突变,自然选育、诱变育种
基因重组,杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化,点突变、易错 PCR、同序法
DNA Shuffling等
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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自然状态下, 碱基对发生自然突变的机率为 10-8～ 10-9
自然突变有两种情况,
一种是我们生产上所不希望看到的, 表现为菌株的衰
退和生产质量的下降, 这种突变成为负突变 。
另一种是我们生产上希望看到的, 对生产有利, 这种突
变成为正突变 。
一, 自然选育
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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自然选育在工业生产上的意义
自然选育虽然突变率很低, 但却是工厂保证稳产高产的
重要措施 。
回复突变,高产菌株在传代的过程中, 由于自然突变导致
高产性状的丢失, 生产性能下降, 这种情况我们称为回复
突变
问题,高产菌株是正突变高，还是负突变高？
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化 。
单细胞 (孢子 )悬液的制备
平板分离
挑选单菌落 (注意形态的观察 )
发酵试验
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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二, 诱变育种
用各种物理, 化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选,
称为诱变育种
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
诱变剂 物理在：紫外, 快中子
化学：硫酸二乙酯, 亚硝基胍{
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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（ 二 ）, 诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
诱变剂量的选择
诱变剂的选择
出发菌株的选择
（ 一 ）, 诱变剂的作用原理 （ 略 ）
压硝酸,0.07MNa2HPO4
亚硝基胍,1MNaOH
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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（ 三 ）, 诱变育种的一般步骤 (p83)
（ 四 ）, 筛选的方法
? 随机筛选
? 形态
? 理性化筛选
从产物形成的生理生化途径着手, 进
行有的放矢的筛选 。 如结构类似物抗
性, 营养缺陷型等, 筛选而产生的这
些特性, 称为遗传标记 。
结构类似物,在化学和空间结构上和代谢的中间物 （ 终产物 ）
相似, 因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物 （ 终产物 ）
的功能, 但细胞不能以其作为自身的营养物质 。
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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HD:高丝氨酸脱氢酶
黄色短杆菌中赖氨酸 的合成调节机制
HT:高丝氨酸转乙酰酶
AK:天冬氨酸激酶
结构类似物抗性, Lys的类似物 AEC,Thr的类似物 AHV
营养缺陷型, 如 Thr缺陷型
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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黄色短杆菌 F9-50的诱变谱系
Bervibacterium flavum
As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -,Thr -) 20.8 g/l
F9-50 (leu -,Thr -,AECr) 33.5 g/l
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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三, 基因的直接进化 (directed evolution)
? 突变
基因突变库的建立
? 筛选
基因突变库的筛选
? 基因复制与遗传
步骤：
在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过
高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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主要应用：
酶学性能的提高,
? pH
?温度
?有机溶剂
生理环境 → 工业催化环境
?底物专一性
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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脂酶拆分 2-甲基癸酸硝基苯酯例：
PLA
PLA光学拆分选择性 (%)
2 31 57 75 81 90
5次错位 PCR 2次定点突变
Reetz (1997) Liebeton(2000)
第二章 菌种的来源
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
定
点
突
变
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错位 PCR
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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DNA Shuffling:指 DNA分子的体外重排，是基因在
分子水平上进行有性重组 (Sexual Recombination)。
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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X XXX
X XX X
XX X
XXX X
XX X
X XXX
XX X
X XX X
XXX X
X XXX
XX X
X XX X
XXX X
XX XXX X
XX XXX X X X X X XX X
Fragment Reassemble Select best
with DNAseI fragments recombinants
Repeat for multiple cycles
DNA shuffling
菌种的来源
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菌种的来源
?菌株选育、分子改造
项目 进化速度 进化对象 进化周期 影响对象 突变效率
常规定向
进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 低
DNA
Shuffling 快速进化
特定基因 /
操纵子 /病毒 几天 部分基因组 高
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
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类 型 示 例 特 性 活性增加倍数 潜在应用领域
抗 体 人源抗体 亲和性 400 生物制药
酶 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10,000 生物制药
β -内酰胺酶 抗生素抗性 32,000 抗生素
枯草杆菌蛋白酶 E 耐热性65℃ 耐热时间 17200 工业酶
细胞因
子
人类干扰素 抗病毒 285,000 基因治疗
肿瘤抑制因子 P53 37℃ 半衰期 12 基因治疗
代谢途
径
砷酸盐代谢途径 砷酸盐解毒 40 生物制药
汞代谢途径 汞解毒 12 生物制药
部分 DNA Shuffling技术的研究成果
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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本章小节：
? 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有
特定的 微生物 (动、植物 )才具有大量表达的潜力；
? 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是
自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；
? 目前土壤中已分离的微生物不到总数的 1%，微生
物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；
? 基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生
物产品开发的进程。
菌种的来源
?小节
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第二章：菌种的来源
? 微生物的特性及工业微生物的要求
? 一些工业化产品生产菌种的特点
? 自然界中有目的微生物分离的原则
? 菌种选育、分子育种
菌种的来源
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第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性
? 有些微生物能在厌氧的条件下生长
? 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自
身的生长
? 有些微生物能进行复杂的代谢
? 有些微生物能利用较复杂的化合物
? 有些微生物能在极端的环境下生长
菌种的来源
?微生物的特性及工业微生物的要求
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二：工业化菌种的要求
?能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物
?有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的
可操作性要强
?遗传性能要相对稳定
?不易感染它种微生物或噬菌体
?产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关）
?生产特性要符合工艺要求
菌种的来源
?微生物的特性及工业微生物的要求
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
放线菌（链霉素
四环素；红霉素
等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，
目前发现的生物来源如下：
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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二、氨基酸生产有关的微生物
代谢控制发酵, 用 人工诱变的方法,有意识地改变微生
物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地
称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是
发酵工业发展历史上的一个转折点：
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
HD:高丝氨酸脱氢酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸 和异亮氨酸的合成
调节机制
HT:高丝氨酸转乙酰酶
AK:天冬氨酸激酶
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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氨基酸生产菌的要求,代谢途径比较清楚，
代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种：
其它氨基酸生产菌：
棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小
杆菌属的棒型细菌
常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌
选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯
草芽孢杆菌
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于
食品用酶，美国需要得到 FDA的批准。目前已同意使用的
仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌
和地衣牙孢杆菌
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
三、常用的基因表达系统
(一 )原核生物,大肠杆菌 (1977年 Boyer)、枯草牙胞杆菌
沙门氏菌
? 生长迅速、蛋白产量高 ;
? 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；
? 外源基因的导入相对容易；
? 已建立了整套表达理论及技术,
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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(二 ) 真核细胞表达系统
? 酵母 (既是微生物又是真核细胞 )
? 生长迅速，营养要求不高，易培养；
? 安全性好；
? 比哺乳动物细胞操作简单；
? 具有一定的修饰蛋白的能力。
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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? 中国仓鼠卵巢细胞（ CHO细胞）表达系统
? 具有准确的转录后修饰功能；
? 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；
? 具有重组基因的高效扩增和表达能力；
? 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；
? CHO很少分泌自身的内源蛋白。
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产
我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生
产对于某一种特定的产品，只有特定的微生
物才具有大量表达的潜力。
问题,生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
礼来 (Eli lilly),花了 10年的时间从 40万株微
生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：
菌种的来源
?已工业化产品生产菌的介绍
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第三节 自然界中有目的微生物分离的原则
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
→ 产品的鉴定
如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的操作中使这种可能性实现
目的,高效地获取一株高产目的产物的微生物
问题,
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
二、采样时要注意的问题
?气候、水分、空气
?来源要广
?结合产品的特点
?标签：地点、时间、气候等
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
?富集的三种方案：
? 定向培养,采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。
三、目的微生物富集的一些基本方法
?富集的目的,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变
得可能。
? 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
类学中考虑，
? 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
时只能通过随机分离的办法
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等，表 2-2 （ P31）
但主要是通过培养的方法
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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定向培养的富集方法
1,底物 2,pH条件
3,培养时间 4,培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速
度的手段，培养（固体、液体；分批
连续）后使目的微生物在种群中占优
势。
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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四, 菌落的选出
? 从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基
利用简单, 快速的鉴定方法, 如抗生素 （ P35）
? 从形态的角度
菌落的外观形态, 是微生物的一个重要表征 。 如多糖
产生菌在适当的培养基上生长, 从具有粘液性的菌落外观
上就可以初步识别 。
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 （ 国家七五攻关项目 ）
采样 （ 造纸厂 ） → 80度 30分钟处理
文献,产生菌为中性牙孢杆菌, 嗜碱牙孢杆菌, 放线菌及霉菌
0.0075%曲利本蓝＋ 1%CMC（ 羧甲基纤维素 ）, pH10.5
培养 3～ 4天, 选择有凹陷圈的菌落
从 285个土样中获得 62株
26株为组成型
36株为诱导型
↓
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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例：醛肟水解酶的筛选 --Journal of biotechnology 94(2002),65-72
培养基中含 0.05% of Z-PAOx
每隔 2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基
不断分析样品,2-3个月后 Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc
五, 目的微生物富集方法的研究进展
?分子生物学的实验手段, 在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用 。 如,16SRNA同
源性分析, 基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等
? 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的 1%。 微生物的
多样性及资源的开发 仍然是今后若干年的研究重点 。
2002,陈文新（科学院院士）
? In contrast to this traditional approach,modern molecular biology
techniques allow for DNA library expression screening,which also
enables access to enzymes of `nonculturable' organisms,By this strategy,
for instance,the company Diversa (San Diego,CA,USA) identised 120
unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtained from
an alkaline soil sample.
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～ 81
菌种的来源
?自然界中有目的微生物分离的原则
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第四节 菌株选育, 分子改造
目的
? 提高生产能力
? 提高产品质量
? 开发新产品
? 解决生产实际问题
? 防止菌种退化
菌种的来源
?菌株选育、分子改造
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方法
基因突变,自然选育、诱变育种
基因重组,杂交、原生质体融合、基因工程
基因的直接进化,点突变、易错 PCR、同序法
DNA Shuffling等
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自然状态下, 碱基对发生自然突变的机率为 10-8～ 10-9
自然突变有两种情况,
一种是我们生产上所不希望看到的, 表现为菌株的衰
退和生产质量的下降, 这种突变成为负突变 。
另一种是我们生产上希望看到的, 对生产有利, 这种突
变成为正突变 。
一, 自然选育
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自然选育在工业生产上的意义
自然选育虽然突变率很低, 但却是工厂保证稳产高产的
重要措施 。
回复突变,高产菌株在传代的过程中, 由于自然突变导致
高产性状的丢失, 生产性能下降, 这种情况我们称为回复
突变
问题,高产菌株是正突变高，还是负突变高？
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自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化 。
单细胞 (孢子 )悬液的制备
平板分离
挑选单菌落 (注意形态的观察 )
发酵试验
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二, 诱变育种
用各种物理, 化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选,
称为诱变育种
诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂
诱变剂 物理在：紫外, 快中子
化学：硫酸二乙酯, 亚硝基胍{
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（ 二 ）, 诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
诱变剂量的选择
诱变剂的选择
出发菌株的选择
（ 一 ）, 诱变剂的作用原理 （ 略 ）
压硝酸,0.07MNa2HPO4
亚硝基胍,1MNaOH
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（ 三 ）, 诱变育种的一般步骤 (p83)
（ 四 ）, 筛选的方法
? 随机筛选
? 形态
? 理性化筛选
从产物形成的生理生化途径着手, 进
行有的放矢的筛选 。 如结构类似物抗
性, 营养缺陷型等, 筛选而产生的这
些特性, 称为遗传标记 。
结构类似物,在化学和空间结构上和代谢的中间物 （ 终产物 ）
相似, 因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物 （ 终产物 ）
的功能, 但细胞不能以其作为自身的营养物质 。
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HD:高丝氨酸脱氢酶
黄色短杆菌中赖氨酸 的合成调节机制
HT:高丝氨酸转乙酰酶
AK:天冬氨酸激酶
结构类似物抗性, Lys的类似物 AEC,Thr的类似物 AHV
营养缺陷型, 如 Thr缺陷型
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黄色短杆菌 F9-50的诱变谱系
Bervibacterium flavum
As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -,Thr -) 20.8 g/l
F9-50 (leu -,Thr -,AECr) 33.5 g/l
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三, 基因的直接进化 (directed evolution)
? 突变
基因突变库的建立
? 筛选
基因突变库的筛选
? 基因复制与遗传
步骤：
在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过
高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。
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主要应用：
酶学性能的提高,
? pH
?温度
?有机溶剂
生理环境 → 工业催化环境
?底物专一性
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脂酶拆分 2-甲基癸酸硝基苯酯例：
PLA
PLA光学拆分选择性 (%)
2 31 57 75 81 90
5次错位 PCR 2次定点突变
Reetz (1997) Liebeton(2000)
第二章 菌种的来源
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定
点
突
变
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错位 PCR
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DNA Shuffling:指 DNA分子的体外重排，是基因在
分子水平上进行有性重组 (Sexual Recombination)。
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X XXX
X XX X
XX X
XXX X
XX X
X XXX
XX X
X XX X
XXX X
X XXX
XX X
X XX X
XXX X
XX XXX X
XX XXX X X X X X XX X
Fragment Reassemble Select best
with DNAseI fragments recombinants
Repeat for multiple cycles
DNA shuffling
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项目 进化速度 进化对象 进化周期 影响对象 突变效率
常规定向
进化 缓慢进化 整个基因组 多年 完整基因组 低
DNA
Shuffling 快速进化
特定基因 /
操纵子 /病毒 几天 部分基因组 高
DNA Shuffling与常规定向进化的比较
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类 型 示 例 特 性 活性增加倍数 潜在应用领域
抗 体 人源抗体 亲和性 400 生物制药
酶 天冬氨酸转氨酶 催化特异性 10,000 生物制药
β -内酰胺酶 抗生素抗性 32,000 抗生素
枯草杆菌蛋白酶 E 耐热性65℃ 耐热时间 17200 工业酶
细胞因
子
人类干扰素 抗病毒 285,000 基因治疗
肿瘤抑制因子 P53 37℃ 半衰期 12 基因治疗
代谢途
径
砷酸盐代谢途径 砷酸盐解毒 40 生物制药
汞代谢途径 汞解毒 12 生物制药
部分 DNA Shuffling技术的研究成果
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本章小节：
? 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有
特定的 微生物 (动、植物 )才具有大量表达的潜力；
? 传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是
自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；
? 目前土壤中已分离的微生物不到总数的 1%，微生
物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；
? 基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生
物产品开发的进程。
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?小节
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