发酵工程 精品课程
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华东理工大学 ·生物工程学院
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第四章 种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求
种子制备实例
种子制备的技术概要
种子的扩大培养
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种子扩大培养是指将保存在砂土管, 冷冻干燥管中处
休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后, 再经过扁瓶或
摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯
种过程 。 这些纯种培养物称为种子 。
第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念,
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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种子扩培的目的
? 接种量的需要
? 菌种的驯化
? 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
?总量及浓度能满足要求
?生理状况稳定，个体与群体
?活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
?无杂菌污染
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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第一节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
斜面菌种 → 一级种子培养 → 二级种子培养
→ 发酵
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，氯化钠 0.5
琼脂 2%,pH 7.0-7.2
培养基特点,有利于菌体的生长，原料比较精细
培养条件,32℃,生长 18-24小时
生长斜面要求,生长良好，所使用斜面连续传代不超过
3次
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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2,一级 种子（摇瓶）
培养条件：于 1000ml三角瓶中，装液 200-250ml,32℃ 培
养 12小时。
培养基：葡萄糖 2%，尿素 0.5%，玉米浆 2.5%，
K2HPO4 0.1%
培养基特点,有利于菌体的生长，所使用的原料已经基
本接近于发酵培养基
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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3,二级种子 (种子罐 )
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的 1%(10%)），
32℃ 培养 7-10个小时
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，
浓度为 2.5%
培养基的特点,长菌体，更接近于发酵培养基
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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种子的质量要求：
108-109个 /ml
大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0 -7.2
活力旺盛
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子 → 发酵
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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一、斜面孢子
培养基：甘油,葡萄糖,蛋白胨等
培养基特点, 有利于长孢子，用量少而精细
培养条件,25℃, 7天,注意湿度 50%左右
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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二、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养基的特点, 成本低、米粒之间结构疏松提高比表
面积和氧的传质，营养适当（要求大米
的白点小）有利于孢子的生长。
培养条件,25℃, 7天，控制湿度
大米孢子的要求, 1粒米含 1.4*106个孢子
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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3、一级种子
培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
目的, 长菌体
培养条件,27℃, 40小时
接种量,200亿孢子 /吨
4、二级种子
培养基：同上
培养条件,27℃, 10-14小时
接种量,10%
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于
Ⅲ — Ⅳ 期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为 6个期,1-4为年青期，
4-6期合成青霉素的能力最强
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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第二节 种子制备的技术概要
一、种子制备的过程
实验室阶段,不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实
验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，
因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段, 种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归
为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间
阶段。
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终
的培养物可分为两类：
? 对于不产孢子和芽孢的微生物
—— 获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培
最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培
养。
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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? 获得一定数量和质量的孢子
菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种
子，但操作繁琐。
?对于产孢子的微生物
? 获得一定数量和质量的菌丝体
便于操作，但需要更仔细的控制。
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基
应该是有利于孢子的生长 。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，
因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较
精细。
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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3、起始接种物的传代问题
? 细菌
保藏斜面 → 活化斜面
? 产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的,使菌种的传代次数尽可能的少。
种子的扩大培养
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三、生产车间阶段
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
? 缩短发酵时间
? 有利于获得好的发酵结果
菌丝体比孢子要有利：
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应
首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所
以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于
发酵培养基，这有两个方面的原因,
一是成本 二是驯化
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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例,柠檬酸发酵
?以蔗糖为原料
成分 斜面 种子罐 发酵
麦芽汁 麦汁
蔗糖 2.5-5% 20%
NH4NO3 0.225% 0.11%
K2HPO4 0.03%
MgSO4.H2O 0.025% 0.025%
KCl 0.015%
琼脂 2%
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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? 薯干粉
成分 斜面 种子罐 发酵
麦芽汁 麦汁
薯干粉 10% 22-28%
(NH4)2SO4 0.5%
琼脂 2%
种子的扩大培养
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3、发酵级数的确定
谷氨酸：三级发酵
一级种子（摇瓶） → 二级种子 （小罐） → 发酵
青霉素：三级发酵
一级种子 （小罐） → 二级种子（中罐） → 发酵
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，
工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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发酵级数确定的依据
? 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
? 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般 2-4级。
? 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要
的一个方面
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东,发酵科技通讯,2003,7
斜面 → 一级种子（ 1200ml/5000ml三角瓶） → 二级种子（ 2m3）
→ 三级种子（ 20m3)→ 发酵（ 240m3)
背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的 1%左右）
二级种子大种量（种子罐是发酵罐的 5%以上）
文章：三级种子工艺
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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用途 成分（ %） 规模
保藏 牛肉膏 （英国） 1，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）
1.8,无机盐
斜面 添加 0.1的口服葡萄糖，其余同上
一级 口服葡萄糖 3,玉米浆 2.4，尿素 0.65，无机盐等 1200 ml
/5000 ml
二级 玉米淀粉双酶糖 2.0,玉米浆 2.0,甘蔗糖蜜 1.0,
尿素 0.35,无机盐等
1.2 / 2 m3
三级 玉米淀粉双酶糖 4.0,玉米浆 1.5,甘蔗糖蜜 1.0,
液氨，复合维生素 01 mg/L,无机盐等
12 / 20 m3
发酵 玉米淀粉双酶糖 13-14,玉米浆 0.06-0.08,甘蔗
糖蜜 1.0,液氨，维生素 50 g,无机盐等
154 / 240
m3
培养基成分表
种子的扩大培养
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三级种子的特点：
① 种量更大，生长速度快：
工艺 8小时产酸
（ %）
12小时产酸
（ %）
发酵周期（ h)
三级种子 2.2～ 2.7 4.6～ 5.2 32
二级种子 1.0～ 1.5 2.6～ 3.4 35
② 糖酸转化率高且稳定
工艺 产酸（ %） 糖酸转化率
（ %）
单罐产量 (吨）
三级种子 10.93 59.8 21
二级种子 9.8 58 18
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4、接种量的确定
移入种子的体积
接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为
7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
P 147
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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接种量对菌体形态和产 Υ亚麻酸的影响
杨博,中国油脂,2002
Υ 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体
前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病
治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理
功能。因发酵法生产 Υ 亚麻酸与从天然植物提取相比具有一
系列优点，发酵法生产 Υ 亚麻酸成了当今研究的一个热点。
Υ 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的
形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵 Υ 亚麻酸
时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
种子的扩大培养
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采用被孢霉进行 Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
种子的扩大培养
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本研究发现，采用被孢霉进行 Υ亚麻酸发酵时接种量可以明
显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和 Υ 亚麻酸产量。
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种子的扩大培养
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不同接种量影响菌体的生长和发酵
种子的扩大培养
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发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高
发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
种子的扩大培养
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20%种子罐＋ 10%发酵罐前期发酵液效果最好
种子的扩大培养
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5、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐
或发酵罐时的培养时间。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化 。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较
大，但是最终由实验结果定。
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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舒琴,林产化学与工业,2004
镜检,24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期
30小时开始出现芽孢
种子的扩大培养
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6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质, 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）
理化指标,C,N,P的含量,pH
酶活等
无污染
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
种子的扩大培养
?小节
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第四章 种子的扩大培养
种子扩大培养的目的与要求
种子制备实例
种子制备的技术概要
种子的扩大培养
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种子扩大培养是指将保存在砂土管, 冷冻干燥管中处
休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后, 再经过扁瓶或
摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯
种过程 。 这些纯种培养物称为种子 。
第一节 种子扩大培养的目的与要求
种子扩大培养的概念,
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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种子扩培的目的
? 接种量的需要
? 菌种的驯化
? 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
?总量及浓度能满足要求
?生理状况稳定，个体与群体
?活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
?无杂菌污染
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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第一节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程
斜面菌种 → 一级种子培养 → 二级种子培养
→ 发酵
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏 1%，氯化钠 0.5
琼脂 2%,pH 7.0-7.2
培养基特点,有利于菌体的生长，原料比较精细
培养条件,32℃,生长 18-24小时
生长斜面要求,生长良好，所使用斜面连续传代不超过
3次
种子的扩大培养
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2,一级 种子（摇瓶）
培养条件：于 1000ml三角瓶中，装液 200-250ml,32℃ 培
养 12小时。
培养基：葡萄糖 2%，尿素 0.5%，玉米浆 2.5%，
K2HPO4 0.1%
培养基特点,有利于菌体的生长，所使用的原料已经基
本接近于发酵培养基
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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3,二级种子 (种子罐 )
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的 1%(10%)），
32℃ 培养 7-10个小时
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，
浓度为 2.5%
培养基的特点,长菌体，更接近于发酵培养基
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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种子的质量要求：
108-109个 /ml
大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0 -7.2
活力旺盛
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子 → 发酵
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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一、斜面孢子
培养基：甘油,葡萄糖,蛋白胨等
培养基特点, 有利于长孢子，用量少而精细
培养条件,25℃, 7天,注意湿度 50%左右
种子的扩大培养
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二、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养基的特点, 成本低、米粒之间结构疏松提高比表
面积和氧的传质，营养适当（要求大米
的白点小）有利于孢子的生长。
培养条件,25℃, 7天，控制湿度
大米孢子的要求, 1粒米含 1.4*106个孢子
种子的扩大培养
?种子扩大培养的目的与要求
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3、一级种子
培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
目的, 长菌体
培养条件,27℃, 40小时
接种量,200亿孢子 /吨
4、二级种子
培养基：同上
培养条件,27℃, 10-14小时
接种量,10%
种子的扩大培养
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种子的质量要求
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于
Ⅲ — Ⅳ 期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为 6个期,1-4为年青期，
4-6期合成青霉素的能力最强
种子的扩大培养
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第二节 种子制备的技术概要
一、种子制备的过程
实验室阶段,不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实
验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，
因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段, 种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归
为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间
阶段。
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二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终
的培养物可分为两类：
? 对于不产孢子和芽孢的微生物
—— 获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培
最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培
养。
种子的扩大培养
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? 获得一定数量和质量的孢子
菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种
子，但操作繁琐。
?对于产孢子的微生物
? 获得一定数量和质量的菌丝体
便于操作，但需要更仔细的控制。
种子的扩大培养
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2、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基
应该是有利于孢子的生长 。
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，
因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较
精细。
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3、起始接种物的传代问题
? 细菌
保藏斜面 → 活化斜面
? 产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的,使菌种的传代次数尽可能的少。
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三、生产车间阶段
1、培养物的选择原则
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
? 缩短发酵时间
? 有利于获得好的发酵结果
菌丝体比孢子要有利：
种子的扩大培养
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2、培养基选择的原则
目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应
首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所
以营养要比发酵培养基丰富。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于
发酵培养基，这有两个方面的原因,
一是成本 二是驯化
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例,柠檬酸发酵
?以蔗糖为原料
成分 斜面 种子罐 发酵
麦芽汁 麦汁
蔗糖 2.5-5% 20%
NH4NO3 0.225% 0.11%
K2HPO4 0.03%
MgSO4.H2O 0.025% 0.025%
KCl 0.015%
琼脂 2%
种子的扩大培养
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? 薯干粉
成分 斜面 种子罐 发酵
麦芽汁 麦汁
薯干粉 10% 22-28%
(NH4)2SO4 0.5%
琼脂 2%
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3、发酵级数的确定
谷氨酸：三级发酵
一级种子（摇瓶） → 二级种子 （小罐） → 发酵
青霉素：三级发酵
一级种子 （小罐） → 二级种子（中罐） → 发酵
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，
工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
种子的扩大培养
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发酵级数确定的依据
? 级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
? 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般 2-4级。
? 在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要
的一个方面
种子的扩大培养
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采用三级种子的谷氨酸发酵工艺
李文东,发酵科技通讯,2003,7
斜面 → 一级种子（ 1200ml/5000ml三角瓶） → 二级种子（ 2m3）
→ 三级种子（ 20m3)→ 发酵（ 240m3)
背景：二级种子小种量（种子罐是发酵罐的 1%左右）
二级种子大种量（种子罐是发酵罐的 5%以上）
文章：三级种子工艺
种子的扩大培养
?种子制备的技术概要
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用途 成分（ %） 规模
保藏 牛肉膏 （英国） 1，蛋白胨（日本），琼脂粉（日本）
1.8,无机盐
斜面 添加 0.1的口服葡萄糖，其余同上
一级 口服葡萄糖 3,玉米浆 2.4，尿素 0.65，无机盐等 1200 ml
/5000 ml
二级 玉米淀粉双酶糖 2.0,玉米浆 2.0,甘蔗糖蜜 1.0,
尿素 0.35,无机盐等
1.2 / 2 m3
三级 玉米淀粉双酶糖 4.0,玉米浆 1.5,甘蔗糖蜜 1.0,
液氨，复合维生素 01 mg/L,无机盐等
12 / 20 m3
发酵 玉米淀粉双酶糖 13-14,玉米浆 0.06-0.08,甘蔗
糖蜜 1.0,液氨，维生素 50 g,无机盐等
154 / 240
m3
培养基成分表
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三级种子的特点：
① 种量更大，生长速度快：
工艺 8小时产酸
（ %）
12小时产酸
（ %）
发酵周期（ h)
三级种子 2.2～ 2.7 4.6～ 5.2 32
二级种子 1.0～ 1.5 2.6～ 3.4 35
② 糖酸转化率高且稳定
工艺 产酸（ %） 糖酸转化率
（ %）
单罐产量 (吨）
三级种子 10.93 59.8 21
二级种子 9.8 58 18
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4、接种量的确定
移入种子的体积
接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为
7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
P 147
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接种量对菌体形态和产 Υ亚麻酸的影响
杨博,中国油脂,2002
Υ 亚麻酸是一种人体必需多价不饱和脂肪酸，它是人体
前列腺素的前体物质，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病
治疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要的生理
功能。因发酵法生产 Υ 亚麻酸与从天然植物提取相比具有一
系列优点，发酵法生产 Υ 亚麻酸成了当今研究的一个热点。
Υ 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行，丝状真菌的
形态往往对发酵有较明显的影响，而丝状真菌发酵 Υ 亚麻酸
时菌丝体形态的不同对发酵的影响很少有报道。
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采用被孢霉进行 Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
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本研究发现，采用被孢霉进行 Υ亚麻酸发酵时接种量可以明
显影响菌丝体的形态，从而影响菌体干重和 Υ 亚麻酸产量。
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不同接种量影响菌体的生长和发酵
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发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高
发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
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20%种子罐＋ 10%发酵罐前期发酵液效果最好
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5、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐
或发酵罐时的培养时间。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化 。
原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较
大，但是最终由实验结果定。
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舒琴,林产化学与工业,2004
镜检,24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期
30小时开始出现芽孢
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6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质, 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等）
理化指标,C,N,P的含量,pH
酶活等
无污染
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本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
种子的扩大培养
?小节
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