现代生物技术制药工艺学赵广荣第一讲 生物技术制药概论第二讲 基因工程生物构建第三讲 基因工程菌发酵制药工艺第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺第五讲 基因工程药物检测与质量控制第一讲 生物技术制药概论第一节 生物技术药物一、生物技术药物
1.分类生物技术药物：利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、
治疗和诊断功能的药品，包括具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。
生物药物：
20世纪 80年代,用现代生物技术生产的治疗性药物,基于重组 DNA技术和杂交瘤技术生产的药物,不包括直接从天然组织,血液等中提取的治疗性蛋白质 。
随着生物技术的发展,以核酸为基础的治疗性药物也属于生物药物 。
除了治疗性药物外,也包括体外诊断试剂 。
在制药领域,生物技术药物,生物技术产品,
生物技术制品互换使用 。
美国制药研究与制造者 （ PhTMA） 在其相关的报告中经常使用生物技术药物 。
生物技术药物包括重组 DNA,单克隆抗体,
杂交瘤和细胞系生产的药物,也包括细胞和组织来源的药物及基因治疗药物 。 虽然与生物药物的范畴有重叠,但生物技术药物的范围更大 。 生物药物是 15～ 20年以前药物的一个亚类,生物技术药物的历史较长,含义广 。
生物技术就是整合自然科学和工程科学,
获得应用生物,生产细胞产品和分子产品 。
所以生物技术药物应该包括任何生物技术手段和方法 （ 部分或全部 ） 生产的药物,包括传统生物技术方法,如非重组蛋白,从天然资源如微生物中分离提取的抗生素或半合成抗生素,植物来源的提取药物和细胞培养药物 。
按照来源可把生物技术药物分为微生物药物,植物药物和动物 （ 包括人 ） 药物等 。
制造工艺：化学合成药物,生物合成药物,
半合成药物和中药制造生产技术,微生物发酵药物,植物组织培养药物,动物细胞培养药物,动物组织和血液制剂药物,免疫抗体药物等 。
化学本质和特征：重组药物,基因药物,天然药物和合成,半合成药物 。
重组药物：重组多肽和蛋白质药物,细胞因子,受体,单克隆抗体和基因工程抗体,重组疫苗和重组多价疫苗等 。
基因药物：反义核酸药物,基因治疗药物,
DNA疫苗和核酶等 。
天然药物：来自动物,植物,微生物和海洋生物的天然产物 。
生化药物：包括从动物组织或脏器等中分离提取的氨基酸类,多肽和蛋白质类,酶与辅酶类,核酸及其衍生物类,多糖类,脂类,
生长因子类等药物 生物技术药物 生物药物重组蛋白质 是 是单克隆抗体 是 是天然材料中直接提取的多肽,蛋白质 是 否治疗性基因药物 是 是反义寡核苷酸 （ 直接化学合成 ） 是 否反义寡核苷酸 （ 生物酶法合成 ） 是 是直接化学合成的多肽 否 否天然材料中获得的抗生素,半合成抗生素 是 否植物来源的天然药物或半合成药物 是 否细胞或组织制剂 是 否在有关法规中,经常出现的术语是生物制品 (中国,美国使用 )或生物反应修饰剂 （ 美国使用 ）,
生物医药产品 （ 欧盟使用 ） 。
美国 FDA对生物制品的定义是病毒,治疗性血清,
毒素,抗毒素,疫苗,血液,血液成分及其衍生物,变应原性制剂及类似产品,胂凡钠明及其衍生物,用于预防,治疗疾病 。
这个定义并没有包括所有生物来源的药物 。 传统的生物制品包括疫苗,类毒素,血液制品和代谢制剂,但现在也包括重组蛋白质和核酸药物 。 生物反应修饰剂是激素,神经活性物质,免疫活性物质的总称,它们在细胞水平上起作用 。
中国的生物制品规程也对生物制品的定义：
以微生物,寄生虫,动物毒素,生物组织为起始材料,采用生物学工艺或分离纯化技术制备,并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂,包括菌苗,疫苗,毒素,类毒素,免疫血清,血液制品,免疫球蛋白,抗原,抗体,变态反应原,细胞因子,激素,酶,发酵产品,单克隆抗体,DNA重组产品和体外免疫诊断制品等 。
生物制品分类：
预防用生物制品 治疗用生物制品 诊断用品菌苗 抗血清与抗毒素 细菌学试剂疫苗 血液制品 免疫试剂类毒素 细胞因子 临 床 化 学 试剂
2.重要的微生物药物抗生素：链霉素,头孢霉素；链霉菌,青霉菌氨基酸：谷氨酸等 20余种,放线菌,真菌维生素：维生素 A,B2,霉菌,丙酸菌,酵母核苷酸和核苷：肌苷酸和肌苷,杆菌,放线菌,
酵母,青霉酶：淀粉酶,纤维素酶,蛋白酶,天门冬酰胺酶,
链激酶,葡激酶；米曲霉,黑曲霉,链霉菌酶抑制剂：洛伐他丁,辛伐他丁；曲霉,链霉菌免疫调节剂：环孢菌素 A；光泽柱孢菌,链霉菌抗生素,一类在低浓度下就能选择性地抑制或影响其它生物的生命过程的次级代谢产物 。
天然抗生素约 9000种,
半合成抗生素有 7000多种,
具有临床应用价值的近 500种,
已经大规模工业生产的抗生素达 100多种 。
种类 药物举例 生产菌 抗菌机理与应用
β 内酰胺类 头孢霉素 头孢霉 抑制细胞壁氨基糖苷类 链霉素 链霉菌 抑制蛋白合成大环内酯类 红霉素 链霉菌 抑制蛋白合成多烯类 两性霉素 链霉菌 破坏细胞膜四环素类 四环素 链霉菌 抑制蛋白合成糖肽类 万古霉素 无枝酸菌 抑制细胞壁多肽类 杆菌肽 杆菌 破坏细胞膜蒽环类 柔红霉素 链霉菌 抑制 RNA和 DNA合成 。
3.重要的植物药物很多植物来源的药物已经能化学合成,还有一部分直接分离提取,或修饰加工的半合成药物 。 其中部分已经用植物细胞大规模培养进行生产 。
生物碱：阿托品,可卡因,吐根,奎宁,长春碱,
长春新碱,喜树碱,秋水仙碱水杨酸：阿司匹林；萜类,紫杉醇香豆素,双香豆素甾体,地高辛,洋地黄苷酶：脲酶,无花果蛋白酶
4.重要的动物药物从动物组织或器官中直接分离提取,蛋白质类药物可以用基因工程技术制造,非蛋白质药物包括甾体类激素,皮质类甾体和前列腺素等,大多数已化学合成 。
胰腺：胰岛素,高血糖素,胰蛋白酶,胰酯酶,
胰凝乳酶,Dnase,弹性蛋白酶脑：脑磷脂,神经磷脂垂体：生长素,促黄体激素,加压素,促卵泡激素,促皮质激素肝脏：维生素,肝细胞生长因子,肝素,RNA
胸腺：胸腺素,胸腺肽血液：凝血酶,凝血因子,血红素,血红蛋白,
SOD,血浆,白蛋白,免疫球蛋白,纤溶酶甲状腺,鳃：降钙素胃黏膜：胃蛋白酶,胃膜素,双岐因子,凝乳酶尿：绒膜促性激素,尿激酶心脏：细胞色素 C,辅酶 Q
蛋清：溶菌酶二、重要的重组生物药物
1,激素类药物激素是由内分泌腺或特异细胞产生的含量极低一类小分子,通过信使功能,起专一生理效应 。
人胰岛素：胰岛细胞,前胰岛素原 跨膜运输,切除 23 aa信号肽,86 aa的 胰岛素原 。 高尔基体形成二硫键,切除 C肽,成熟的胰岛素分泌到胞外,进入血液循环 。 成熟的 胰岛素 由 AB双链组成,A链
21aa,B链 30aa,3对二硫键 。
生理功能广泛,能促进糖原合成和糖酵解,产生 ATP,降低血糖含量,保持能量供应 。 重组人胰岛素,发达国家取代猪或牛胰岛素,用于临床,主要治疗 I型糖尿病 。
生长素,垂体前叶分泌的一种促进生长的激素 。 人生长素是 191 aa的 单链球蛋白,2对二硫键 。 生长素具有促进氨基酸的运输和蛋白质,核酸的合成代谢,刺激新骨形成和红细胞生成,加速生长 。
重组人生长素用于治疗侏儒病,慢性肾功能衰竭,
烧伤,创伤等 。
心钠素即心房利钠多肽 （ 心房利钠因子 ）,是一个家族,心钠素,脑钠素,C型利钠肽 。 心钠素家族的三个成员分子为环状结构,N端和 C端为链状,
1对二硫键在环内,存在高度保守序列和区域 。 人心钠素由 28个氨基酸残基组成,人脑钠素由 32个氨基酸残基组成 。 重组人心钠素日本上市,用于心衰治疗,我国也进入临床实验 。
降钙素,甲状腺滤泡旁细胞产生的激素,生理功能是调节钙磷代谢,维持内环境的稳定 。
33 aa的多肽激素,不同种类活性差异较大,非脊椎动物如鱼类比哺乳动物的活性高 。 目前使用的是天然提取的猪,人,鳗鱼,化学合成的等 。
基因工程重组鲑鱼钙降素于 1999年在欧洲上市 。
主要用于骨质疏松,高钙血症,Paget’s病等,骨量减少,更新机能障碍等疾病的治疗 。
高血糖素：低血糖症；
促甲状腺素：治疗和诊断促卵泡激素：停止排卵和超排卵种类 商品名胰岛素 Humulin,Novolin,Humalog,Lantus
生长素 Humatrope,Nutropin,Saizen,
BioTropin,Genotropin，
Norditropin,Protropin,Serostim
高血糖素 Glucogen
促甲状腺素
Thyrogen
促卵泡激素
Conal F,Puregon,Follistin
2.细胞因子药物细胞因子：各种细胞合成并分泌的小分子多肽类因子,调节机体的生理功能,参与细胞的增殖,
分化,免疫,移植排斥,凋亡等过程 。
干扰素,IFN-α,β,γ,ε ω,τ 。 IFN-α约有 25
种亚型,165－ 166 aa,2个二硫键,无 N－糖化位点 。 IFN-β 有 4个亚型,166 aa,1个二硫键 。 IFN-
γ有 4以上个亚型,由 143个氨基酸残基组成,无二硫键,2个 N－糖化位点 。
重组 α,β,γ干扰素均已上市,α治疗白血病,慢性病毒感染如乙肝,丙肝,单纯疱症病毒等,β
治疗多发性硬化症,γ治疗类风湿关节炎等 。
白细胞介素,
介导白细胞之间相互作用的一些细胞因子,现已命名至 IL－ 23。 只有 IL-2和 IL-11被开发成基因工程药物而上市 。 IL－ 2由 133 aa组成,1个链内二硫键,
糖蛋白 。 IL－ 11由 178 aa组成,无二硫键和糖基化 。
IL－ 2用于癌症辅助治疗,IL－ 11与 G－ CSF联合使用,纠正化疗导致的粒细胞和血小板减少症 。
集落刺激因子,是指能刺激造血细胞在半固体培养基上形成细胞集落的细胞因子,是一类造血细胞生长因子 。 M－ CSF,GM－ CSF,Multi－ CSF，
EPO,SCF,TPO等 。
粒细胞集落刺激因子 G-CSF是 174 aa,2对二硫键 。
GM-CSF是 127 aa,2对二硫键 。 M-CSF是 522 aa，
3对二硫键 。 它们都具有 N－糖化位点,有信号肽,
分泌时被切除 。
重组人 G-CSF,GM-CSF,M-CSF均已上市,刺激骨髓中粒细胞和巨噬细胞增殖,集落形成,增强免疫,用于血细胞减少症,再生障碍性贫血及化疗放疗癌症的辅助治疗 。
EPO是 165 aa的高度糖基化蛋白,2个二硫键,糖基 （ 主要为唾液酸 ） 对活性至关重要 。 重组 EPO
用于治疗透析性贫血或其他贫血,是治疗肾功能衰竭导致贫血的首选药物 。
SCF:重组人 SCF主要作用于早期造血干细胞,范围广,但专异性差,还具有种属特异性,单独使用活性低 。 可与其他因子协同作用产生不同的联合效应 。 一般与 G-SCF联合使用,刺激粒细胞增殖 。 与 EPO联合,刺激早期红细胞的增殖,对细胞肥大也有增殖作用 。
生长因子 GF:对细胞生长具有促进作用的因子,表皮生长因子 EGF,成纤维细胞生长因子 FGF,转化生长因子 TGF,血小板生成素 TPO。
EGF,53 aa,3对二硫键 。 重组人 EGF已在国内外上市,大肠杆菌和酵母细胞表达 。 主要外用,治疗烧伤,溃疡和外伤及外周神经系统疾病 。
FGF：碱性成纤维细胞生长因子 bFGF和酸性成纤维细胞生长因子 aFGF,等电点分别为 5.4和 9.8，
它们的生物学活性相似 。 其实 FGF是一个家族,
其成员已经鉴定出 22个,重组 FGF主要外用,治疗烧伤及外周神经系统疾病 。
TNF：肿瘤坏死因子,杀灭肿瘤 。 巨噬细胞产生
TNF-α,T细胞产生 TNF-β 。 TNF具有广泛生物学效应,参与免疫细胞激活和炎症反应,具有抗感染,抗病毒,抗肿瘤的作用 。 国外重组 TNF已进入临床阶段,用于肿瘤治疗,与化疗联合使用 。
TPO,332 aa。 重组 TPO已进入临床阶段,主要用于肿瘤病人的化疗所致血小板减少症 。
种类 商品名
IFN-α1b 赛诺金,干扰灵
IFN-α2a ReferonA,福康泰,来福隆,迪恩安,因特粉,贝尔芬
IFN-α2b IntronA,Rebetron,Alfatronol,Virtron,安达芬,隆化诺,
保守 IFN-α Infergen
IFN-β Betaferon,Betaseron,Avonex,Redif
IFN-γ1b Actimmune
IL-2 Proleukin,辛格尔,德路生,悦康仙,英路因,安特鲁克
IL-11 Neumega
EPO Epogen,Procrit,Neorecormon,宁红欣,依普定,益比奥
GM-CSF Leukine,里亚尔
G-CSF Neupogen,吉粒芬
PDGF Regranex
TNF-α Beromun
3.溶血栓药物类溶血栓药物是纤溶酶原激活剂 PA通过激活无活性的血浆纤溶酶原 PLG,形成有活性的纤溶酶 PLM.
催化血栓的主要基质纤维蛋白水解,使血栓溶解,
畅通血管 。 纤溶酶原激活剂有,
组织型纤溶酶原激活剂 tPA;
尿激酶原激活剂 uPA,哺乳动物产生的可直接激活 PLG，
而由细菌产生的链激酶 SK和葡激酶 SAK,可间接激活
PLG。
TPA:527 aa的糖蛋白,有 17对二硫键,3个糖基化位点 。
细菌表达产物野生型 tPA分子量大,未形成产品 。 哺乳动物细胞 （ CHO） 表达重组 tPA已在美国于 1987年上市,第一个用动物细胞大规模生产的重组蛋白质药物 。
改型 tPA:rPA和 TNK-tPA。
RPA:是 tPA cDNA缺失突变后,用大肠杆菌表达的单链无糖基化蛋白质,355aa,效果与重组 tPA相同,生产成本低,血浆中半衰期延长 。 TNK-tPA:
是 tPA个别氨基酸突变后,由 CHO表达的糖基化双链蛋白 。 527 aa。 PA,tPA,rPA和 TNK-tPA均已上市 。
uPA:是从人胚肾细胞培养液或新鲜尿液中提取的溶栓药 。 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂由 411个氨基酸残基组成,有 12对二硫键,目前美国 Abbot公司从人胚肾细胞培养株生产 scu-PA,德国 Grunenthal
公司用大肠杆菌表达 scu-PA,活性高于哺乳动物细胞表达的糖基化 scu-PA。
SK:从溶血性链球菌培养液中提取分得到,415 aa，
是最早用于临床的溶栓药 。
SAK:金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体所分泌的,136
aa,是单链无二硫键的蛋白质 。 直接从细菌培养液中分离纯化困难,含量很低 。 现已经克隆了该基因,并实现了大肠杆菌和枯草杆菌表达,工程菌的产量占总蛋白质的 10%－ 15％ 。
水蛭素,从水蛭中发现的一种凝血酶抑制剂,是溶血栓的有效辅助药物 。 天然水蛭素是酸性多肽,
含有 65个氨基酸 。 水蛭素可用大肠杆菌和酵母表达,1998年美国,德国等批准重组脱硫酸酯水蛭素上市,应用于预防血栓和肝素相关的血小板减少症 。
4.受体,黏附分子药物细胞表面分子包括受体和黏附分子 。 受体与其配体结合后,经信号传导,引起细胞的功能和行为发生改变 。 黏附分子是由细胞产生的介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子,分布于细胞表面 。
很多黏附分子就是受体 。 根据人类白细胞分化抗原的国际协作组会议的命名,把识别同一分化抗原的单克隆抗体归为同一个分化群 CD,许多黏附分子和受体被命名为 CD分子 。 在多数情况下,CD
分子和黏附分子或受体的名称可以通用 。
重组 CD分子与天然的 CD竞争性结合配体,作为阻断剂,封闭信号传导,治疗天然 CD分子功能异常引发的疾病 。
与抗体相比,重组 CD分子没有免疫应答反应,安全性好 。 但存在问题要求真核表达系统,技术设备和条件要求高,规模生产较困难,成本高；半衰期短,给药量大 。 其策略是采用与抗体结合,
在 CD分子的 C端融合 IgG的 Fc片段,表达融合蛋白,
形成免疫黏附素 。 已上市的有 Immunex公司的可溶性 TNF受体 II－ Fc融合蛋白,用于治疗类风湿关节炎和慢性心衰 。 其他的进入临床阶段的可溶性
CD54,可溶性 IL－ 4受体,可溶性 LFA－ 3/IgG1融合蛋白等 。
5.重组融合蛋白药物将两种或两种以上的功能蛋白质的基因重组,产生新的融合蛋白质,可发挥超越其单分子的生物学活性 。 主要有细胞因子之间融合,如 IFN-γ /IL-
2,IFN-γ /TNF2,IL-2/IL-6,GM-CSF/IL-3。 细胞因子与抗原或抗体之间的融合,如 Id/GM-CSF、
Id/IL2,Id/IL4等,细胞因子部分可大大提高 Id部分的抗原性 。 细胞因子与毒素或抑制因子之间融合,白喉毒素 /IL-2,GM-CSF/LIF等 。
上市的重组融合蛋白药物有 Ontak,IL-2融合的白喉毒蛋白,靶向治疗皮肤 T细胞淋巴瘤 。 Enbrel是
TNF可溶性受体融合 IgG片段,治疗类风湿性关节炎 。
三,疫苗主要用于健康人群的一类预防性生物药物 。 包括蛋白质,多糖,核酸等 。
根据病原生物体分类：
菌苗,细菌性抗原制剂 ;疫苗,病毒性抗原制剂,
但现在统称为疫苗 。
根据制造技术分类：
传统疫苗包括灭活疫苗,减毒活疫苗和亚单位疫苗；新型疫苗是指用基因工程技术研制的疫苗,
基因工程亚单位疫苗,载体疫苗,核酸疫苗,多抗联合疫苗,重组多价疫苗等 。
基因工程疫苗：用重组 DNA技术克隆保护性抗原基因,用表达出的抗原产物或重组体本身制备成疫苗 。
基因工程亚单位疫苗用微生物表达抗原,纯化后制备成疫苗 。 最成功的是酵母和 CHO表达的乙肝表面抗原,纯化后制备的乙肝疫苗,高效,价廉,
安全,已取代了传统的血源疫苗 。
蛋白质工程疫苗是对抗原基因进行改造,如突变,
缺失,插入等,增加免疫原性,扩大反应谱 。
核酸疫苗或基因疫苗是用能够表达抗原的基因制备成的疫苗 。 其本质是核酸,可以是 DNA,也可以是 RNA。
基因工程载体疫苗和基因缺失活疫苗：本质是菌苗,把抗原的基因重组到微生物体内,筛选得到用表达抗原基因的重组微生物,进而以微生物为载体制备成疫苗 。 多为活疫苗,载体为指定的微生物菌株,如痘苗病毒,脊灰病毒,腺病毒,卡介苗等 。 也可用非复制型载体,即微生物进入人体后,不能繁殖,但能进行 DNA的复制,转录和蛋白质的表达,能产生抗原刺激机体发生免疫反应,提高了载体的安全性 。
DNA疫苗,将外源目的基因片段构建在 DNA质粒中,重组后的 DNA导入机体后可表达目标蛋白,刺激机体的免疫系统,而达到预防某种疾病的生物制剂 。 DNA疫苗是质粒 DNA,它含有宿主疫苗应答的抗原基因 。
细菌减毒活疫苗卡介苗,伤寒疫苗,霍乱疫苗,
布氏菌疫苗,炭疽疫苗,痢疾疫苗病毒减毒活疫苗牛痘疫苗,脊髓灰质炎疫苗,麻疹疫苗,腺病毒疫苗,风疹疫苗,
黄热病疫苗,腮腺炎疫苗,甲肝疫苗,流感疫苗,水痘疫苗,轮状病毒疫苗,乙脑炎疫苗病毒全灭活疫苗流感疫苗,脊髓灰质炎疫苗,甲肝疫苗,乙脑炎疫苗,流行性出血热疫苗,斑疹伤寒疫苗细菌全灭活疫苗霍乱疫苗,百日咳疫苗,鼠疫疫苗,伤寒疫苗上市的灭活疫苗病毒亚单位疫苗乙肝疫苗,流感嗜血杆菌疫苗细菌亚单位疫苗肺炎链球菌疫苗,沙门氏 Vi多糖疫苗,
无细胞百日咳疫苗,A型和 C型脑膜炎球菌疫苗病毒结合疫苗类毒素细菌结合疫苗
B型流感嗜血杆菌疫苗,破伤风疫苗,
百喉疫苗上市的亚单位和结合疫苗二联疫苗甲乙型肝炎联合疫苗,乙型肝炎,B
型流感嗜血杆菌联合疫苗,麻疹,风疹联合疫苗 。
三联疫苗百白破联合疫苗,无细胞百白破联合疫苗,三价口服脊髓灰质炎减毒活疫苗,三价脊髓灰质炎灭活疫苗,麻疹,
流行性腮腺炎,风疹联合疫苗 。
上市的联合疫苗四联疫苗百白破,B型流感嗜血杆菌联合疫苗,
百白破,乙型肝炎联合疫苗,百白破,灭活脊髓灰质炎联合疫苗 。
五联疫苗百白破,B型流感嗜血杆菌,乙型肝炎联合疫苗,联合疫苗,百白破,
灭活脊髓灰质炎,B型流感嗜血杆菌联合疫苗 。
种类 药物 应用乙肝 Recombivax 乙肝疫苗二联疫苗
Comvax
Procomvax
抗乙型流感,乙疫苗肝联合疫苗
Tritantix 抗乙肝,白喉,破伤风,
百日咳疫苗联合疫苗
Twinix 抗甲乙肝免疫剂联合疫苗
Primavax 抗白喉,破伤风,乙肝疫苗含有 HBsAg的重组疫苗四,基因药物包括细胞因子,活性多肽,受体的基因,也称
DNA药物 。 广义的基因药物还包括反义核酸和基因转录调控的药物,主要针对基因遗传缺陷引起的疾病 。 将具有治疗意义的正常基因重组到真核表达载体上,用一定方法导入体细胞内,利用胞内的原料,进行基因的转录表达,合成并分泌释放蛋白质或肽产物,替换或封闭其中异常或致病基因,得到治疗相关疾病的目的 。 基因药物可望治疗 400余种遗传疾病 。
医药产业的第四次革命 。
基因药物还处于实验研究阶段,许多技术和伦理问题反义核酸药物是指用反义技术研制的药物 。 根据碱基互补原理,用人工合成或生物合成的特定互补寡核苷酸片段,与特定的基因或 RNA发生杂交,
抑制或封闭基因表达,阻断相应有害蛋白质的合成,干扰了遗传信息从核酸向蛋白质的传递,达到治疗疾病的目的 。
反义寡核苷酸药物是以 4种核苷酸为基础化学合成 。
天然的寡核苷酸很容易被体内的核酸酶降解,因此在合成的同时进行化学修饰,改变物化学性质,
降低核酸酶的敏感性,增加稳定性,生物利用度和靶基因的结合特异性 。
FDA批准 ISIS/CIBA Vision公司 Vitravene上市,第一个反义核酸药物,治疗艾滋病人晚期发生的视网膜炎 。
第二节 现代生物技术制药的特征药物制造过程包括基础设施的设计和布局、生物药物来源、上下游过程和最终产品的分析等几个阶段。
药物的制造必须受到高度严格控制，不仅药品安全、有效，而且制造过程的各个方面也都必须是安全、有效的。在制造过程中，药典和 GMP几乎是指导性的中心，对产品安全和有效性起关键作用。
现代生物制药的特点是技术含量高、智力密集，
全封闭自动化、全程质量控制，大规模生物反应器生产和新型分离技术综合利用。
一,生物药物的特性与制造技术的关系生物药物的特性生物材料本身成分复杂,除多糖,蛋白质,核酸,
脂类等高分子化合物外,还有糖蛋白等复合物 。
生物药物具有高活性,活性与结构有密切关系 。
低分子量的生物药物的活性往往取决于其手性异构体,不同的离体异构体其活性截然不同甚至相反 。 高分子量的生物药物活性不仅取决于其一级结构,还与其高级 （ 二级,三级,四级 ） 空间结构 （ 即构象 ） 密切相关,空间构象的破坏往往导致药物失活 。
酸,碱,有机试剂,重金属,热,光等因素敏感 。
所处的环境和介质影响其结构,生产中的机械剪切力,金属器壁的摩擦力,传热传质等过程不仅会影响细胞的活性与功能,也影响药物的活性 。
生产条件的变化对质量影响大,在工艺放大过程中应严格监测质量的动态变化,在分离纯化等过程必须采用措施防止变性失活 。
生物药物具有低稳定性,易受物理化学和生物因素的影响而变性失去活性 。 细胞破碎后,打破了原有的亚细胞布局,不再存在细胞隔室,药物失去了空间保护 。 一旦提取出来后,离体的药物,
容易受到理化因素的攻击,变性失去活性 。
生物药物具有易污染性,生物药物本身是活性生物分子,很易被腐生降解的低等生物所取食,引起腐败降解,同时可能产生热源和过敏原 。
生物药物具有用量少,价值高的应用性 。 生物药物在治疗,预防和诊断中的所用剂量较少,显示出很高的商业经济价值,驱动着生物药的不断创新和发展 。
影响生物药物活性的因素蛋白药物是以生物活性为基础的,下游及其制剂过程必须把活性下降降到最低限度 。 加工过程尽可能缩短处理时间,加入稳定剂,提高蛋白质的稳定性 。 蛋白质丧失活性和不稳定的原因包括 共价键与非共价键的破坏与生成,均可引起蛋白质不可逆降解和不稳定 。
蛋白质部分或全部蛋白变性共价键变化外消旋化,异构化脱酰胺作用,亚胺形成二硫键交换,糖链变化氧化,水解,光降解聚集表面吸附沉淀非共价键变化伸展 卷曲蛋白质在空气中发生自动氧化过程,由空气中的氧自发引起的游离基链式反应 。
温度对蛋白质是个很敏感的因素,温度升高使分子内的震动增强,从而破坏维系空间结构的次级作用使蛋白质变性 。
日光中的紫外线能量最大,生物药物样品受光催化的反应有变色,氧化和分解等 。
多数蛋白质在等电点范围内才稳定,超出此范围会迅速变性,液体样品保存时常用缓冲液控制 pH
值 。
有机溶剂存在时,它们的极性及介电常数小于水,
使肽链内的静电斥力增加,造成蛋白质分子膨化或松散 。
在溶液中加入盐类化合物也会影响蛋白质构象的稳定性 。 在低浓度的中性生理盐溶液中对蛋白质的构象不发生影响 。 但盐浓度较高时,盐离子有可能改变蛋白质内部的极性基团或改变溶剂性质使蛋白质稳定性发生变化,出现沉淀 。
表面活性剂,如十二烷基硫酸钠 （ SDS） 在低浓度时可与蛋白质结合,其表面带有大量负电荷,
阻止了复合物分子之间的聚集而不致凝集或沉淀 。
蛋白质的酸,碱水解是肽键的水解,使分子断裂成为分子量大小不等的肽段和氨基酸,在蛋白酶存在下会加速水解 。 即使非常有限的蛋白酶都会引起蛋白质活性的丧失 。 各种蛋白质对蛋白酶的敏感性与空间结构有关,紧密的结构能抵抗蛋白酶的攻击 。 保护蛋白质降解的策略是减少加工过程时间,并在低温下进行操作,使用一些特异性蛋白酶抑制剂 。 蛋白酶要在下游的早期除去,在后期的残存将严重影响产品活性 。
PMSF:丝氨酸蛋白酶,某些半胱氨酸蛋白酶苯甲眯,丝氨酸蛋白酶；胃酶抑制素,天门冬氨酸蛋白酶
EDTA:金属蛋白酶脱酰胺作用：谷氨酰胺与天冬门酰胺侧链酰胺的水解,形成谷氨酸与天冬门氨酸 。 较高温度,极端 pH能促进脱酰胺作用水解 。 脱酰胺化作用是胰岛素降解的主要途径 。 α 氨基 N进一步攻击侧链羰基,引起亚胺形成 。 亚胺引入新的负电荷可影响三级结构和稳定性 。
蛋白质用碱水解时,会使某些 L-氨基酸变为 D-氨基酸产生消旋作用 。
蛋白质中的氨基酸侧链容易被一些氧化剂氧化,
分子氧和氧自由基氧化 。 蛋氨酸可氧化成蛋氨酸亚砜使蛋白质失活,半胱氨酸可氧化成半胱磺酸或二硫键 。 可在最终产品中充 N2气或添加抗氧化剂 。
蛋白质聚集,蛋白分子结合的微观过程,可以是二聚体或大的低聚物,但仍保留在溶液中而影响生物活性 。
由于疏水的和静电作用,蛋白质和多肽吸附于容器,滤器或输液系统的表面,蛋白质溶液浓度较低时,吸附损失相对较高 。
蛋白质与吸附表面之间的相互作用随表面疏水性和蛋白质疏水性的增加而增加 。
膜滤过是现行蛋白质药物制剂灭菌滤过最常用的方法,在膜上蛋白质的吸附与失活是一个值得特别关注的问题 。
稳定蛋白质药物的策略为了较长时间保存蛋白质溶液,常常加入一些稳定剂进行保护 。 液体样品可用惰气驱除液中残存的氧,高浓度保存也是一条可行方法 。
蛋白质类：血清白蛋白,明胶；金属螯合剂,EDTA；
氨基酸：甘氨酸,丙氨酸,赖氨酸,苏氨酸糖类：葡萄糖,蔗糖,海藻糖,右旋糖苷多元醇：甘油,山梨醇,肌醇,聚乙二醇表面活性剂：聚山梨醇酯；中性盐：硫酸铵防腐剂：乙醇,苯酚,硫柳汞,醋酸苯汞,乙酯,
抗氧剂：焦亚硫酸钠,硫代硫酸钠,半胱氨酸二,生物制药的研发
1．研发过程生物制药研发的基本过程包括新药发现,原始特征,临床前试验,临床试验,制造与上市申请,
批准获得许可证,销售,售后监测,几个重要过程 。
新药发现的策略：随机筛选，基于作用机理的药物鉴定，但生物药物的研发往往是基于作用机理。
单因素的生物活性物质直接缺乏所致疾病，如缺乏胰岛素导致糖尿病，缺乏生长素会导致侏儒症，
由此开发胰岛素和生长素药物。多因素综合的复杂疾病，癌症和炎症。细胞因子类的干扰素和白介素，刺激免疫、调节炎症，治疗复杂疾病。
在很多情况下，生物药物的发现都是生理生化功能和分子进展的理性考虑，更准确地来说，就是机体自身的活性物质作为药物。 2000年，人类基因组测序的完成和蛋白组学研究的兴起，为基于基因组和蛋白组的生物药物设计，特别是蛋白质类和核酸类药物提供了大量的生物信息，成为药物研发的一个新热点。
植物、微生物也是生物药物地重要来源。在 20世纪 50年代以前，大量的药物就是从植物中发现的，
如地高辛、洋地黄毒苷、阿司匹林、可待因和紫杉醇等。目前，美国 100多种药物（约占 25％）最初来源于植物，尽管某些药物现在已经通过化学合成或半合成得以制造。
植物是潜在药物最丰富的来源，显花植物约 26.5
万种，到目前为止不到 1％的物种被用于药物筛选。
有两条途径从植物中筛选生物药物。一条途径种是收集营养体部分，最直接的随机筛选,虽然象紫杉醇这样的药物是相当成功的，但总体来说，
成功率仍较低。另一条途径是靶向筛选，如民族药材学 (ethnobotany)，研究植物与人之间的关系。
在这方面可以借鉴中药的经验，以提高中选率。
微生物特别是细菌和真菌已经证明是抗生素和抗癌药物的一个重要来源。目前发现并描述的微生物药物近 15000种，大约 2/3由放线菌产生，不少药物用于临床。
合理药物设计已经越来越成为药物发现的常规途径。大规模系统筛选天然或合成物质，已获得了大批现代药物。
在已知药物靶标的三维结构时，根据药物与靶标的相互作用，进行计算机模拟修饰已知药物，从而设计新药。靶标往往是蛋白质或酶或受体,X射线晶体结构和 NMR分析结果都可用于设计。
有很多分子模拟软件可供药物设计，这种设计的产物是小分子配体，如受体抑制剂，能准确进入靶标的活性位点区域，从而阻断受体活性，发挥药效。
对传统的随机药物筛选的一个改进就是组合化学库的高通量筛选，组合文库在较短时间内相对容易和低价合成，实际上许多大型制药公司拥有数十万个天然和合成的化合物。对于短多肽，化学合成也很容易。此外，各种生物文库，如噬菌体展示文库、酵母展示文库、酵母双杂交系统等可用于蛋白质类药物的筛选和发现。
对已发现的蛋白质药物进行突变改造和其他蛋白质如抗体、受体等融合，提高活性、延长半衰期是一种切实可行的途径。如 IL-2的 125位由半胱氨酸变为丝氨酸后，明显延长半衰期。 干扰素
IFNα 1c的 86位氨基酸 Cys突变后，失去形成二硫键巯基，提高了产物在大肠杆菌中表达的稳定性。
Amegen公司在 20世纪 80年代发现的 8种干扰素 α
的基础上，进行同源性分析，发现完全的相同位点 99个。从而设计合成了保守干扰素，对其中的数个氨基酸进行突变，只有在该位点出现频率高的氨基酸取代，共形成三种突变产物，其中
IFNcon-1（ Infergen）于 1997年批准上市。
多种溶栓蛋白药物的突变改造体也正在不同的试验研究阶段。
对于细胞因子类，改变其受体结合部位的氨基酸，
提高受体亲和力和结合能力，能提高其生物活性。
对 IFNα 1c的受体结合域 AB环 31,32位进行突变取代后，提高了抗病毒的生物活性。
一旦发现候选新药，就要鉴定其物理化学性质，
如结构、分子量、稳定性等。常常需要组合 2～ 3
种高分辨率的色谱纯化方法，以获得均质的初始蛋白质。所鉴定的特征可用于生产制造中的质量控制。完成特性鉴定后，可申报专利。
临床前测试药物的安全性、质量和有效性，包括药物代谢谱、药物动力学谱、生物利用度、急毒和长毒，免疫毒性、致癌性、诱变性、生殖毒性和致畸性等。
临床试验需要 5年甚至更长时间，而且新药申请专利受到保护。
根据生物药物的特点,临床前和临床试验均所需药物为几百克至 1公斤的活性成分即可 。
设计最适生产过程用于药物评价并有利于以后的放大是十分重要的 。
通常是实验室规模生产毫克级药物,用于研发和特征鉴定等 。
小规模生产克级药物,用于临床前和临床试验大规模生产百克至公斤级药物,用于商业药品销售 。
第三节 生物制药的发展历程制药工业的历史大约只有 60多年,但从开始就发展很快,目前全世界制药企业超过 10000家,生产制造 5000多种药物,其中约 100家为跨国公司现代制药工业的发展可追溯到 20世纪之交,那时只有 4种药物：洋地黄用于治疗各种心血管疾病,
奎宁用于治疗疟疾,吐根属植物提取物 （ 活性成分为生物碱 ） 用于治疗痢疾,水银用于治疗梅毒,
但当时缺乏安全性和有效性 。
随着生物学和有机化学的发展,能人工合成某些具有治疗作用化合物 。
1800：阿司匹林,从而导致了药物化学公司的诞生,Bayer和 Hoechst公司 。
直到 1930年代,制药工业才开始大发展 。 磺胺类药物的发现和化学合成是最初标志,能有效治疗很多细菌的感染 。 大规模工业化生产胰岛素也成为现实 。
1940年代大规模生产青霉素,此时,建立了很多现代的领头制药企业,如 Eli Lilly,Wellcome、
Glaxo,Roche等 。 早期的制药几乎都是化学合成的 。
一,天然生物材料的提取早期的生物药物是来自动物脏器和血液,即脏器制剂,以李时珍所著的本草纲目和中国药用动物志为典型代表,分别收录药物 1892种和药用动物
1500余种 。 属单方入药,简单加工制造,几乎没有规模,是以原料药为主 。 制品纯度低,有效成分不明确 。 某些脏器制剂仍然在欧亚地区特别是第三世界国家和日本使用 。
在 20世纪 50年代后,随着对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解,生产工艺技术提高,
分离和纯化制剂技术也完善,改变了原来的混合制剂,成为高纯度单一特异性组分的生化药物制剂,猪牛胰岛素,前列腺酶及激素二,传统微生物发酵阶段
1928年英国 Fleming发现了抗菌物质,1940年
FloreyChain等提取并证明了青霉素的疗效 。
起初沿用初级代谢产物的发酵条件,采用表面培养法生产青霉素 。
随后研发了搅拌发酵沉没法生产成功,提高了供氧和通气量,菌株选育,培养和深层发酵,提取技术和设备的研究取得了突破性进展,给抗生素生产带来了革命性的变化,开始了微生物工业时代 。 以后链霉素,金霉素,红霉素等抗生素出现,
抗生素成为制药业的独立门类 。 黑根霉一步生物转化孕酮为 11a-羟基孕酮,实现甾体类激素工业化三,酶工程技术的出现与应用酶工程是酶学和工程学相互结合渗透发展形成的,
以应用为目的,研发新酶并生产,分离和纯化,
包括酶的固定化及酶反应器及酶的分子设计等 。
在 20世纪 20年代,就出现了酶工程,以自然酶制剂在工业上大规模应用的特征,原料以动植物为主 。
1953年,Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂对羧肽酶,蛋白酶,核酸酶等进行固定,
产生了固定化酶技术 。
1969年,千畑一郎等用固定化氨基酰化酶技术拆分了 DL-氨基酸,生产 L-氨基酸,随后固定化天冬氨酸酶生产 L-天冬氨酸等,开创了固定化酶应用的局面 。
以后相继出现了化学修饰酶,人工酶,有机相酶反应等化学酶工程和遗传修饰,改变及克隆酶等生物酶工程,并且以微生物为酶工程的主要来源 。
在制药工业上的应用,酶制剂直接或间接应用于医药 ;生物转化,给已有药物添加基团,增加药效和功能 ;细胞固定化技术用于动物细胞培养制药 ;
酶抑制剂是低分子物质,对微生物本身无害,在人体有生理活性,是药物研发的一个重要方向 。
固定化大肠杆菌细胞 （ 产生青霉素酰化酶 ） 转化青霉素 G,V,除去侧链生产无侧链青霉素,即 6-
氨基青霉烷酸 。
固定化 5-磷酸二酯酶水解转化酵母 RNA,生产 5-
复合单核苷酸 。
固定化氨基酰化酶拆分化学合成的 DL-氨基酸,
产生有活性的 L-氨基酸 。
已上市的酶抑制剂 ;
阿卡波糖,抑制葡萄糖苷酶活性,降血糖 。
洛伐他汀抑制 3-羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶,降胆固醇 。
四,动物细胞培养技术
1838年 植 物 学 家 Schleiden和 1839 年 动 物 学 家
Schwann首次把细胞作为植物,动物的基本结构单元,创立了细胞学说,是 19世纪的三大发现之一 。
1885年德国 Roux用生理盐水培养鸡胚组织,1897
年 Loeb用血清和血浆培养结缔组织细胞,1907年
Harrison在无菌条件下离体成功地培养蛙胚神经组织,并使之生长,是现代动物细胞培养的开端 。
1923年 Carrel发明了卡士瓶培养法,1951年,
Earle等开发了培养基,动物细胞培养技术开始形成 。
动物细胞培养以成为重要的生物药物制造技术,
目前所用动物细胞：昆虫细胞,哺乳动物细胞,
鸡胚细胞等 。
动物细胞培养生产的药物有：病毒疫苗,如乙肝疫苗,脊椎灰质炎疫苗,狂犬疫苗等；非抗体免疫调节剂,如干扰素,白细胞介素,巨噬细胞激活因子等；多肽生长因子,如神经生长因子,成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,血清生长因子等；酶类,如组织血纤维溶酶原激活剂,VIII因子等；激素类如促黄体生成素,促滤胞素等 。 肿瘤特异抗原如癌胚抗原等；单克隆抗体；病毒杀虫剂如杆状病毒等；皮肤移植如单细胞培养等 。
五,植物细胞培养技术与转基因植物制药创始人德国 Haberlandt于 19世纪末期对植物细胞在培养液中培养,能存活一段时间 。 1902年他又对叶肉进行培养 。
到 30年代,利用组织培养可以使细胞分化成完整的植株,
Gautheret对烟草细胞,Nobercourt对萝卜细胞,White对杨树细胞成功培养 。
1958,Steward等从胡萝卜韧皮部组织培养出完整植株,
Visil Hildebrandt用烟草单细胞培养成可育完整植株,
1969,Nitch用花粉培养出单倍体植株,
1970,Steward用悬浮细胞培养出胡萝卜可育植株 。
Routier和 Nickell首先申请用植物细胞培养生产有机产物的专利 。
70年代以后,越来越多的植物被用来细胞培养,
快速繁育,离体保存和生产次生代谢产物 。
用高度分化的组织仍能培养发育成完整植株,即细胞的全能性是今天培养技术的基础 。
大规模细胞培养技术发展起来,如日本已开发
20000升搅拌斧式反应器生产烟草细胞 。
现在已生产的药物有奎宁,长春碱,吗啡,可卡因,莨菪碱,蛇根碱,阿托品,多巴,小檗碱等 。
农药有除虫菊脂,鱼藤酮等,食品类有紫草宁,
花青素和香精等 。
六,抗体工程技术抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫反应功能的球蛋白 。
1890年 Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素,
并建立了血清治疗法,开始了第一代抗体药物,
如破伤风抗毒素血清仍然在使用 。
1937年 Tiselius等电泳分离血清蛋白,发现抗体活性主要为 γ 球蛋白 。 在相当长的时间内,γ 球蛋白成了抗体的同义词 。
60年代,发现患骨髓瘤的病人血清中有与抗体分子结构类似的球蛋白,因此把具有抗体活性,化学结构与抗体相似的球蛋白通称为免疫球蛋白 Ig。
由于病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质,
因此制得的抗体是多种抗体的混合物,即多克隆抗体 。 这些抗体制剂在使用中经常发生非特异性交叉反应而导致假阳性结果,同时产量低,难以满足临床需要 。
1975年 Kohler和 Milstein把来自脾脏能产生抗体的
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,进行原生质体融合,得到了通过离体培养就能产生单一抗体的杂交细胞,
即杂交瘤细胞 。 这是首次把杂交瘤技术应用于单克隆抗体的制备 。 与多克隆抗体相比,单克隆抗体具有高度特异性,均一性,而且来源稳定,可大量生产,成了抗体制备和生产的主要方法 。 单克隆抗体是第二代抗体 。
动物源性单克隆抗体在人体应用中,也存在抗原性,容易产生过敏反应,在体内易失效 。 人源单克隆抗体才是最终目标 。 因此产生了在基因水平对抗体结构进行改造的学科即抗体工程,通过原核微生物或昆虫细胞表达抗体的功能部分,制备嵌合抗体,并对抗体改形,变小,完全人源化抗体,这就是所谓的第三代抗体 。
1981年美国第一种单克隆抗体诊断试剂盒被批准进行商品化生产,至今品种已达数百种 。
至 2002年,FDA批准的临床治疗性抗体药物 10余种 。
抗体类型 商品名 应用鼠源单克隆抗体 Orthoclone 器官移植排斥嵌合抗体 Peopro 冠状动脉成形术,心绞痛嵌合抗体 Rituxan B细胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗体 Simulect 器官移植排斥嵌合抗体 Remicade 回肠炎,类风湿性关节炎人源化抗体 Zenapax 器官移植排斥人源化抗体 Synagis 婴儿呼吸道合胞病毒人源化抗体 Herceptin 乳腺癌人源化抗体 Campath 慢性淋巴细胞白血病人源化抗体偶联物 Mylotarg 急性复发骨髓白血病鼠源抗体放射性偶联物 Zevalin B细胞型非霍奇金淋巴瘤七,基因工程技术基因工程是在体外对生物的遗传物质基因进行剪切,拼接,重新组合,与适宜的载体连接,构成完整的基因表达系统,然后导入宿主生物细胞内,
与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖,编码产生人类所需的物质或创造新的物种,
也可对疾病进行基因治疗 。
1973年重组 DNA技术的建立为标志,是科学技术史上的里程碑 。 应用于农业,医药,轻工,化工,
环境等领域,成为人类解决粮食,能源,环境,
制药的主要手段 。
1976年世界上第一家基因工程技术开发药物的公司 （ Genentech公司 ） 建立,开始了现代生物技术产业发展的新纪元 。 1982年世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素获得 FDA批准,由 Eli Lilly公司正式生产,推向市场 。
基因工程技术首先在医药领域实现产业化,到现在仍有 60％ ～ 80％ 集中在医药领域,占主要地位的是基因工程药物的研究和商品化 。
研究开发的治疗药物是癌症,心脑血管疾病,艾滋病,遗传病等重大病而用常规方法又难以获得的药物 。
年代 技术 贡献者
53 DNA双螺旋模型 Watson 和 Crick
58 DNA半保留复制和中心法则 Crick
61 遗传密码的碱基三联体 Crick和 Nirenberg
67 破译遗传密码 Khorana和 Nirenberg
71 首家生物技术制药公司成立 Cetus公司
72 体外重组 DNA Jackson和 Berg
73 重组质粒在大肠杆菌中表达 Boyer 和 Cohen
75 细胞融合,单克隆抗体技术 Kohler和 Milstein
76 首家基因工程技术制药公司成立 Genentech公司
78 大肠杆菌中表达出胰岛素 Genentech公司
80 转基因小鼠 Gordon等
82 基因工程人胰岛素在美国上市
Eli Lilly公司
82 转基因超级小鼠 Palmiter等
83 基因扩增的 PCR技术 Mullis
85 植物转基因技术 Horsch等
86 基因工程重组乙肝疫苗上市
Merck公司
87 转基因鼠乳腺表达药物 tPA Gordon等
90 人类基因组计划开始 美国
97 克隆动物绵羊多利,
转凝血因子 IX基因绵羊波利
Wilmut等
99 中国加入人类基因组计划
2000 绘制出人类基因组,工作框架图,
中,美,英,日,法,德等
6国
2001 完成人类基因组,中国卷,中国
2003 绘制出人类基因组,序列图,中,美,英,日,法,德等
6国第四节 生物制药的现状和展望现代生物技术发展迅猛，日益影响和改变着人们的生产和生活方式。生物技术引入医药产业，使得生物医药业成为最活跃、进展最快的产业之一。
2000年全球生物技术药物销售额为 300亿美元，美国约为 200亿美元，其次是欧洲和日本。而与此同时，全球医药市场销售额年递增幅度却远低于生物药物的发展水平 (近 10%)，显示出生物药物的良好发展势头，并呈现出加速的迹象。
一,国外生物制药全世界生物技术公司 3600多家,主要集中在欧美,
美国 1450家,欧洲 700家,加拿大 330家,日本也有几百家 。 年产值超过 10亿美元的生物技术公司有 20余家 。
美国是现代生物技术的发源地,又是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家,多数基因工程药物都首创于美国 。 年研究经费 70亿美元以上 。
1980年美国的生物技术产品的销额还是零增长,
1991:59亿 USD,1996:101亿 USD,基因工程药物为
80亿 USD,1997:130亿 USD,2001:270亿 USD。
美国 2001年已达 1450余家 。
从业人员达 19万人 。
形成规模化生产的有 Amgen,Biogen,Chiron,
Schering－ plough,Eli Lilly,Merker,Genentech,
Hoffman－ La Roche,Smith Kline Beecham,Ortho
Biotech等 20余家公司,其中 Genentech,Amgen、
Biogen,Chiron和 Genzyme的销售额名列前茅 。
2002年批准 35种药物,另外有 300多个品种进入临床实验或待批阶段 。
到 2002年底,FDA批准 234种生物技术药物和疫苗 （ 包括新的适应症 ） 正式投放市场,其中新生物技术药物和疫苗为 141种 。
二,国内生物制药
20世纪 80年代是我国生物制药的起步阶段,
1983年成立生物工程开发中心,,七五,期间投资成立了基因工程药物,生物制品,疫苗三个研究开发中心 。 项目主要集中在肝炎,疫苗,血液制品等产品,企业数目极少 。
1986年我国生物技术尚处于研发的初期,仅有单克隆抗体诊断试剂盒,微生物农药等少数,少量产品,医药产品的产值约为 0.2亿元,占生物技术产品销售额的 8％ 。
20世纪 90年代,企事业单位齐头并进,大发展 。
国外主要的基因工程药物及疫苗,都能生产,
到 1996年医药产品的销售额达为 2.2亿元,其中基因工程药物和疫苗占 10.5％ 。 1998年,基因工程药物销售额达 7.2亿 。 代表性的产品 rhuIFN-
α 1b,直到 1989年申报新药,1993年批准试生产 。
通过国家 863计划,科技攻关计划,火炬计划及
973等国家计划的实施,使这一领域发展迅速,逐步缩短了与先进国家的差距,产品从无到有,不断发展壮大 。
经过十几年的努力,我国在生物技术领域取得了较快的发展,与世界先进国家的差距明显缩小,
尤其是在基础技术和实验室阶段,许多领域已接近国外先进水平 。
1000多家单位从事生物工程研究,生产和开发工作 。
注册的生物技术公司共有 200家左右,真正涉及到基因工程技术的不到 100家,
基因工程药物并已在有关部门登记立项的公司 60家,
取得生产基因工程药物试产或生产批文的企业约 50家 。
2000年底,我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计 20余种,其中一类新药有重组人干扰素 α 1ｂ,重组碱性成纤维细胞生长因子 （ 外用 ）,重组人表皮生长因子
（ 外用 ） 和重组链激酶,其他药物有重组人干扰素 α 2ａ,
重组人干扰素 α 2ｂ,重组人干扰素 γ,重组人白细胞介素 -2,重组人 G-CSF,重组人 GM-CSF,重组人红细胞生成素,重组人胰岛素和重组人生长激素,胸苷激酶,TNF衍生物,疫苗有重组乙肝疫苗和重组痢疾菌苗 。
三,生物制药发展方向生物技术药物与化学药物和中药将形成三足鼎立的局面 。
生物制药发展的几大重点领域：诊断与检测试剂,
新型基因工程疫苗,基因工程活性肽和蛋白质,
治疗功能基因药物,转基因动植物反应器 。
发展蛋白质工程药,
天然存在的生化药物，广义地说都可以认为是新药寻找的先导化合物。根据人类对蛋白质结构和功能关系的了解，借助电子计算机技术，把分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的知识综合起来，进行新型药物的设计，可以制成上万种新的化合物。目前的上市的药物约 5000个，
制药工业的药物靶点为 483个，其中 45％为细胞膜受体,28％为酶，其余为激素、离子通道、核受体和 DNA等。人类基因组测序已经完成，约 3～ 4个基因，药物靶点将增加 10倍,3000～ 5000个潜在的基因可能成为药物的蛋白质。
改造抗生素等药物生产的传统工艺技术：
利用现代生物技术,重点利用基因工程技术和原生质体融合技术构建新菌种,改造抗生素,维生素,氨基酸等产品的生产菌种,提高发酵水平,
降低消耗 。 在目前各类药物中,抗生素用量最大,
应研究采用基因工程与细胞工程技术和传统生产技术相结合的方法,选育优良菌种,固定化与生物转化相结合,研究大规模半合成工艺抗生素的生产技术,应用现代生产技术生产高效低毒的广谱抗生素 。 应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业和开发甾体激素,并对现在传统生产工艺进行改造 。
开发预防,诊断与治疗性疫苗：
研究新型疫苗,诊断试剂和生物技术药物,人源化的单克隆抗体,血液替代品,大力开发疫苗与酶诊断试剂 。
抗体可以对抗各种病原体,亦可作为药物的导向 。
单克隆鼠源抗体,会产生抗体或激发免疫反应 。
国外研究噬菌体抗体技术,嵌合抗体技术和基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题 。
大批混合的人体血浆制成的血液制品,由于人血难免被各种病原体所污染,如艾滋病病毒及乙肝病毒等,通过输血而使患者感染案例时有发生,
利用基因工程开发血液替代品引人注目 。
采用基因工程和细胞工程技术，生产濒危和稀缺中草药及其有效生物活性成份。
中草药及其有效生物活性成份的发酵生产。中草药经发酵、转化后，其有效成分能被充分分离、
提取，使其更具有生物活性，服用后能被人体组织细胞迅速吸收，达到祛病、健体、双向免疫调节的功能，更好地发挥中草药这一天然药物的药效作用。因此，应用现代生物技术大规模工业化提取中草药的有效生物活性成份，发展具有中国特色的中药生物技术。
基因治疗药物,
基因治疗是将外源正常功能基因通过载体导入人体内，通过基因置换或替补缺陷基因，或使靶细胞形成三链构象，阻断基因的异常表达，使新的遗传物质或调控遗传物质转移到患者个体细胞内，
以达到治疗效果。
1990 年临床首次将腺苷酸脱氨酶基因导入患者白细胞，治疗遗传病重度联合免疫缺损病以来，
到 1998年接受基因治疗的病人已达 400多例。基因治疗掀起了一场临床医学革命。
开发靶向肿瘤药物,
治疗肿瘤药物确实存在一个所谓,敌我不分,的问题。在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。
抗体的导向治疗可望解决此问题。利用抗体寻找靶标，如导弹的导航器，把药物准确引入病灶，
而不伤及其他组织和细胞。
开发现有生物术产品的新剂型,包括涂剂,栓剂,
气雾剂,滴剂等 。
生物药物易受胃酸,消化酶的的降解破坏,其生物半衰期较短,给药次数频繁 。 即使皮下和肌肉注射,生物利用度也较低 。 这与蛋白质药物的亲脂性差,难以通过生物屏障有关 。 但可以通过化学修饰制成前药,使用吸收促进剂和酶抑制剂,
增加透皮吸收和各种新的给药途径得以解决 。
生物药物制剂的主要方向是合理方便的给药新途径和新剂型,填埋剂,微球缓释剂型,纳米给药系统；非注射剂型也受到极大关注,呼吸道吸入,
直肠给药,鼻腔,口服和透皮等剂型 。
思考题
（ 1） 名词解释：生物药物,生物技术药物,生物制品
（ 2） 分析现代生物技术制药 （ 包括研发和生产 ）
的特征及发展趋势,比较与化学制药的异同 。
1.分类生物技术药物：利用生物机体、组织、细胞，生产制造或从中分离得到的具有预防、
治疗和诊断功能的药品，包括具有生物活性的初级代谢和次级代谢产物、天然活性化合物及其类似物。
生物药物：
20世纪 80年代,用现代生物技术生产的治疗性药物,基于重组 DNA技术和杂交瘤技术生产的药物,不包括直接从天然组织,血液等中提取的治疗性蛋白质 。
随着生物技术的发展,以核酸为基础的治疗性药物也属于生物药物 。
除了治疗性药物外,也包括体外诊断试剂 。
在制药领域,生物技术药物,生物技术产品,
生物技术制品互换使用 。
美国制药研究与制造者 （ PhTMA） 在其相关的报告中经常使用生物技术药物 。
生物技术药物包括重组 DNA,单克隆抗体,
杂交瘤和细胞系生产的药物,也包括细胞和组织来源的药物及基因治疗药物 。 虽然与生物药物的范畴有重叠,但生物技术药物的范围更大 。 生物药物是 15～ 20年以前药物的一个亚类,生物技术药物的历史较长,含义广 。
生物技术就是整合自然科学和工程科学,
获得应用生物,生产细胞产品和分子产品 。
所以生物技术药物应该包括任何生物技术手段和方法 （ 部分或全部 ） 生产的药物,包括传统生物技术方法,如非重组蛋白,从天然资源如微生物中分离提取的抗生素或半合成抗生素,植物来源的提取药物和细胞培养药物 。
按照来源可把生物技术药物分为微生物药物,植物药物和动物 （ 包括人 ） 药物等 。
制造工艺：化学合成药物,生物合成药物,
半合成药物和中药制造生产技术,微生物发酵药物,植物组织培养药物,动物细胞培养药物,动物组织和血液制剂药物,免疫抗体药物等 。
化学本质和特征：重组药物,基因药物,天然药物和合成,半合成药物 。
重组药物：重组多肽和蛋白质药物,细胞因子,受体,单克隆抗体和基因工程抗体,重组疫苗和重组多价疫苗等 。
基因药物：反义核酸药物,基因治疗药物,
DNA疫苗和核酶等 。
天然药物：来自动物,植物,微生物和海洋生物的天然产物 。
生化药物：包括从动物组织或脏器等中分离提取的氨基酸类,多肽和蛋白质类,酶与辅酶类,核酸及其衍生物类,多糖类,脂类,
生长因子类等药物 生物技术药物 生物药物重组蛋白质 是 是单克隆抗体 是 是天然材料中直接提取的多肽,蛋白质 是 否治疗性基因药物 是 是反义寡核苷酸 （ 直接化学合成 ） 是 否反义寡核苷酸 （ 生物酶法合成 ） 是 是直接化学合成的多肽 否 否天然材料中获得的抗生素,半合成抗生素 是 否植物来源的天然药物或半合成药物 是 否细胞或组织制剂 是 否在有关法规中,经常出现的术语是生物制品 (中国,美国使用 )或生物反应修饰剂 （ 美国使用 ）,
生物医药产品 （ 欧盟使用 ） 。
美国 FDA对生物制品的定义是病毒,治疗性血清,
毒素,抗毒素,疫苗,血液,血液成分及其衍生物,变应原性制剂及类似产品,胂凡钠明及其衍生物,用于预防,治疗疾病 。
这个定义并没有包括所有生物来源的药物 。 传统的生物制品包括疫苗,类毒素,血液制品和代谢制剂,但现在也包括重组蛋白质和核酸药物 。 生物反应修饰剂是激素,神经活性物质,免疫活性物质的总称,它们在细胞水平上起作用 。
中国的生物制品规程也对生物制品的定义：
以微生物,寄生虫,动物毒素,生物组织为起始材料,采用生物学工艺或分离纯化技术制备,并以生物学技术和分析技术控制中间产物和成品质量制成的生物活性制剂,包括菌苗,疫苗,毒素,类毒素,免疫血清,血液制品,免疫球蛋白,抗原,抗体,变态反应原,细胞因子,激素,酶,发酵产品,单克隆抗体,DNA重组产品和体外免疫诊断制品等 。
生物制品分类：
预防用生物制品 治疗用生物制品 诊断用品菌苗 抗血清与抗毒素 细菌学试剂疫苗 血液制品 免疫试剂类毒素 细胞因子 临 床 化 学 试剂
2.重要的微生物药物抗生素：链霉素,头孢霉素；链霉菌,青霉菌氨基酸：谷氨酸等 20余种,放线菌,真菌维生素：维生素 A,B2,霉菌,丙酸菌,酵母核苷酸和核苷：肌苷酸和肌苷,杆菌,放线菌,
酵母,青霉酶：淀粉酶,纤维素酶,蛋白酶,天门冬酰胺酶,
链激酶,葡激酶；米曲霉,黑曲霉,链霉菌酶抑制剂：洛伐他丁,辛伐他丁；曲霉,链霉菌免疫调节剂：环孢菌素 A；光泽柱孢菌,链霉菌抗生素,一类在低浓度下就能选择性地抑制或影响其它生物的生命过程的次级代谢产物 。
天然抗生素约 9000种,
半合成抗生素有 7000多种,
具有临床应用价值的近 500种,
已经大规模工业生产的抗生素达 100多种 。
种类 药物举例 生产菌 抗菌机理与应用
β 内酰胺类 头孢霉素 头孢霉 抑制细胞壁氨基糖苷类 链霉素 链霉菌 抑制蛋白合成大环内酯类 红霉素 链霉菌 抑制蛋白合成多烯类 两性霉素 链霉菌 破坏细胞膜四环素类 四环素 链霉菌 抑制蛋白合成糖肽类 万古霉素 无枝酸菌 抑制细胞壁多肽类 杆菌肽 杆菌 破坏细胞膜蒽环类 柔红霉素 链霉菌 抑制 RNA和 DNA合成 。
3.重要的植物药物很多植物来源的药物已经能化学合成,还有一部分直接分离提取,或修饰加工的半合成药物 。 其中部分已经用植物细胞大规模培养进行生产 。
生物碱：阿托品,可卡因,吐根,奎宁,长春碱,
长春新碱,喜树碱,秋水仙碱水杨酸：阿司匹林；萜类,紫杉醇香豆素,双香豆素甾体,地高辛,洋地黄苷酶：脲酶,无花果蛋白酶
4.重要的动物药物从动物组织或器官中直接分离提取,蛋白质类药物可以用基因工程技术制造,非蛋白质药物包括甾体类激素,皮质类甾体和前列腺素等,大多数已化学合成 。
胰腺：胰岛素,高血糖素,胰蛋白酶,胰酯酶,
胰凝乳酶,Dnase,弹性蛋白酶脑：脑磷脂,神经磷脂垂体：生长素,促黄体激素,加压素,促卵泡激素,促皮质激素肝脏：维生素,肝细胞生长因子,肝素,RNA
胸腺：胸腺素,胸腺肽血液：凝血酶,凝血因子,血红素,血红蛋白,
SOD,血浆,白蛋白,免疫球蛋白,纤溶酶甲状腺,鳃：降钙素胃黏膜：胃蛋白酶,胃膜素,双岐因子,凝乳酶尿：绒膜促性激素,尿激酶心脏：细胞色素 C,辅酶 Q
蛋清：溶菌酶二、重要的重组生物药物
1,激素类药物激素是由内分泌腺或特异细胞产生的含量极低一类小分子,通过信使功能,起专一生理效应 。
人胰岛素：胰岛细胞,前胰岛素原 跨膜运输,切除 23 aa信号肽,86 aa的 胰岛素原 。 高尔基体形成二硫键,切除 C肽,成熟的胰岛素分泌到胞外,进入血液循环 。 成熟的 胰岛素 由 AB双链组成,A链
21aa,B链 30aa,3对二硫键 。
生理功能广泛,能促进糖原合成和糖酵解,产生 ATP,降低血糖含量,保持能量供应 。 重组人胰岛素,发达国家取代猪或牛胰岛素,用于临床,主要治疗 I型糖尿病 。
生长素,垂体前叶分泌的一种促进生长的激素 。 人生长素是 191 aa的 单链球蛋白,2对二硫键 。 生长素具有促进氨基酸的运输和蛋白质,核酸的合成代谢,刺激新骨形成和红细胞生成,加速生长 。
重组人生长素用于治疗侏儒病,慢性肾功能衰竭,
烧伤,创伤等 。
心钠素即心房利钠多肽 （ 心房利钠因子 ）,是一个家族,心钠素,脑钠素,C型利钠肽 。 心钠素家族的三个成员分子为环状结构,N端和 C端为链状,
1对二硫键在环内,存在高度保守序列和区域 。 人心钠素由 28个氨基酸残基组成,人脑钠素由 32个氨基酸残基组成 。 重组人心钠素日本上市,用于心衰治疗,我国也进入临床实验 。
降钙素,甲状腺滤泡旁细胞产生的激素,生理功能是调节钙磷代谢,维持内环境的稳定 。
33 aa的多肽激素,不同种类活性差异较大,非脊椎动物如鱼类比哺乳动物的活性高 。 目前使用的是天然提取的猪,人,鳗鱼,化学合成的等 。
基因工程重组鲑鱼钙降素于 1999年在欧洲上市 。
主要用于骨质疏松,高钙血症,Paget’s病等,骨量减少,更新机能障碍等疾病的治疗 。
高血糖素：低血糖症；
促甲状腺素：治疗和诊断促卵泡激素：停止排卵和超排卵种类 商品名胰岛素 Humulin,Novolin,Humalog,Lantus
生长素 Humatrope,Nutropin,Saizen,
BioTropin,Genotropin，
Norditropin,Protropin,Serostim
高血糖素 Glucogen
促甲状腺素
Thyrogen
促卵泡激素
Conal F,Puregon,Follistin
2.细胞因子药物细胞因子：各种细胞合成并分泌的小分子多肽类因子,调节机体的生理功能,参与细胞的增殖,
分化,免疫,移植排斥,凋亡等过程 。
干扰素,IFN-α,β,γ,ε ω,τ 。 IFN-α约有 25
种亚型,165－ 166 aa,2个二硫键,无 N－糖化位点 。 IFN-β 有 4个亚型,166 aa,1个二硫键 。 IFN-
γ有 4以上个亚型,由 143个氨基酸残基组成,无二硫键,2个 N－糖化位点 。
重组 α,β,γ干扰素均已上市,α治疗白血病,慢性病毒感染如乙肝,丙肝,单纯疱症病毒等,β
治疗多发性硬化症,γ治疗类风湿关节炎等 。
白细胞介素,
介导白细胞之间相互作用的一些细胞因子,现已命名至 IL－ 23。 只有 IL-2和 IL-11被开发成基因工程药物而上市 。 IL－ 2由 133 aa组成,1个链内二硫键,
糖蛋白 。 IL－ 11由 178 aa组成,无二硫键和糖基化 。
IL－ 2用于癌症辅助治疗,IL－ 11与 G－ CSF联合使用,纠正化疗导致的粒细胞和血小板减少症 。
集落刺激因子,是指能刺激造血细胞在半固体培养基上形成细胞集落的细胞因子,是一类造血细胞生长因子 。 M－ CSF,GM－ CSF,Multi－ CSF，
EPO,SCF,TPO等 。
粒细胞集落刺激因子 G-CSF是 174 aa,2对二硫键 。
GM-CSF是 127 aa,2对二硫键 。 M-CSF是 522 aa，
3对二硫键 。 它们都具有 N－糖化位点,有信号肽,
分泌时被切除 。
重组人 G-CSF,GM-CSF,M-CSF均已上市,刺激骨髓中粒细胞和巨噬细胞增殖,集落形成,增强免疫,用于血细胞减少症,再生障碍性贫血及化疗放疗癌症的辅助治疗 。
EPO是 165 aa的高度糖基化蛋白,2个二硫键,糖基 （ 主要为唾液酸 ） 对活性至关重要 。 重组 EPO
用于治疗透析性贫血或其他贫血,是治疗肾功能衰竭导致贫血的首选药物 。
SCF:重组人 SCF主要作用于早期造血干细胞,范围广,但专异性差,还具有种属特异性,单独使用活性低 。 可与其他因子协同作用产生不同的联合效应 。 一般与 G-SCF联合使用,刺激粒细胞增殖 。 与 EPO联合,刺激早期红细胞的增殖,对细胞肥大也有增殖作用 。
生长因子 GF:对细胞生长具有促进作用的因子,表皮生长因子 EGF,成纤维细胞生长因子 FGF,转化生长因子 TGF,血小板生成素 TPO。
EGF,53 aa,3对二硫键 。 重组人 EGF已在国内外上市,大肠杆菌和酵母细胞表达 。 主要外用,治疗烧伤,溃疡和外伤及外周神经系统疾病 。
FGF：碱性成纤维细胞生长因子 bFGF和酸性成纤维细胞生长因子 aFGF,等电点分别为 5.4和 9.8，
它们的生物学活性相似 。 其实 FGF是一个家族,
其成员已经鉴定出 22个,重组 FGF主要外用,治疗烧伤及外周神经系统疾病 。
TNF：肿瘤坏死因子,杀灭肿瘤 。 巨噬细胞产生
TNF-α,T细胞产生 TNF-β 。 TNF具有广泛生物学效应,参与免疫细胞激活和炎症反应,具有抗感染,抗病毒,抗肿瘤的作用 。 国外重组 TNF已进入临床阶段,用于肿瘤治疗,与化疗联合使用 。
TPO,332 aa。 重组 TPO已进入临床阶段,主要用于肿瘤病人的化疗所致血小板减少症 。
种类 商品名
IFN-α1b 赛诺金,干扰灵
IFN-α2a ReferonA,福康泰,来福隆,迪恩安,因特粉,贝尔芬
IFN-α2b IntronA,Rebetron,Alfatronol,Virtron,安达芬,隆化诺,
保守 IFN-α Infergen
IFN-β Betaferon,Betaseron,Avonex,Redif
IFN-γ1b Actimmune
IL-2 Proleukin,辛格尔,德路生,悦康仙,英路因,安特鲁克
IL-11 Neumega
EPO Epogen,Procrit,Neorecormon,宁红欣,依普定,益比奥
GM-CSF Leukine,里亚尔
G-CSF Neupogen,吉粒芬
PDGF Regranex
TNF-α Beromun
3.溶血栓药物类溶血栓药物是纤溶酶原激活剂 PA通过激活无活性的血浆纤溶酶原 PLG,形成有活性的纤溶酶 PLM.
催化血栓的主要基质纤维蛋白水解,使血栓溶解,
畅通血管 。 纤溶酶原激活剂有,
组织型纤溶酶原激活剂 tPA;
尿激酶原激活剂 uPA,哺乳动物产生的可直接激活 PLG，
而由细菌产生的链激酶 SK和葡激酶 SAK,可间接激活
PLG。
TPA:527 aa的糖蛋白,有 17对二硫键,3个糖基化位点 。
细菌表达产物野生型 tPA分子量大,未形成产品 。 哺乳动物细胞 （ CHO） 表达重组 tPA已在美国于 1987年上市,第一个用动物细胞大规模生产的重组蛋白质药物 。
改型 tPA:rPA和 TNK-tPA。
RPA:是 tPA cDNA缺失突变后,用大肠杆菌表达的单链无糖基化蛋白质,355aa,效果与重组 tPA相同,生产成本低,血浆中半衰期延长 。 TNK-tPA:
是 tPA个别氨基酸突变后,由 CHO表达的糖基化双链蛋白 。 527 aa。 PA,tPA,rPA和 TNK-tPA均已上市 。
uPA:是从人胚肾细胞培养液或新鲜尿液中提取的溶栓药 。 单链尿激酶型纤溶酶原激活剂由 411个氨基酸残基组成,有 12对二硫键,目前美国 Abbot公司从人胚肾细胞培养株生产 scu-PA,德国 Grunenthal
公司用大肠杆菌表达 scu-PA,活性高于哺乳动物细胞表达的糖基化 scu-PA。
SK:从溶血性链球菌培养液中提取分得到,415 aa，
是最早用于临床的溶栓药 。
SAK:金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体所分泌的,136
aa,是单链无二硫键的蛋白质 。 直接从细菌培养液中分离纯化困难,含量很低 。 现已经克隆了该基因,并实现了大肠杆菌和枯草杆菌表达,工程菌的产量占总蛋白质的 10%－ 15％ 。
水蛭素,从水蛭中发现的一种凝血酶抑制剂,是溶血栓的有效辅助药物 。 天然水蛭素是酸性多肽,
含有 65个氨基酸 。 水蛭素可用大肠杆菌和酵母表达,1998年美国,德国等批准重组脱硫酸酯水蛭素上市,应用于预防血栓和肝素相关的血小板减少症 。
4.受体,黏附分子药物细胞表面分子包括受体和黏附分子 。 受体与其配体结合后,经信号传导,引起细胞的功能和行为发生改变 。 黏附分子是由细胞产生的介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子,分布于细胞表面 。
很多黏附分子就是受体 。 根据人类白细胞分化抗原的国际协作组会议的命名,把识别同一分化抗原的单克隆抗体归为同一个分化群 CD,许多黏附分子和受体被命名为 CD分子 。 在多数情况下,CD
分子和黏附分子或受体的名称可以通用 。
重组 CD分子与天然的 CD竞争性结合配体,作为阻断剂,封闭信号传导,治疗天然 CD分子功能异常引发的疾病 。
与抗体相比,重组 CD分子没有免疫应答反应,安全性好 。 但存在问题要求真核表达系统,技术设备和条件要求高,规模生产较困难,成本高；半衰期短,给药量大 。 其策略是采用与抗体结合,
在 CD分子的 C端融合 IgG的 Fc片段,表达融合蛋白,
形成免疫黏附素 。 已上市的有 Immunex公司的可溶性 TNF受体 II－ Fc融合蛋白,用于治疗类风湿关节炎和慢性心衰 。 其他的进入临床阶段的可溶性
CD54,可溶性 IL－ 4受体,可溶性 LFA－ 3/IgG1融合蛋白等 。
5.重组融合蛋白药物将两种或两种以上的功能蛋白质的基因重组,产生新的融合蛋白质,可发挥超越其单分子的生物学活性 。 主要有细胞因子之间融合,如 IFN-γ /IL-
2,IFN-γ /TNF2,IL-2/IL-6,GM-CSF/IL-3。 细胞因子与抗原或抗体之间的融合,如 Id/GM-CSF、
Id/IL2,Id/IL4等,细胞因子部分可大大提高 Id部分的抗原性 。 细胞因子与毒素或抑制因子之间融合,白喉毒素 /IL-2,GM-CSF/LIF等 。
上市的重组融合蛋白药物有 Ontak,IL-2融合的白喉毒蛋白,靶向治疗皮肤 T细胞淋巴瘤 。 Enbrel是
TNF可溶性受体融合 IgG片段,治疗类风湿性关节炎 。
三,疫苗主要用于健康人群的一类预防性生物药物 。 包括蛋白质,多糖,核酸等 。
根据病原生物体分类：
菌苗,细菌性抗原制剂 ;疫苗,病毒性抗原制剂,
但现在统称为疫苗 。
根据制造技术分类：
传统疫苗包括灭活疫苗,减毒活疫苗和亚单位疫苗；新型疫苗是指用基因工程技术研制的疫苗,
基因工程亚单位疫苗,载体疫苗,核酸疫苗,多抗联合疫苗,重组多价疫苗等 。
基因工程疫苗：用重组 DNA技术克隆保护性抗原基因,用表达出的抗原产物或重组体本身制备成疫苗 。
基因工程亚单位疫苗用微生物表达抗原,纯化后制备成疫苗 。 最成功的是酵母和 CHO表达的乙肝表面抗原,纯化后制备的乙肝疫苗,高效,价廉,
安全,已取代了传统的血源疫苗 。
蛋白质工程疫苗是对抗原基因进行改造,如突变,
缺失,插入等,增加免疫原性,扩大反应谱 。
核酸疫苗或基因疫苗是用能够表达抗原的基因制备成的疫苗 。 其本质是核酸,可以是 DNA,也可以是 RNA。
基因工程载体疫苗和基因缺失活疫苗：本质是菌苗,把抗原的基因重组到微生物体内,筛选得到用表达抗原基因的重组微生物,进而以微生物为载体制备成疫苗 。 多为活疫苗,载体为指定的微生物菌株,如痘苗病毒,脊灰病毒,腺病毒,卡介苗等 。 也可用非复制型载体,即微生物进入人体后,不能繁殖,但能进行 DNA的复制,转录和蛋白质的表达,能产生抗原刺激机体发生免疫反应,提高了载体的安全性 。
DNA疫苗,将外源目的基因片段构建在 DNA质粒中,重组后的 DNA导入机体后可表达目标蛋白,刺激机体的免疫系统,而达到预防某种疾病的生物制剂 。 DNA疫苗是质粒 DNA,它含有宿主疫苗应答的抗原基因 。
细菌减毒活疫苗卡介苗,伤寒疫苗,霍乱疫苗,
布氏菌疫苗,炭疽疫苗,痢疾疫苗病毒减毒活疫苗牛痘疫苗,脊髓灰质炎疫苗,麻疹疫苗,腺病毒疫苗,风疹疫苗,
黄热病疫苗,腮腺炎疫苗,甲肝疫苗,流感疫苗,水痘疫苗,轮状病毒疫苗,乙脑炎疫苗病毒全灭活疫苗流感疫苗,脊髓灰质炎疫苗,甲肝疫苗,乙脑炎疫苗,流行性出血热疫苗,斑疹伤寒疫苗细菌全灭活疫苗霍乱疫苗,百日咳疫苗,鼠疫疫苗,伤寒疫苗上市的灭活疫苗病毒亚单位疫苗乙肝疫苗,流感嗜血杆菌疫苗细菌亚单位疫苗肺炎链球菌疫苗,沙门氏 Vi多糖疫苗,
无细胞百日咳疫苗,A型和 C型脑膜炎球菌疫苗病毒结合疫苗类毒素细菌结合疫苗
B型流感嗜血杆菌疫苗,破伤风疫苗,
百喉疫苗上市的亚单位和结合疫苗二联疫苗甲乙型肝炎联合疫苗,乙型肝炎,B
型流感嗜血杆菌联合疫苗,麻疹,风疹联合疫苗 。
三联疫苗百白破联合疫苗,无细胞百白破联合疫苗,三价口服脊髓灰质炎减毒活疫苗,三价脊髓灰质炎灭活疫苗,麻疹,
流行性腮腺炎,风疹联合疫苗 。
上市的联合疫苗四联疫苗百白破,B型流感嗜血杆菌联合疫苗,
百白破,乙型肝炎联合疫苗,百白破,灭活脊髓灰质炎联合疫苗 。
五联疫苗百白破,B型流感嗜血杆菌,乙型肝炎联合疫苗,联合疫苗,百白破,
灭活脊髓灰质炎,B型流感嗜血杆菌联合疫苗 。
种类 药物 应用乙肝 Recombivax 乙肝疫苗二联疫苗
Comvax
Procomvax
抗乙型流感,乙疫苗肝联合疫苗
Tritantix 抗乙肝,白喉,破伤风,
百日咳疫苗联合疫苗
Twinix 抗甲乙肝免疫剂联合疫苗
Primavax 抗白喉,破伤风,乙肝疫苗含有 HBsAg的重组疫苗四,基因药物包括细胞因子,活性多肽,受体的基因,也称
DNA药物 。 广义的基因药物还包括反义核酸和基因转录调控的药物,主要针对基因遗传缺陷引起的疾病 。 将具有治疗意义的正常基因重组到真核表达载体上,用一定方法导入体细胞内,利用胞内的原料,进行基因的转录表达,合成并分泌释放蛋白质或肽产物,替换或封闭其中异常或致病基因,得到治疗相关疾病的目的 。 基因药物可望治疗 400余种遗传疾病 。
医药产业的第四次革命 。
基因药物还处于实验研究阶段,许多技术和伦理问题反义核酸药物是指用反义技术研制的药物 。 根据碱基互补原理,用人工合成或生物合成的特定互补寡核苷酸片段,与特定的基因或 RNA发生杂交,
抑制或封闭基因表达,阻断相应有害蛋白质的合成,干扰了遗传信息从核酸向蛋白质的传递,达到治疗疾病的目的 。
反义寡核苷酸药物是以 4种核苷酸为基础化学合成 。
天然的寡核苷酸很容易被体内的核酸酶降解,因此在合成的同时进行化学修饰,改变物化学性质,
降低核酸酶的敏感性,增加稳定性,生物利用度和靶基因的结合特异性 。
FDA批准 ISIS/CIBA Vision公司 Vitravene上市,第一个反义核酸药物,治疗艾滋病人晚期发生的视网膜炎 。
第二节 现代生物技术制药的特征药物制造过程包括基础设施的设计和布局、生物药物来源、上下游过程和最终产品的分析等几个阶段。
药物的制造必须受到高度严格控制，不仅药品安全、有效，而且制造过程的各个方面也都必须是安全、有效的。在制造过程中，药典和 GMP几乎是指导性的中心，对产品安全和有效性起关键作用。
现代生物制药的特点是技术含量高、智力密集，
全封闭自动化、全程质量控制，大规模生物反应器生产和新型分离技术综合利用。
一,生物药物的特性与制造技术的关系生物药物的特性生物材料本身成分复杂,除多糖,蛋白质,核酸,
脂类等高分子化合物外,还有糖蛋白等复合物 。
生物药物具有高活性,活性与结构有密切关系 。
低分子量的生物药物的活性往往取决于其手性异构体,不同的离体异构体其活性截然不同甚至相反 。 高分子量的生物药物活性不仅取决于其一级结构,还与其高级 （ 二级,三级,四级 ） 空间结构 （ 即构象 ） 密切相关,空间构象的破坏往往导致药物失活 。
酸,碱,有机试剂,重金属,热,光等因素敏感 。
所处的环境和介质影响其结构,生产中的机械剪切力,金属器壁的摩擦力,传热传质等过程不仅会影响细胞的活性与功能,也影响药物的活性 。
生产条件的变化对质量影响大,在工艺放大过程中应严格监测质量的动态变化,在分离纯化等过程必须采用措施防止变性失活 。
生物药物具有低稳定性,易受物理化学和生物因素的影响而变性失去活性 。 细胞破碎后,打破了原有的亚细胞布局,不再存在细胞隔室,药物失去了空间保护 。 一旦提取出来后,离体的药物,
容易受到理化因素的攻击,变性失去活性 。
生物药物具有易污染性,生物药物本身是活性生物分子,很易被腐生降解的低等生物所取食,引起腐败降解,同时可能产生热源和过敏原 。
生物药物具有用量少,价值高的应用性 。 生物药物在治疗,预防和诊断中的所用剂量较少,显示出很高的商业经济价值,驱动着生物药的不断创新和发展 。
影响生物药物活性的因素蛋白药物是以生物活性为基础的,下游及其制剂过程必须把活性下降降到最低限度 。 加工过程尽可能缩短处理时间,加入稳定剂,提高蛋白质的稳定性 。 蛋白质丧失活性和不稳定的原因包括 共价键与非共价键的破坏与生成,均可引起蛋白质不可逆降解和不稳定 。
蛋白质部分或全部蛋白变性共价键变化外消旋化,异构化脱酰胺作用,亚胺形成二硫键交换,糖链变化氧化,水解,光降解聚集表面吸附沉淀非共价键变化伸展 卷曲蛋白质在空气中发生自动氧化过程,由空气中的氧自发引起的游离基链式反应 。
温度对蛋白质是个很敏感的因素,温度升高使分子内的震动增强,从而破坏维系空间结构的次级作用使蛋白质变性 。
日光中的紫外线能量最大,生物药物样品受光催化的反应有变色,氧化和分解等 。
多数蛋白质在等电点范围内才稳定,超出此范围会迅速变性,液体样品保存时常用缓冲液控制 pH
值 。
有机溶剂存在时,它们的极性及介电常数小于水,
使肽链内的静电斥力增加,造成蛋白质分子膨化或松散 。
在溶液中加入盐类化合物也会影响蛋白质构象的稳定性 。 在低浓度的中性生理盐溶液中对蛋白质的构象不发生影响 。 但盐浓度较高时,盐离子有可能改变蛋白质内部的极性基团或改变溶剂性质使蛋白质稳定性发生变化,出现沉淀 。
表面活性剂,如十二烷基硫酸钠 （ SDS） 在低浓度时可与蛋白质结合,其表面带有大量负电荷,
阻止了复合物分子之间的聚集而不致凝集或沉淀 。
蛋白质的酸,碱水解是肽键的水解,使分子断裂成为分子量大小不等的肽段和氨基酸,在蛋白酶存在下会加速水解 。 即使非常有限的蛋白酶都会引起蛋白质活性的丧失 。 各种蛋白质对蛋白酶的敏感性与空间结构有关,紧密的结构能抵抗蛋白酶的攻击 。 保护蛋白质降解的策略是减少加工过程时间,并在低温下进行操作,使用一些特异性蛋白酶抑制剂 。 蛋白酶要在下游的早期除去,在后期的残存将严重影响产品活性 。
PMSF:丝氨酸蛋白酶,某些半胱氨酸蛋白酶苯甲眯,丝氨酸蛋白酶；胃酶抑制素,天门冬氨酸蛋白酶
EDTA:金属蛋白酶脱酰胺作用：谷氨酰胺与天冬门酰胺侧链酰胺的水解,形成谷氨酸与天冬门氨酸 。 较高温度,极端 pH能促进脱酰胺作用水解 。 脱酰胺化作用是胰岛素降解的主要途径 。 α 氨基 N进一步攻击侧链羰基,引起亚胺形成 。 亚胺引入新的负电荷可影响三级结构和稳定性 。
蛋白质用碱水解时,会使某些 L-氨基酸变为 D-氨基酸产生消旋作用 。
蛋白质中的氨基酸侧链容易被一些氧化剂氧化,
分子氧和氧自由基氧化 。 蛋氨酸可氧化成蛋氨酸亚砜使蛋白质失活,半胱氨酸可氧化成半胱磺酸或二硫键 。 可在最终产品中充 N2气或添加抗氧化剂 。
蛋白质聚集,蛋白分子结合的微观过程,可以是二聚体或大的低聚物,但仍保留在溶液中而影响生物活性 。
由于疏水的和静电作用,蛋白质和多肽吸附于容器,滤器或输液系统的表面,蛋白质溶液浓度较低时,吸附损失相对较高 。
蛋白质与吸附表面之间的相互作用随表面疏水性和蛋白质疏水性的增加而增加 。
膜滤过是现行蛋白质药物制剂灭菌滤过最常用的方法,在膜上蛋白质的吸附与失活是一个值得特别关注的问题 。
稳定蛋白质药物的策略为了较长时间保存蛋白质溶液,常常加入一些稳定剂进行保护 。 液体样品可用惰气驱除液中残存的氧,高浓度保存也是一条可行方法 。
蛋白质类：血清白蛋白,明胶；金属螯合剂,EDTA；
氨基酸：甘氨酸,丙氨酸,赖氨酸,苏氨酸糖类：葡萄糖,蔗糖,海藻糖,右旋糖苷多元醇：甘油,山梨醇,肌醇,聚乙二醇表面活性剂：聚山梨醇酯；中性盐：硫酸铵防腐剂：乙醇,苯酚,硫柳汞,醋酸苯汞,乙酯,
抗氧剂：焦亚硫酸钠,硫代硫酸钠,半胱氨酸二,生物制药的研发
1．研发过程生物制药研发的基本过程包括新药发现,原始特征,临床前试验,临床试验,制造与上市申请,
批准获得许可证,销售,售后监测,几个重要过程 。
新药发现的策略：随机筛选，基于作用机理的药物鉴定，但生物药物的研发往往是基于作用机理。
单因素的生物活性物质直接缺乏所致疾病，如缺乏胰岛素导致糖尿病，缺乏生长素会导致侏儒症，
由此开发胰岛素和生长素药物。多因素综合的复杂疾病，癌症和炎症。细胞因子类的干扰素和白介素，刺激免疫、调节炎症，治疗复杂疾病。
在很多情况下，生物药物的发现都是生理生化功能和分子进展的理性考虑，更准确地来说，就是机体自身的活性物质作为药物。 2000年，人类基因组测序的完成和蛋白组学研究的兴起，为基于基因组和蛋白组的生物药物设计，特别是蛋白质类和核酸类药物提供了大量的生物信息，成为药物研发的一个新热点。
植物、微生物也是生物药物地重要来源。在 20世纪 50年代以前，大量的药物就是从植物中发现的，
如地高辛、洋地黄毒苷、阿司匹林、可待因和紫杉醇等。目前，美国 100多种药物（约占 25％）最初来源于植物，尽管某些药物现在已经通过化学合成或半合成得以制造。
植物是潜在药物最丰富的来源，显花植物约 26.5
万种，到目前为止不到 1％的物种被用于药物筛选。
有两条途径从植物中筛选生物药物。一条途径种是收集营养体部分，最直接的随机筛选,虽然象紫杉醇这样的药物是相当成功的，但总体来说，
成功率仍较低。另一条途径是靶向筛选，如民族药材学 (ethnobotany)，研究植物与人之间的关系。
在这方面可以借鉴中药的经验，以提高中选率。
微生物特别是细菌和真菌已经证明是抗生素和抗癌药物的一个重要来源。目前发现并描述的微生物药物近 15000种，大约 2/3由放线菌产生，不少药物用于临床。
合理药物设计已经越来越成为药物发现的常规途径。大规模系统筛选天然或合成物质，已获得了大批现代药物。
在已知药物靶标的三维结构时，根据药物与靶标的相互作用，进行计算机模拟修饰已知药物，从而设计新药。靶标往往是蛋白质或酶或受体,X射线晶体结构和 NMR分析结果都可用于设计。
有很多分子模拟软件可供药物设计，这种设计的产物是小分子配体，如受体抑制剂，能准确进入靶标的活性位点区域，从而阻断受体活性，发挥药效。
对传统的随机药物筛选的一个改进就是组合化学库的高通量筛选，组合文库在较短时间内相对容易和低价合成，实际上许多大型制药公司拥有数十万个天然和合成的化合物。对于短多肽，化学合成也很容易。此外，各种生物文库，如噬菌体展示文库、酵母展示文库、酵母双杂交系统等可用于蛋白质类药物的筛选和发现。
对已发现的蛋白质药物进行突变改造和其他蛋白质如抗体、受体等融合，提高活性、延长半衰期是一种切实可行的途径。如 IL-2的 125位由半胱氨酸变为丝氨酸后，明显延长半衰期。 干扰素
IFNα 1c的 86位氨基酸 Cys突变后，失去形成二硫键巯基，提高了产物在大肠杆菌中表达的稳定性。
Amegen公司在 20世纪 80年代发现的 8种干扰素 α
的基础上，进行同源性分析，发现完全的相同位点 99个。从而设计合成了保守干扰素，对其中的数个氨基酸进行突变，只有在该位点出现频率高的氨基酸取代，共形成三种突变产物，其中
IFNcon-1（ Infergen）于 1997年批准上市。
多种溶栓蛋白药物的突变改造体也正在不同的试验研究阶段。
对于细胞因子类，改变其受体结合部位的氨基酸，
提高受体亲和力和结合能力，能提高其生物活性。
对 IFNα 1c的受体结合域 AB环 31,32位进行突变取代后，提高了抗病毒的生物活性。
一旦发现候选新药，就要鉴定其物理化学性质，
如结构、分子量、稳定性等。常常需要组合 2～ 3
种高分辨率的色谱纯化方法，以获得均质的初始蛋白质。所鉴定的特征可用于生产制造中的质量控制。完成特性鉴定后，可申报专利。
临床前测试药物的安全性、质量和有效性，包括药物代谢谱、药物动力学谱、生物利用度、急毒和长毒，免疫毒性、致癌性、诱变性、生殖毒性和致畸性等。
临床试验需要 5年甚至更长时间，而且新药申请专利受到保护。
根据生物药物的特点,临床前和临床试验均所需药物为几百克至 1公斤的活性成分即可 。
设计最适生产过程用于药物评价并有利于以后的放大是十分重要的 。
通常是实验室规模生产毫克级药物,用于研发和特征鉴定等 。
小规模生产克级药物,用于临床前和临床试验大规模生产百克至公斤级药物,用于商业药品销售 。
第三节 生物制药的发展历程制药工业的历史大约只有 60多年,但从开始就发展很快,目前全世界制药企业超过 10000家,生产制造 5000多种药物,其中约 100家为跨国公司现代制药工业的发展可追溯到 20世纪之交,那时只有 4种药物：洋地黄用于治疗各种心血管疾病,
奎宁用于治疗疟疾,吐根属植物提取物 （ 活性成分为生物碱 ） 用于治疗痢疾,水银用于治疗梅毒,
但当时缺乏安全性和有效性 。
随着生物学和有机化学的发展,能人工合成某些具有治疗作用化合物 。
1800：阿司匹林,从而导致了药物化学公司的诞生,Bayer和 Hoechst公司 。
直到 1930年代,制药工业才开始大发展 。 磺胺类药物的发现和化学合成是最初标志,能有效治疗很多细菌的感染 。 大规模工业化生产胰岛素也成为现实 。
1940年代大规模生产青霉素,此时,建立了很多现代的领头制药企业,如 Eli Lilly,Wellcome、
Glaxo,Roche等 。 早期的制药几乎都是化学合成的 。
一,天然生物材料的提取早期的生物药物是来自动物脏器和血液,即脏器制剂,以李时珍所著的本草纲目和中国药用动物志为典型代表,分别收录药物 1892种和药用动物
1500余种 。 属单方入药,简单加工制造,几乎没有规模,是以原料药为主 。 制品纯度低,有效成分不明确 。 某些脏器制剂仍然在欧亚地区特别是第三世界国家和日本使用 。
在 20世纪 50年代后,随着对动物脏器的有效成分和生理活性物质的全面了解,生产工艺技术提高,
分离和纯化制剂技术也完善,改变了原来的混合制剂,成为高纯度单一特异性组分的生化药物制剂,猪牛胰岛素,前列腺酶及激素二,传统微生物发酵阶段
1928年英国 Fleming发现了抗菌物质,1940年
FloreyChain等提取并证明了青霉素的疗效 。
起初沿用初级代谢产物的发酵条件,采用表面培养法生产青霉素 。
随后研发了搅拌发酵沉没法生产成功,提高了供氧和通气量,菌株选育,培养和深层发酵,提取技术和设备的研究取得了突破性进展,给抗生素生产带来了革命性的变化,开始了微生物工业时代 。 以后链霉素,金霉素,红霉素等抗生素出现,
抗生素成为制药业的独立门类 。 黑根霉一步生物转化孕酮为 11a-羟基孕酮,实现甾体类激素工业化三,酶工程技术的出现与应用酶工程是酶学和工程学相互结合渗透发展形成的,
以应用为目的,研发新酶并生产,分离和纯化,
包括酶的固定化及酶反应器及酶的分子设计等 。
在 20世纪 20年代,就出现了酶工程,以自然酶制剂在工业上大规模应用的特征,原料以动植物为主 。
1953年,Grubhoger Schleith 用重氮化聚氨基聚苯乙烯树脂对羧肽酶,蛋白酶,核酸酶等进行固定,
产生了固定化酶技术 。
1969年,千畑一郎等用固定化氨基酰化酶技术拆分了 DL-氨基酸,生产 L-氨基酸,随后固定化天冬氨酸酶生产 L-天冬氨酸等,开创了固定化酶应用的局面 。
以后相继出现了化学修饰酶,人工酶,有机相酶反应等化学酶工程和遗传修饰,改变及克隆酶等生物酶工程,并且以微生物为酶工程的主要来源 。
在制药工业上的应用,酶制剂直接或间接应用于医药 ;生物转化,给已有药物添加基团,增加药效和功能 ;细胞固定化技术用于动物细胞培养制药 ;
酶抑制剂是低分子物质,对微生物本身无害,在人体有生理活性,是药物研发的一个重要方向 。
固定化大肠杆菌细胞 （ 产生青霉素酰化酶 ） 转化青霉素 G,V,除去侧链生产无侧链青霉素,即 6-
氨基青霉烷酸 。
固定化 5-磷酸二酯酶水解转化酵母 RNA,生产 5-
复合单核苷酸 。
固定化氨基酰化酶拆分化学合成的 DL-氨基酸,
产生有活性的 L-氨基酸 。
已上市的酶抑制剂 ;
阿卡波糖,抑制葡萄糖苷酶活性,降血糖 。
洛伐他汀抑制 3-羟甲基戊二酰辅酶 A还原酶,降胆固醇 。
四,动物细胞培养技术
1838年 植 物 学 家 Schleiden和 1839 年 动 物 学 家
Schwann首次把细胞作为植物,动物的基本结构单元,创立了细胞学说,是 19世纪的三大发现之一 。
1885年德国 Roux用生理盐水培养鸡胚组织,1897
年 Loeb用血清和血浆培养结缔组织细胞,1907年
Harrison在无菌条件下离体成功地培养蛙胚神经组织,并使之生长,是现代动物细胞培养的开端 。
1923年 Carrel发明了卡士瓶培养法,1951年,
Earle等开发了培养基,动物细胞培养技术开始形成 。
动物细胞培养以成为重要的生物药物制造技术,
目前所用动物细胞：昆虫细胞,哺乳动物细胞,
鸡胚细胞等 。
动物细胞培养生产的药物有：病毒疫苗,如乙肝疫苗,脊椎灰质炎疫苗,狂犬疫苗等；非抗体免疫调节剂,如干扰素,白细胞介素,巨噬细胞激活因子等；多肽生长因子,如神经生长因子,成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,血清生长因子等；酶类,如组织血纤维溶酶原激活剂,VIII因子等；激素类如促黄体生成素,促滤胞素等 。 肿瘤特异抗原如癌胚抗原等；单克隆抗体；病毒杀虫剂如杆状病毒等；皮肤移植如单细胞培养等 。
五,植物细胞培养技术与转基因植物制药创始人德国 Haberlandt于 19世纪末期对植物细胞在培养液中培养,能存活一段时间 。 1902年他又对叶肉进行培养 。
到 30年代,利用组织培养可以使细胞分化成完整的植株,
Gautheret对烟草细胞,Nobercourt对萝卜细胞,White对杨树细胞成功培养 。
1958,Steward等从胡萝卜韧皮部组织培养出完整植株,
Visil Hildebrandt用烟草单细胞培养成可育完整植株,
1969,Nitch用花粉培养出单倍体植株,
1970,Steward用悬浮细胞培养出胡萝卜可育植株 。
Routier和 Nickell首先申请用植物细胞培养生产有机产物的专利 。
70年代以后,越来越多的植物被用来细胞培养,
快速繁育,离体保存和生产次生代谢产物 。
用高度分化的组织仍能培养发育成完整植株,即细胞的全能性是今天培养技术的基础 。
大规模细胞培养技术发展起来,如日本已开发
20000升搅拌斧式反应器生产烟草细胞 。
现在已生产的药物有奎宁,长春碱,吗啡,可卡因,莨菪碱,蛇根碱,阿托品,多巴,小檗碱等 。
农药有除虫菊脂,鱼藤酮等,食品类有紫草宁,
花青素和香精等 。
六,抗体工程技术抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫反应功能的球蛋白 。
1890年 Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素,
并建立了血清治疗法,开始了第一代抗体药物,
如破伤风抗毒素血清仍然在使用 。
1937年 Tiselius等电泳分离血清蛋白,发现抗体活性主要为 γ 球蛋白 。 在相当长的时间内,γ 球蛋白成了抗体的同义词 。
60年代,发现患骨髓瘤的病人血清中有与抗体分子结构类似的球蛋白,因此把具有抗体活性,化学结构与抗体相似的球蛋白通称为免疫球蛋白 Ig。
由于病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质,
因此制得的抗体是多种抗体的混合物,即多克隆抗体 。 这些抗体制剂在使用中经常发生非特异性交叉反应而导致假阳性结果,同时产量低,难以满足临床需要 。
1975年 Kohler和 Milstein把来自脾脏能产生抗体的
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞,进行原生质体融合,得到了通过离体培养就能产生单一抗体的杂交细胞,
即杂交瘤细胞 。 这是首次把杂交瘤技术应用于单克隆抗体的制备 。 与多克隆抗体相比,单克隆抗体具有高度特异性,均一性,而且来源稳定,可大量生产,成了抗体制备和生产的主要方法 。 单克隆抗体是第二代抗体 。
动物源性单克隆抗体在人体应用中,也存在抗原性,容易产生过敏反应,在体内易失效 。 人源单克隆抗体才是最终目标 。 因此产生了在基因水平对抗体结构进行改造的学科即抗体工程,通过原核微生物或昆虫细胞表达抗体的功能部分,制备嵌合抗体,并对抗体改形,变小,完全人源化抗体,这就是所谓的第三代抗体 。
1981年美国第一种单克隆抗体诊断试剂盒被批准进行商品化生产,至今品种已达数百种 。
至 2002年,FDA批准的临床治疗性抗体药物 10余种 。
抗体类型 商品名 应用鼠源单克隆抗体 Orthoclone 器官移植排斥嵌合抗体 Peopro 冠状动脉成形术,心绞痛嵌合抗体 Rituxan B细胞型非霍奇金淋巴瘤嵌合抗体 Simulect 器官移植排斥嵌合抗体 Remicade 回肠炎,类风湿性关节炎人源化抗体 Zenapax 器官移植排斥人源化抗体 Synagis 婴儿呼吸道合胞病毒人源化抗体 Herceptin 乳腺癌人源化抗体 Campath 慢性淋巴细胞白血病人源化抗体偶联物 Mylotarg 急性复发骨髓白血病鼠源抗体放射性偶联物 Zevalin B细胞型非霍奇金淋巴瘤七,基因工程技术基因工程是在体外对生物的遗传物质基因进行剪切,拼接,重新组合,与适宜的载体连接,构成完整的基因表达系统,然后导入宿主生物细胞内,
与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖,编码产生人类所需的物质或创造新的物种,
也可对疾病进行基因治疗 。
1973年重组 DNA技术的建立为标志,是科学技术史上的里程碑 。 应用于农业,医药,轻工,化工,
环境等领域,成为人类解决粮食,能源,环境,
制药的主要手段 。
1976年世界上第一家基因工程技术开发药物的公司 （ Genentech公司 ） 建立,开始了现代生物技术产业发展的新纪元 。 1982年世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素获得 FDA批准,由 Eli Lilly公司正式生产,推向市场 。
基因工程技术首先在医药领域实现产业化,到现在仍有 60％ ～ 80％ 集中在医药领域,占主要地位的是基因工程药物的研究和商品化 。
研究开发的治疗药物是癌症,心脑血管疾病,艾滋病,遗传病等重大病而用常规方法又难以获得的药物 。
年代 技术 贡献者
53 DNA双螺旋模型 Watson 和 Crick
58 DNA半保留复制和中心法则 Crick
61 遗传密码的碱基三联体 Crick和 Nirenberg
67 破译遗传密码 Khorana和 Nirenberg
71 首家生物技术制药公司成立 Cetus公司
72 体外重组 DNA Jackson和 Berg
73 重组质粒在大肠杆菌中表达 Boyer 和 Cohen
75 细胞融合,单克隆抗体技术 Kohler和 Milstein
76 首家基因工程技术制药公司成立 Genentech公司
78 大肠杆菌中表达出胰岛素 Genentech公司
80 转基因小鼠 Gordon等
82 基因工程人胰岛素在美国上市
Eli Lilly公司
82 转基因超级小鼠 Palmiter等
83 基因扩增的 PCR技术 Mullis
85 植物转基因技术 Horsch等
86 基因工程重组乙肝疫苗上市
Merck公司
87 转基因鼠乳腺表达药物 tPA Gordon等
90 人类基因组计划开始 美国
97 克隆动物绵羊多利,
转凝血因子 IX基因绵羊波利
Wilmut等
99 中国加入人类基因组计划
2000 绘制出人类基因组,工作框架图,
中,美,英,日,法,德等
6国
2001 完成人类基因组,中国卷,中国
2003 绘制出人类基因组,序列图,中,美,英,日,法,德等
6国第四节 生物制药的现状和展望现代生物技术发展迅猛，日益影响和改变着人们的生产和生活方式。生物技术引入医药产业，使得生物医药业成为最活跃、进展最快的产业之一。
2000年全球生物技术药物销售额为 300亿美元，美国约为 200亿美元，其次是欧洲和日本。而与此同时，全球医药市场销售额年递增幅度却远低于生物药物的发展水平 (近 10%)，显示出生物药物的良好发展势头，并呈现出加速的迹象。
一,国外生物制药全世界生物技术公司 3600多家,主要集中在欧美,
美国 1450家,欧洲 700家,加拿大 330家,日本也有几百家 。 年产值超过 10亿美元的生物技术公司有 20余家 。
美国是现代生物技术的发源地,又是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家,多数基因工程药物都首创于美国 。 年研究经费 70亿美元以上 。
1980年美国的生物技术产品的销额还是零增长,
1991:59亿 USD,1996:101亿 USD,基因工程药物为
80亿 USD,1997:130亿 USD,2001:270亿 USD。
美国 2001年已达 1450余家 。
从业人员达 19万人 。
形成规模化生产的有 Amgen,Biogen,Chiron,
Schering－ plough,Eli Lilly,Merker,Genentech,
Hoffman－ La Roche,Smith Kline Beecham,Ortho
Biotech等 20余家公司,其中 Genentech,Amgen、
Biogen,Chiron和 Genzyme的销售额名列前茅 。
2002年批准 35种药物,另外有 300多个品种进入临床实验或待批阶段 。
到 2002年底,FDA批准 234种生物技术药物和疫苗 （ 包括新的适应症 ） 正式投放市场,其中新生物技术药物和疫苗为 141种 。
二,国内生物制药
20世纪 80年代是我国生物制药的起步阶段,
1983年成立生物工程开发中心,,七五,期间投资成立了基因工程药物,生物制品,疫苗三个研究开发中心 。 项目主要集中在肝炎,疫苗,血液制品等产品,企业数目极少 。
1986年我国生物技术尚处于研发的初期,仅有单克隆抗体诊断试剂盒,微生物农药等少数,少量产品,医药产品的产值约为 0.2亿元,占生物技术产品销售额的 8％ 。
20世纪 90年代,企事业单位齐头并进,大发展 。
国外主要的基因工程药物及疫苗,都能生产,
到 1996年医药产品的销售额达为 2.2亿元,其中基因工程药物和疫苗占 10.5％ 。 1998年,基因工程药物销售额达 7.2亿 。 代表性的产品 rhuIFN-
α 1b,直到 1989年申报新药,1993年批准试生产 。
通过国家 863计划,科技攻关计划,火炬计划及
973等国家计划的实施,使这一领域发展迅速,逐步缩短了与先进国家的差距,产品从无到有,不断发展壮大 。
经过十几年的努力,我国在生物技术领域取得了较快的发展,与世界先进国家的差距明显缩小,
尤其是在基础技术和实验室阶段,许多领域已接近国外先进水平 。
1000多家单位从事生物工程研究,生产和开发工作 。
注册的生物技术公司共有 200家左右,真正涉及到基因工程技术的不到 100家,
基因工程药物并已在有关部门登记立项的公司 60家,
取得生产基因工程药物试产或生产批文的企业约 50家 。
2000年底,我国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计 20余种,其中一类新药有重组人干扰素 α 1ｂ,重组碱性成纤维细胞生长因子 （ 外用 ）,重组人表皮生长因子
（ 外用 ） 和重组链激酶,其他药物有重组人干扰素 α 2ａ,
重组人干扰素 α 2ｂ,重组人干扰素 γ,重组人白细胞介素 -2,重组人 G-CSF,重组人 GM-CSF,重组人红细胞生成素,重组人胰岛素和重组人生长激素,胸苷激酶,TNF衍生物,疫苗有重组乙肝疫苗和重组痢疾菌苗 。
三,生物制药发展方向生物技术药物与化学药物和中药将形成三足鼎立的局面 。
生物制药发展的几大重点领域：诊断与检测试剂,
新型基因工程疫苗,基因工程活性肽和蛋白质,
治疗功能基因药物,转基因动植物反应器 。
发展蛋白质工程药,
天然存在的生化药物，广义地说都可以认为是新药寻找的先导化合物。根据人类对蛋白质结构和功能关系的了解，借助电子计算机技术，把分子生物学、基础医药学、药物化学、药理学等的知识综合起来，进行新型药物的设计，可以制成上万种新的化合物。目前的上市的药物约 5000个，
制药工业的药物靶点为 483个，其中 45％为细胞膜受体,28％为酶，其余为激素、离子通道、核受体和 DNA等。人类基因组测序已经完成，约 3～ 4个基因，药物靶点将增加 10倍,3000～ 5000个潜在的基因可能成为药物的蛋白质。
改造抗生素等药物生产的传统工艺技术：
利用现代生物技术,重点利用基因工程技术和原生质体融合技术构建新菌种,改造抗生素,维生素,氨基酸等产品的生产菌种,提高发酵水平,
降低消耗 。 在目前各类药物中,抗生素用量最大,
应研究采用基因工程与细胞工程技术和传统生产技术相结合的方法,选育优良菌种,固定化与生物转化相结合,研究大规模半合成工艺抗生素的生产技术,应用现代生产技术生产高效低毒的广谱抗生素 。 应用微生物转化法与酶固定化技术发展氨基酸工业和开发甾体激素,并对现在传统生产工艺进行改造 。
开发预防,诊断与治疗性疫苗：
研究新型疫苗,诊断试剂和生物技术药物,人源化的单克隆抗体,血液替代品,大力开发疫苗与酶诊断试剂 。
抗体可以对抗各种病原体,亦可作为药物的导向 。
单克隆鼠源抗体,会产生抗体或激发免疫反应 。
国外研究噬菌体抗体技术,嵌合抗体技术和基因工程抗体技术以解决人源化抗体问题 。
大批混合的人体血浆制成的血液制品,由于人血难免被各种病原体所污染,如艾滋病病毒及乙肝病毒等,通过输血而使患者感染案例时有发生,
利用基因工程开发血液替代品引人注目 。
采用基因工程和细胞工程技术，生产濒危和稀缺中草药及其有效生物活性成份。
中草药及其有效生物活性成份的发酵生产。中草药经发酵、转化后，其有效成分能被充分分离、
提取，使其更具有生物活性，服用后能被人体组织细胞迅速吸收，达到祛病、健体、双向免疫调节的功能，更好地发挥中草药这一天然药物的药效作用。因此，应用现代生物技术大规模工业化提取中草药的有效生物活性成份，发展具有中国特色的中药生物技术。
基因治疗药物,
基因治疗是将外源正常功能基因通过载体导入人体内，通过基因置换或替补缺陷基因，或使靶细胞形成三链构象，阻断基因的异常表达，使新的遗传物质或调控遗传物质转移到患者个体细胞内，
以达到治疗效果。
1990 年临床首次将腺苷酸脱氨酶基因导入患者白细胞，治疗遗传病重度联合免疫缺损病以来，
到 1998年接受基因治疗的病人已达 400多例。基因治疗掀起了一场临床医学革命。
开发靶向肿瘤药物,
治疗肿瘤药物确实存在一个所谓,敌我不分,的问题。在杀死癌细胞的同时，也杀死正常细胞。
抗体的导向治疗可望解决此问题。利用抗体寻找靶标，如导弹的导航器，把药物准确引入病灶，
而不伤及其他组织和细胞。
开发现有生物术产品的新剂型,包括涂剂,栓剂,
气雾剂,滴剂等 。
生物药物易受胃酸,消化酶的的降解破坏,其生物半衰期较短,给药次数频繁 。 即使皮下和肌肉注射,生物利用度也较低 。 这与蛋白质药物的亲脂性差,难以通过生物屏障有关 。 但可以通过化学修饰制成前药,使用吸收促进剂和酶抑制剂,
增加透皮吸收和各种新的给药途径得以解决 。
生物药物制剂的主要方向是合理方便的给药新途径和新剂型,填埋剂,微球缓释剂型,纳米给药系统；非注射剂型也受到极大关注,呼吸道吸入,
直肠给药,鼻腔,口服和透皮等剂型 。
思考题
（ 1） 名词解释：生物药物,生物技术药物,生物制品
（ 2） 分析现代生物技术制药 （ 包括研发和生产 ）
的特征及发展趋势,比较与化学制药的异同 。
