第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺药用蛋白质的合成复杂,要有精确折叠的空间结构,
要有糖基化,才能使药物发挥真正的功能 。 细菌和酵母等产品要么是包涵体,要么难以糖基化功能修饰 。 动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质,大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要 。
人畜病毒疫苗,口蹄疫苗,狂犬病疫苗,牛白血病和脊髓灰质炎,乙肝疫苗 。
干扰素,单克隆抗体,重组基因工程产品 。
组织型血纤蛋白溶酶原激活剂,免疫珠蛋白 G,M,尿激酶,人生长因子等 。
第一节 动物细胞制药的表达系统与特征昆虫系统,哺乳动物细胞系统,最成功,重要表达活性外源蛋白的有效系统,应用于药物蛋白质的表达 。
一,哺乳动物细胞表达系统与特征
1,动物细胞的特征细胞膜,细胞质和细胞核没有细胞壁 。
亚细胞器,功能独特 。
2,动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域 。 通过胞内运输 （ 囊泡包裹 ） 实现区域之间的物质,信息和能量流动,通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换 。
在动物细胞培养中,葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体,因此动物细胞的培养具有一定的灵活性 。
葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿,反之亦然 。
谷氨酰胺是动物细胞的氮源,谷氨酰胺受限时,可增加其他氨基酸的消耗得以补偿 。
糖代谢特点：
动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。
丙酮酸还可转化为乙酰辅酶 A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生 CO2和水。小部分（ 4％～ 8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为 4,5,7碳糖和还原力
NADPH,5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。
葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。
氨基酸代谢特点：
吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。
大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，
对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、
嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。
谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物 α -酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。
不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。
在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。
在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以 ATP和
NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。
常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。
3,蛋白质糖基化蛋白质合成是以 mRNA为模板,在核糖体上完成 。 而蛋白质的糖基化无需模板指导,因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化 。
糖蛋白的单糖单元,α-D-葡萄糖,α-D-半乳糖,α-D-甘露糖,α-D-木糖,α-D-岩藻糖,N-乙酰 -α-D-葡萄糖胺,N-
乙酰 -α-D-半乳糖胺和 α-N-乙酰神经氨酸 （ 或唾液酸 ） 。
糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为 N-
糖基化,或与氧原子结合为 O-糖基化 。 这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同 。
N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上,其模体的保守序列为 Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨基酸 )。 如果 X为 Trp,Asp,Glu和 Leu,对糖基化有负影响,而第三位 Thr能增强糖基化 。
N-糖基化分为高甘露糖型,复合型和杂合型三种类型,共同核心是 3个甘露糖和 2个 N-乙酰葡萄糖胺组成的 5糖
（ Man3GluNAc2）,其他糖形成支链 。
高甘露糖型的支链为甘露聚糖 （ 5～ 9聚体 ）,无其他糖 。
复合型含有 2个以上支链,如乙酰半乳糖胺,果糖和唾液酸等 。
杂合型至少含有一条复合糖链,另一个链含有甘露糖 。
O-聚糖连接在 Thr/Ser的羟基上,还没有发现保守序列 。
O-聚糖有四种不同的核心结构,都含有 N-乙酰半乳糖胺基,糖基化会影响蛋白质的局部构象 。
O-糖基化比较小,一般为 1～ 6个寡聚糖,但比 N-糖基化变化更大 。
O-糖基化只在高尔基体上进行,糖基单元有木糖,葡萄糖 。
糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用,都具有相同的核心结构：胆胺 -PO4-Man2-
GlcHN2-肌醇 -PO4-脂 。
胆胺形成膜内蛋白的桥,而肌醇在膜内 。
在细胞培养生产重组蛋白时,磷脂酶 C可切割此类蛋白,
有利于纯化 。
细胞特异性糖基化途径 —— 淋巴细胞中进行,它不依赖于内质网和高尔基体 。
IgG的糖基化,等分 GlcNAc残基连接在核心甘露糖上,该糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用 。
IgG蛋白的铰链区,富含 Ser,Thr和 Pro,5个 Ser全部糖基化 。
促黄体激素,促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生 。
尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。
鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。
CHO细胞不能合成等分 N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。
要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。
细胞系 Fuc Gal 唾液酸
α1,6 α1,3
Fuc
α1,3
Gal
SO4-
GalNAc α2,3
α2,
6
糖基化 等分GluNAc
BHK ++ 0 + 0 ++ 0 - 0
CHO ++ - 0 0 ++ 0 + 0
鼠杂交瘤 ++ 0 ++ 0 ++ 0 +++ 0
C127 ++ 0 ++ ++ ++ +
+
+++ 0
J558L ++ 0 ++ - ++ +
+
+++ 0
人淋巴细胞 ++ 0 0 0 + + 0 ++
人垂体 ++ 0 0 +++ + + 0 ++
Namalwa ++ 0 0 0 ++ +
+
- -
人鼠杂交瘤 ++ 0 0 0 + + + 0
2,哺乳动物细胞表达系统基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞系,即永久性细胞 。 表达的蛋白质能正确加工,修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子,接近或类似天然产物 。
糖基化等修饰是糖蛋白行使功能所必需的,而且对产品质量有影响,如生物活性,稳定性,免疫原性等 。 原核细胞表达的 EPO无糖基化,在体内表现无活性 。 原核表达的
GM－ CSF虽有活性,但在体内产生抗体 。
动物细胞表达产物分泌到培养液,容易分离纯化 。 约有 70
％ 批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造,而且数目还在不断增加 。
表达系统 O-糖基化 寡聚甘露糖 高甘露糖 复合体大肠杆菌 0 0 0 0
酿酒酵母 ＋＋ 0 ＋＋＋
＋
－
昆虫 Sf9 ＋＋ ＋＋＋＋ 0 －
仓鼠 CHO ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
仓鼠 BHK ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
鼠杂交瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
鼠骨髓瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
C127 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
J558L ＋＋ － 0 ＋＋
人淋巴细胞 ＋＋ 0 0 ＋
Namalwa ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
人鼠杂交瘤 － ＋＋ 0 ＋＋
大肠杆菌 酵母 哺乳动物细胞产物浓度 高 高 低分子量 低 高 高二硫键 有限 不受限制 不受限制分泌 无 有或无 有形式 包涵体 单链,天然 单链,天然折叠 不正确 正确 正确糖基化 无 可能 完全逆转录病毒 无 无 可能热原 可能 无 无培养特点 容易 容易 较难,成本高分离纯化 复杂 复杂 简单细胞类型 表 达 水 平
（ μg/ml）
猴 CV1 1～ 10
猴 CV1 0.05
猴 COS 1
小鼠成纤维细胞 C127 1～ 5
小鼠成纤维细胞 3T3 0.1～ 0.5
CHO（ dhfr－ ） 0.01~0.05
CHO（ dhfr－ ） 10
动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢,生产效率较低,
产量远远落后于其他表达系统 。
骨髓细胞 MPG－ 11生产 IgG的能力为 5pg/(细胞,分钟 )，
10L反应器,密度为 107/ml,生产能力不到 1g/d。
连续细胞系增加了生长和代谢速率,但同时导致了副产物的增加 。
动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感,对温度,pH,渗透压,剪切力等忍受能力差 。 培养基要求高,需要添加氨基酸,维生素等,往往需要附加血清,提供生长因子,费用较高 。 同时可能有潜在的致病因子,免疫原性存在 。
表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系统的研发重要内容 。
3,昆虫细胞表达系统与特征表达载体为昆虫病毒,转染昆虫细胞,表达出目标蛋白质 。
昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒 。
苜蓿尺蠖核多角体病毒－秋黏虫细胞表达系统,家蚕核多角体病毒－家蚕幼虫表达系统 。
Micro－ Gene Sys公司表达艾滋病基因工程疫苗,随后猪生长素,CD4膜蛋白及疟疾疫苗,鸡新城病毒疫苗,血吸虫 GST疫苗,乙肝表面抗原,重组人 GM－ CSF等 。 日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市 。 生物试剂盒的标准品大多用昆虫表达系统生产 。
至少有 600多种昆虫可以作为宿主,每年有数百个基因利用昆虫系统进行表达,越来越成为非常有用的表达宿主 。
优点
1） 安全：杆状病毒无致病性,产品安全性受 FDA认可 。
2） 易饲养：家蚕丧失了野外生存能力,饲养,发育快,
3） 高量表达：用强启动子,外源基因可超量表达 。 表达产物在昆虫细胞内能结晶,对产物纯化非常有意义 。
4） 高效表达：可容纳较大的外源基因 （ 12kb）,表达数个外源基因,并且正确装配成有功能的分子 。 如表达抗体的重链和轻链,自主装配成有功能的抗体 。
5） 翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工,
包括糖基化,脂肪酸酰基化,磷酸化,氨基酸的乙酰化,
氨酰化等,大部分产物显示出良好的活性 。
缺点：
1） 重组率低,筛选困难,周期长,需要 4－ 10天 。
2） 外源基因的表达在转染的晚期,大约在 20h后起始基因表达,在 72－ 94h细胞裂解死亡,基因表达时间约 30－
50h,高水平表达不连续且时间短,这对表达不利 。
3） 昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同,它不提供复杂的 N糖基化,如添加半乳糖和唾液酸残基,有可能造成溶解性,稳定性,免疫性等变化 。 表达水平非常高,加工装备跟不上,蛋白质修饰效率可能不高 。
研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；
决定基因表达时期启动子,无血清培养昆虫细胞系 。
第二节 基因工程动物细胞系的构建构建高效表达载体转染动物细胞筛选鉴定获得生产用工程化细胞系动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。
病毒载体：
逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。
同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。
痘病毒载体可插入 25～ 40 kb外源基因，甚至是多个基因。
无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。
美国 Genentech公司已用 SV40载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。
质粒载体：
微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。
大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。
抗生素抗性标记，原核细胞筛选。
动物细胞的复制子，
在宿主细胞中稳定表达。
还有丝状噬菌体复制子。
启动子序列：含有 RNA聚合酶识别和结合位点,以便有效转录 。 TATA盒,确定起始位置； GG盒,影响转录频率 。
来源于病毒,动物基因和噬菌体的启动子 。
动 物 病 毒 启 动 子,逆 转 录 病 毒 的 长 末 端 重 复 序 列
（ LTRS）,SV40病毒的早期和晚期启动子,腺病毒的晚期启动子,人巨噬病毒 （ CMV） 立即早期基因启动子 。
动物基因的启动子：转录因子 EF-1α启动子,泛素蛋白启动子,β-肌动蛋白启动子,干扰素 -α启动子,IgG启动子,
鼠金属硫蛋白基因启动子等 。
噬菌体 T7启动子比动物基因启动子表达水平高 。
PolyA信号序列：保持 mRNA的稳定性,防止降解,保证了转录产物的加工和正确性,但序列不宜太长,避免能量过度消耗 。 添加 PolyA信号和 5′端转录暂停位点,可以减少上游序列转录通读造成的背景 。
牛生长素 （ BGH） 基因的 PolyA信号比 SV40 PolyA更强,
常用于高效表达载体中 。
终止序列,AAUAAA或连续的终止密码 UGA,UAA和
UAG,能防止转录通读,使转录在正确的位点结束 。
在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子,有利于提高外源基因的转录水平 。
双顺反子表达载体：
两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一 mRNA中的第二个基因得到翻译。将 dhfr与目标基因串连,dhfr的 cDNA插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。
顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。
使筛选容易，而且能高效表达。
选择适宜的启动子,可实现定向表达 。
CMV启动子和人 EF-1α启动子,可实现同一载体上的二个基因的独立表达 。
组织特异性启动子：如鼠,山羊酪蛋白启动子,可使基因主要在乳腺中表达 。
N端设计分泌信号肽：如 Ig κ链的可变区和恒定区之间序列,使外源基因的表达产物向胞外分泌 。
C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面 。
亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核,线粒体,内质网或细胞质中,这对基因的功能研究非常合适 。
基因的扩增系统：
在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。
最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（ DHFR）基因系统和谷氨酰氨合成酶（ GS）基因系统。
氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使 dhfr基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。
硫胺蛋氨酸使 GS系统的基因得到大量扩增。
二,受体细胞
1,人源细胞株系
Namalwa：类淋巴母细胞,非整体核型 。 表达 IgM,悬浮生长 。 外源基因的表达水平较高,可用无血清培养基高密度培养,已成功地表达了 rhEPO,rhG-CSF,tPA等 。 英国 Wellcome公司用 Namalwa细胞的反应器达 8000L,用
Sendai病毒诱导,大规模生产 α干扰素,并批准上市 。
WI-38：二倍体成纤维细胞系,2n=46,第一个被用于制备疫苗 。 贴壁生长,对很多病毒敏感,广泛用于疫苗生产 。
MRC-5：二倍体成纤维细胞系,但生长较 WI-38快,对逆境有一定抗性也用于制备疫苗 。
2,哺乳动物细胞株系
CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系,贴壁型生长,是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞 。 核型为亚二倍体,分泌表达外源蛋白,而内源蛋白分泌很少 。 贴壁型生长细胞,但可进行悬浮培养,
对剪切力和渗透压有较高的忍受能力 。 蛋白质翻译后的修饰准确,表达产物的结构,性质和生物活性接近天然 。
有多种衍生突变株应用于药物的生产,培养时需要添加脯氨酸 。 二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有 tPA,EPO、
HBsAg疫苗,G-CSF,凝血因子 Ⅷ,DNA酶 Ⅰ,已上市 。
使用氨甲酰喋呤,增加外源基因的拷贝数,提高蛋白质表达水平 。
BHK－ 21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞,非整倍体 。 用于增殖病毒,制备疫苗和重组蛋白 。 BHK-21表达的重组凝血因子 Ⅷ 已被获准上市 。
C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞,贴壁型生长 。 C127细胞系已表达多种外源基因,其中 EPO的水平达 10 mg/L,生产 rhGH已被批准上市 。
3T3,HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。
骨髓瘤细胞,J558L是小鼠 BALB/c骨髓瘤细胞,分泌 IgA，
用于转染研究 。 NSO和 SP2/O－ Ag14不分泌 Ig,与淋巴细胞融合筛选杂交瘤,分泌制备特异性抗体 。
杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系,能在无血清培养基中高密度悬浮生长,容易转染和生长,能进行糖基化等加工修饰,大量分泌和高效表达 。 很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备 。
Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，
多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用 Vero E6增殖多种病毒，
如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，
已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。
COS：是从 SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞 CV1中分离得到的,广泛用于外源基因瞬时表达的研究 。
GH3用于生长激素研究,293细胞系用于基因治疗的研究。
3,昆虫细胞株系
Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到,细胞较大,容易放大,高效表达外源基因 。
Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞 （ SF21） 中分离得到,是最常用的昆虫表达细胞 。 对杆状病毒高度敏感,生长快,能高效表达外源基因 。 抗机械剪切,能在无血清培养基的搅拌反应器中生长 。
TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到,无血清培养,快速倍增 。 分泌表达重组蛋白的能力比 Sf9细胞系高 20多倍,能适应悬浮培养 。
三,细胞转染转染 （ 是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称 。
基因导入真核细胞的方法很多,主要有化学转染,物理转染和病毒介导的转化 。
方法 表 达 类型毒性 细胞类型 特点基因枪 瞬时,
稳定无 多种细胞组织,器官有效,仪器操作显微注射 瞬时,
稳定无 多种细胞 有效,技术难度大电穿孔 瞬时,
稳定无 多种细胞 有效,仪器操作冲击波 瞬时,
稳定无 多种细胞,
局部组织简单有效,
仪器操作方法 表达类型毒性 细胞类型 特点逆 转 录 病毒瞬时,
稳定无 对应的宿主细胞有效原 生 质 体融合瞬时,
稳定无 悬浮细胞 技术复杂生物转染特点化学转染是最常用的转染方法。
其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（ DEAE）－葡聚糖
（ dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。
磷酸钙与 DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的 DEAE－葡聚糖与带负电荷的 DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹
DNA形成脂质体。
渗透性休克和 DMSO等化学试剂能促进 DNA进入细胞。
转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。
影响因素：细胞培养物的密度,DNA的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。
方法 表达类型毒性 细胞类型 特点磷酸钙 瞬时,
稳定无 贴壁细胞,
悬浮细胞简单
DEAE-葡聚糖瞬时 有 CV1,COS 简单阳离子树脂 瞬时,
稳定有或无贴壁,原代悬浮细胞简单,有效化学转染的特点四,转染体筛选与分离转染后 1～ 6天收获细胞,进行核酸分子杂交或蛋白质杂交,检测外源基因的瞬时表达 。
为了获得稳定整合的细胞系,先在非选择性培养基上培养 24～ 48小时,让细胞倍增 1～ 2代,使转染 DNA表达 。
再按 1,15比例转移到选择性培养基上,每 2～ 4天更换培养基,持续 2～ 3周,促进抗性细胞生长,清除死细胞残骸,最后得到独立的克隆 。
在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，
因此需要显性选择标记来分离转染细胞。
哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。
选择剂 基因 使用浓度氨甲喋呤 dhfr－ 0.01～ 300μmol/L
氨喋呤 tk＋ 0.4 μmol/L
5-溴脱氧尿苷 tk－ 30 μg/ml
G418,Zeocin neo 100～ 800μg/ml
潮霉素 B hyg 10～ 400μg/ml
杀瘟稻菌素 bsd 2～ 10μg/ml
霉酚酸 gpt 25 μg/ml
嘌呤霉素 乙酰基转移酶 0.5～ 10μg/ml
Xyl-A ada 4 μmol/L
报告基因 特点 使用与分析方法
cat 内源活性低,蛋白稳定,线性范围窄,
体外,荧光或免疫分析
lacZ 有内源活性,X-gal染色,线性范围宽体内外,染色,比色,
化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型,线性范围宽,
受到细胞类型限制体外,比色,化学发光或荧光分析
gus 蛋白质稳定,线性范围宽,X-Gluc染色体内外,染色,比色,
化学发光或荧光分析
gfp 无内源活性,分子量小,
稳定,无需底物,紫外线激发体内外,荧光分析第三节 动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞离体后,失去了消化等系统,不能利用多糖,
蛋白质等聚合程度高的化合物 。
只能利用简单的单体化合物如单糖,氨基酸等,为了维持细胞正常生长,还必须添加维生素,无机盐类,
生长类因子及激素,结合蛋白质,贴附与伸展因子及其它附加成分等 。
动物细胞对培养环境的要求高,不同细胞系的要求也不尽相同,培养基要尽可能与体内生活条件接近 。
一,动物细胞培养的营养需求
1.糖类糖类是细胞主要的营养物质,分解后释放出能量 ATP。
培养基中都必须添加葡萄糖,有时添加核糖等 。
提高细胞生长的碳源和能源,主要是葡萄糖和谷氨酰胺 。
2,氨基酸氨基酸是蛋白质和酶的组成单位 。 氨基酸还参与合成一些含氮化合物,核苷酸的四种嘌呤和嘧啶碱基,儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等 。 氨基酸可通过生糖或生酮途径转变为糖或脂肪酸,间接提供能量 。
动物细胞,8－ 10种必须氨基酸 。
离体容易失去,20种氨基酸中至少 12种是必需氨基酸：
精氨酸,半胱氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,
蛋氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,缬氨酸等 。
谷氨酰胺还可作为重要的碳源和能源而被利用 。
3,维生素维生素是一类微量的小分子有机生物活性物质,对代谢和生长起调节和控制作用 。
水溶性维生素包括 B族维生素和维生素 C。 B族维生素以辅酶或辅基形式参与酶反应,主要调节酶活性和代谢活性 。
维生素 C,抗坏血酸,在体内参与还原反应,羟化反应,
促进胶原蛋白合成和粘多糖合成,抗氧化作用 。
脂溶性维生素包括维生素 A,D,E,K四种 。
维生素 A维持正常视觉和上皮组织 。 维生素 D为视固醇类化合物,主要是调节钙磷代谢 。 维生素 E即生育酚,是抗氧化剂,防止生物膜中磷脂的不饱和脂肪酸被氧化 。 维生素 K,促进合成凝血酶原,促进血液凝固 。
5,无机盐类无机盐是细胞代谢所需的酶的辅基,同时保持细胞的渗透压和缓冲 pH的变化 。
Na＋ 和 Cl－ 参与生理电活动,维持水平衡,保持渗透压和酸碱平衡 。 离体培养为细胞提供足够的 Na和 Cl离子是基本条件,一般生理盐水的离子浓度 （ 0.9% NaCl） 。
Ca2＋,Mg2＋,对细胞间的互黏稳定起重要作用 。 在离体培养时,螯合细胞间的 Ca2＋ 和 Mg2＋,可以达到分散细胞的目的 。
磷是核酸,磷脂等的组成成分 。
碳酸盐缓冲液是重要的体内缓冲体系,与 K＋,Cl－ 等在维持酸碱平衡具有重要作用 。
6,生长类因子及激素细胞之间是相互联系的,而非孤立的 。 特别是高度分化功能的动物细胞更是如此 。
细胞离体生长时,必要添加激素与细胞生长因子等 。 胰岛素是最常用的激素,促进糖原和脂肪酸的合成,对细胞的生长有刺激作用 。 其它激素有促卵泡激素,甲状腺素,乳激素,生育酚等 。
细胞因子有表皮生长因子,成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子,根据不同细胞添加 。
为了细胞的贴壁生长,必需添加贴附因子,纤维结合蛋白,
胶原等,伸展因子如表皮生长因子,成纤维细胞因子等 。
二,动物细胞培养的环境需求
1,水与渗透压细胞生长离不开水,水是细胞反应的重要介质 。 1） 水是一种良好的溶媒,营养物质在水中被吸收,废物在水中被排泄 。 2） 具有热稳定性和导热性,调节稳定温度 。
正常血浆渗透压主要是无机盐 Na＋,K＋,Cl－,HCO3－
等构成,蛋白质构成胶体渗透压较小 。
动物细胞对渗透压有较强的耐受性,常用增减 NaCl的浓度调整渗透压,每增加 1mg/ml NaCl,渗透压增加 32
mOsm/kg。
离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液 。
2,温度不同种类的动物细胞对温度的要求是不同的,变温动物对温度要求没有恒温动物严格 。
哺乳动物细胞最佳培养温度为 37℃,鸡细胞为 39－ 40℃,
而昆虫类细胞为 25－ 28℃ 。
在培养过程中,根据细胞种类选择确定适宜的培养温度 。
哺乳动物细胞的耐受温度范围较窄,在 35-37℃ 内能正常进行代谢和生长,超出范围会引起细胞伤害甚至死亡 。
细胞对低温的耐受性比高温要强,低温抑制生长,但无伤害作用,在冰点温度附近仍能存活 。
3,氧气动物细胞生长必须有氧气,无氧下,能获得能量供应,但细胞缺氧时不能生存 。 离体培养的气体含有 5％ CO2和 95
％ 空气,其中氧浓度为 21％ 。 有时充以 N2气稀释 O2浓度 。
O2浓度在 60%以上为高氧环境,对细胞毒性较大 。
4,pH值动物细胞对 pH值很敏感,低于 6.8或超过 7.6会产生严重影响 。 机体细胞的 pH范围为 6－ 8,血液和体液中,变化范围很小 。 人血液 pH维持 7.36-7.44。 pH低于 7.05会发生酸中毒,高于 7.45发生碱中毒 。 细胞代谢产生 CO2,使培养液变酸,pH发生波动 。 合成培养基偏酸性,为了稳定 pH，
可用缓冲体系配制 。 在开放体系中,CO2逸出,使培养基变碱 。 通入 5％ CO2,可维持在 pH7.2-7.4范围内 。
5,生长基质改变生长表面特性,促进细胞贴附的物质 。
贴附细胞生长需要一个支持介质,采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质,帮助细胞的贴附和生长 。
生长基质为胞外基质成分,多聚赖氨酸,纤维连接蛋白,
胶原,层黏蛋白,韧黏素等 。
生长基质已有商业化产品,用 PBS或 BBS配成 10倍贮存液,
在 37℃ 下包被,静置 2－ 4小时或室温过夜,对器皿表面进行包被,然后无菌生理盐水洗涤后使用 。 有些还可以直接加入培养液 。
生长基质 贮存液浓度 使用浓度 使用方法多聚赖氨酸 0.5 mg/L 0.05 mg/L 表面包被纤维连接蛋白
10 mg/ml 1 mg/ml 加入培养液层粘蛋白 5～ 10μg/ml 表面包被韧粘素 75 μg/ml 5～ 15μg/ml 包被或加入培养液胶原蛋白 1～ 3 mg/ml 0.1 mg/ml 表面包被
6,抗生素动物细胞培养过程中,由于培养基营养丰富,很容易被微生物污染 。 虽然对使用抗生素仍存在质疑,但还是常添加抗生素,以避免轻度污染 。
抗生素使用浓度差别很大,一般范围为 50～ 100 μg/ml。
在大规模生产中,除了青霉素和 β-内酰胺类抗生素外,
其它抗生素可以使用 。
抗生素使用对细胞会产生毒性,而且使实验室保留抗药性微生物,应加以注意和克服 。
抗生素 作用对象 工作浓度 （ μg/ml） 稳定性 （ 天 ）
两性霉素 B 真菌 1～ 2.5 3
制霉菌素 真菌 50 3
氨苄青霉素 G＋,G－ 细菌 100 3
红霉素 G＋ 细菌,支原体 100 3
四环素 G＋,G－ 细菌,支原体
10 4
庆大霉素 G＋,G－ 细菌,支原体
50 5
利福平 G＋,G－ 细菌 50 3
卡那霉素 G＋,G－ 细菌 100 5
链霉素 G＋,G－ 细菌 100 3
氯霉素 G－ 细菌 5 5
青霉素 G G＋ 细菌 100 3
三,动物细胞培养基的种类与组成动物细胞对培养基的要求高,不同细胞系的要求也不尽相同,因此培养基成分复杂而且昂贵 。 但是要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境 。 主要组成成分如下：
糖类,必需氨基酸,维生素,无机盐类,生长类因子及激素,结合蛋白质,贴附与伸展因子及其它附加成分等 。
不同细胞对葡萄糖利用相似,但对氨基酸的利用相差很大,
不同的细胞过程对氨基酸的需求存在差别 。 目前停留在流加谷氨酰胺上 。
血清：蛋白质,氨基酸,葡萄糖,激素和生长因子等 。
胎牛血清,新生牛或成牛血清,马血清,鸡血清,羊血清及人血清,最广泛应用的为胎牛血清和新生牛血清 。
水解乳蛋白和胶原富含氨基酸 。 血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养 。
脂类化合物对动物细胞培养是必需的,实际中类脂及其前体和血清常平行使用 。 添加的蛋白质试剂主要有铁传递蛋白,起离子载体的作用,有时用无机铁盐代替 。 胰岛素起生长素的作用,白蛋白起保护剂作用 。 其他附加成分如核苷类及丙酮酸盐等是培养基的必需成分,有助于细胞克隆和特异化细胞的培养 。
动物细胞培养过程中,被微生物污染 。 常添加抗生素,
以避免轻度污染 。
1,天然培养基直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基,如血浆凝块,血清,淋巴液,胚胎浸出液等 。 营养价值高,成分复杂,不稳定,来源受到限制,不宜大量培养和生产使用 。
2,合成培养基合成培养基用化学成分明确的试剂配制的培养基,组分稳定 。 现在已有几十种合成培养基,大部分已商品化 。
组成：无机盐,糖,氨基酸,维生素及其他成分 。
由于细胞种类和培养条件不同,所用合成培养基也不同,
在动物细胞培养中最常用培养基有 7－ 8种 。
3,无血清培养基无血清培养基是全部用已知成分组配的,不加血清的合成培养基 。 在含有营养和贴壁因子的基础培养基中,加入适宜的细胞生长因子,细胞良好生长,适合于制药生产 。
无血清培养基提高了培养的质量,避免了使用血清带来的麻烦,产品纯化容易,组分稳定,可大量配制 。
无血清培养基通常需要添加激素与生长因子,结合蛋白,
贴壁与伸展因子,低分子营养成分等 。
大多数无血清培养基含有蛋白质和激素等大分子物质,适宜于多种细胞系的培养 。 对于大规模生产用的无血清培养基,往往成分不完全清楚,但简单而且低成本 。
四,培养基的控制
1,培养用水质细胞培养水质最低要求电导率在 1X106Ω cm以上 。 水存放时间不宜超过 2周 。 对于制药,必需使用纯净水配制培养基,普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物,还必需除热源,达到纯净水标准 。
2,缓冲液缓冲液：弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成的,pH恒定但不干扰试验 。 不同种类细胞对 pH 要求不一致,不同生长阶段对 pH要求也不同 。 原代细胞 pH要求严格,而传代细胞要求较宽 。 细胞培养过程中代谢产生酸性物质,使培养基的 pH不断下降 。 缓冲液中和培养液中的酸性物质 。
最广泛使用为碳酸氢钠 /碳酸,其次为磷酸二氢钠 /磷酸氢二钠,调节二者的比例,配制成不同 pH缓冲液 。
碳酸盐缓冲液除了直接的缓冲作用外,还有间接作用,碳酸生成挥发性 CO2后很快逸出 。 细胞呼吸产生的 CO2与水形成碳酸,任何碱在培养液中都被中和,生产相应碳酸氢盐其他缓冲液,Tricine-Glycine,MOPS,TES,HEPES,
DIPSO,HEPPSO 等等有机缓冲液,缓冲能力强 。 Tris
所含氨基具有高的化学反应活性,能抑制细胞生长,并通过生物膜,它调节 pH要依赖于温度的变化,因此不宜作为培养液 。 离体培养中,缓冲液多为平衡盐溶液的重要组分之一,很少单纯使用 。
3,生理盐水与平衡盐溶液在缓冲液的基础上,添加调节渗透压的盐类,在一定程度上能满足细胞对 pH和盐离子要求 。
缓冲液或缓冲盐溶液用于,配制溶液,处理细胞的溶液 。 对于直接接触,长期培养的培养液,常用生理盐水和平衡盐溶液,是渗透压与胞浆渗透压平衡的溶液 。
生理盐水供给细胞水分和各种离子,维持一定渗透压,并能良好溶解试剂和药物 。 有各种不同成分的生理盐水,分别加入 pH缓冲剂与指示剂,葡萄糖,形成平衡盐溶液 。
平衡盐溶液：集缓冲液的缓冲能力,生理盐水的等渗能力,
营养供给为一体,具有多种功能和作用 。
BSS配制：
1） 先分别溶解 CaCl2,MgCl2,MgSO4。
2） 在另一容器中依次溶解其他试剂 。
3） 在另一容器中用 5.6% NaHCO3数滴溶解酚红 。
4） 将含 Ca2+,Mg2+溶液缓慢倒入步骤 2配制的溶液中,搅拌,防止沉淀 。
5） 再加入酚红溶液 。
6） 补足水,并用 NaHCO3调节 pH。
含葡萄糖的 BSS过滤除菌,不含葡萄糖时常规高压灭菌 。
小量培养液可置 4度保存 。 一旦出现沉淀,要重新配制 。
注意事项：
细胞只利用 L型氨基酸,不能利用 D型,对于 DL混合型氨基酸,使用量应该加倍 。
谷氨酰胺溶液中很不稳定,要单独配制成浓缩液 。
NaHCO3一般配成 3.7％,5.6%,7.4%三种浓度,过滤除菌或高压灭菌,4度保存,使用前加入,调节培养基 pH。
为了优化细胞生长环境,还添加其他成分,如嘌呤和嘧啶类,维生素 C,谷胱甘肽,巯基乙醇 。
一般情况下,培养基成分如氨基酸,维生素,葡萄糖,缓冲液等,补充因子几类,先配制成高倍浓缩的母液,过滤灭菌,冷藏 。 使用时按一定比例稀释,配制成工作液 。
第二节 动物细胞增殖生长的动力学过程一、单细胞生长增殖周期从一个细胞分裂形成两个新细胞的过程为一个细胞周期或一个细胞世代 。 单个细胞周期包括细胞间期,细胞分裂期,
间期又包括间期 1,DNA合成期和间期 2三个时期 。
不同的细胞类型其分裂周期及各期的时间都不同，培养条件及培养基成分也会影响细胞周期,一般地动物细胞分裂周期为 12－ 48小时,典型的细胞周期为 24小时。
对连续细胞系，失去了细胞周期控制，人工培养条件不适，
细胞将发生程序化死亡即凋亡。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等可引发凋亡发生。
二,细胞群体的生长过程细胞群体生长增殖过程与微生物的生长增殖过程相似
1,潜伏期,细胞经历一段悬浮状态,贴附于器皿表面 。
2,对数生长期：细胞分裂旺盛,指数增加 。 细胞相互接触汇合成片,接触抑制,限制分裂和运动,密度不再增加 。
3,静止期,分裂数与死亡数相等的相对动态平衡时期 。
4.衰亡期：细胞死亡数目大于分裂数目的时期 。
三,群体细胞生长的动力学参数细胞分裂代数 G就可用下列公式计算：
G＝ logN－ logN0） /log2
第四节 动物细胞的分离与培养一、细胞的种类生物体是由多种多样的分化细胞构成,如人体的细胞类型达 200余种 。
这些细胞都是由受精卵分裂产生的细胞后代生长增殖分化而来 。 不同细胞具有不同的功能,细胞分化异常导致癌变 。
分化程度越高,脱分化的能力越差 。
在胚胎发育过程中,高等动物细胞的分化是由全能性变成多能性,再变成单能性,进而失去再分化的能力 。
虽然成熟细胞不能再分化,但其细胞核仍然具有全能性,
因此可以通过核移植,克隆动物 。
体外培养细胞,可分为原代细胞系,传代细胞 。
原代培养：
从体内取出的组织细胞进行体外接种培养,原代培养的细胞为原代细胞,它生长分裂并不旺盛,与体内细胞相似,
适合于药物检测实验 。 生产中有些产品仍沿用原代细胞,
如鸡胚细胞,兔或鼠肾细胞,淋巴细胞 。
传代细胞,
原代细胞转接后培养的细胞 。 传代后,细胞分裂增殖旺盛,
能保持一致的二倍体核型,所以又成为二倍体细胞系 。 传代细胞的增殖能力有限,所以也称为有限细胞系 。 如 WI
－ 38,MRC－ 5,2BS等用于生产 。
根据细胞的传代次数和寿命,可分为有限细胞系和无限细胞系或连续细胞系 。
有限细胞系,正常细胞经过多次传代后,一般可连续培养
30－ 50代,就会逐渐失去增殖能力,也就是说它们只能生长有限的时间,经过若干传代培养后将老化死亡 。
无限细胞系：当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后,才能变为无限细胞系 。 如肿瘤细胞就是自发形成的永久细胞系,没有分裂次数的限制 。 物理,化学或生物因素也能获得 。
细胞寿命无限,生长不受细胞密度的影响,倍增时间短不具接触抑制现象,它对培养条件和生长因子等要求低,，
非常适合于工业化生产,理想的药物生产细胞系 。
根据细胞对生长特性和对基质的依赖性,可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞 。
贴壁依赖性细胞：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面,细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子,
使细胞依附在支持物表面,才能生长和增殖,大多数动物细胞都属于此类 。
非贴壁依赖性细胞：生长不依赖于固体支持物表面,可在培养液中悬浮生长,有时被称为悬浮细胞 。 血液,淋巴细胞,肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类,生长干扰素的
Namalwa细胞 。
有些细胞对支持物的依赖性不严格,可贴壁生长,可悬浮生长 。 中国仓鼠卵巢细胞,小鼠 L929细胞,BHK细胞 。
二,工程细胞的获得与保存目前用于制药的动物细胞有 4类,即原代细胞系,二倍体细胞系,异倍体细胞系和融合的或重组的工程细胞系 。
细胞无限传代,使大规模工业化生产药物成为可能 。
异倍体细胞用于产生重组基因工程产品,使动物细胞成为药物生产的一个新领域 。
1,原代细胞系的分离与培养用原代细胞系生产药物需要大量的动物 。
动物组织或器官洗涤 粉碎酶解消化离心或过滤接种培养培养液稀释细胞洗 涤
37度消化,检查是否充分和完全 。
胰蛋白酶：细胞间质较少的软组织,
胚胎,肝,肾及传代细胞胶原酶：纤维,上皮,癌组织工作浓度,0.1-0.3 mg/ml
链霉蛋白酶,粘蛋白酶,蜗牛酶
2,传代细胞培养长满器皿表面的细胞进行分离,接种到新的培养基上,
进行新一轮培养 。
掌握好最佳时期：刚刚全部汇合的细胞,过早产量低,
过晚健康状态不佳 。
过程与原代细胞相同,用 30－ 50倍体的 0.25％ 胰蛋白酶和 EDTA对细胞块消化,消化后再培养 。
要注意消化程度,细胞对酶的反应不同,有的敏感,掌握好适宜的消化时间和方法,不要过度,获得细胞浓度均匀,生长速度一致的传代细胞 。
曾经广泛应用,但不是理想的生产细胞系
3,细胞系的建立与保存一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系,就建立细胞库,
进行长期保存 。 根据药品生产的有关规定,必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库 。
WCB
1
QC
WCB
2
QC
QC
原始培养物
MCB
QC内容：细胞活性检测、无菌实验、核型、
DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其他外源物试验、稳定性和基因型分析等，
工作细胞库必须与主细胞库完全一致。
低温冷冻保存：
用冷冻保护液 （ 含 10％ 血清的培养液,附加 10％ 甘油或
7.5%-10%二甲基亚砜 ） 细胞预冷,稀释成 106细胞 /ml。
分装,火焰下封口 。 缓慢冷冻,细胞放入 CO2低温冰柜或液氮中,温度为 -150— -190℃,细胞的全部活动几乎处于停止状态 。
复苏细胞：
冷冻细胞取出,立即在 37℃ 水浴中,快速融化 。 在保护剂存在下,慢冻快融是保存复苏细胞的要领 。 融化后的细胞可用于进一步实验 。
三,大规模培养方法根据动物细胞的生长特点,只能采用悬浮培养,贴壁培养,
固定化培养等三种主要方法进行大规模培养 。
1,单层贴壁培养细胞贴附于一定的固体支持表面上,进行的培养方法 。 大多数动物细胞属于贴壁依赖性,贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法 。 接种后,细胞经过吸附,接触而 贴附于基质表面,然后进行 生长,分裂繁殖,很快进入对数期 。
一般数天就长满整个表面,形成致密的单层细胞 。
贴壁培养容器,转瓶,玻璃珠,微载体和中空纤维等 。 滚瓶是为早期培养所采用,结构简单,投资少,重复性好,
但劳动强度大,占用空间大,产量低,不易控制和监测 。
细胞贴壁原理：
细胞主要靠静电引力和范德华力贴附在固体表面,因为动物细胞在生理状态下带负电,贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高表面活性 。
适宜的电荷密度是粘附和贴壁的关键,电荷密度低,不能有效粘附,电荷密度高则会对细胞产生毒性 。
优点：容易更换培养液,灌注培养时,能达到高细胞密度；
有利于产物的分泌表达,可改变培养液与细胞的比例 。
缺点：操作较烦杂,检测受到一定限制,培养条件难以均一,传质和传氧差,放大培养是瓶颈 。
2,微载体培养微载体为三维培养系统,细胞贴附于微载体上伸展和增殖,
再悬浮于培养液中 。
微载体培养兼具贴壁和悬浮培养的双重优点,有很大的比表面积,供单层细胞贴附和增殖 。
悬浮微球使细胞生长的环境均一,培养基利用率高,重复性好,减少了劳动强度,容易放大,于 20世纪 80年代正式用于工业化生产干扰素,疫苗和尿激酶原等 。
多孔微载体或多孔微球,极大地增加了比表面积,如
Cytodex-1的比表面积达 6000 cm2/g,Cytopore的比表面积达 28000 cm2/g。 商品化的微载体基质有玻璃,葡聚糖,
纤维素,塑料和明胶等,表面带电基团为 DEAE等 。
玻璃珠：直径约 2～ 3 μm,密度 1.5 g/cm3,难以在低速下悬浮 。 在玻璃表面覆盖塑料,可得到低密度微载体,如
Bioglas和 Ventreglas,而中空玻璃也可达到此密度 。
葡聚糖微载体：带正电,干粉可在 pH7.2的磷酸盐缓冲液中吸胀,清洗灭菌后使用 。
Cytodex 2,电荷性大大下降,吸附能力很低,适合于蛋白质药物的生产 。
纤维素微载体 DE52和 DE53,适合多种细胞培养 。
塑料载体 Biosilon是聚乙烯载体,无吸附性能,可重复使用,但贴壁较慢,对细胞的摩擦损伤较大 。
聚丙烯酰胺载体贴壁较快,亲水性 。
微载体的选择依赖于搅拌系统和工艺过程，可用于转瓶、
搅拌烧瓶和气升式反应器等。
为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、
多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。
在悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。
多孔微载体：
直径 0.2～ 5 mm，孔径 20～ 300 μm，达占总体积的 85%，
可实现细胞的固定化，达到高密度培养。
广泛使用的多孔微载体有 Cellsnow,Cytocell（纤维素基质）,Verax,Cultisphere（胶原）,Cytoline 1和 2（聚苯乙烯）,ImmobaSil（硅橡胶）及 Siran（玻璃）等。
主要用于搅拌反应器、固定床和流化床反应器。
贴壁培养的固体表面要求：
正电荷和高度表面活性 。 玻璃,聚苯乙烯塑料,不锈钢金属材料和微载体,多孔微载体或多孔微球 。 商品化的微球基质是葡聚糖,聚丙烯酰胺,明胶交联,聚苯乙烯和纤维素等,带电基团为 DEAE等 。 微载体有 CytodexI,II,III
和 DEAE－纤维素等,已是主要的培养方法 。
理想的微载体所具备的性能：
质地柔软,微球间摩擦轻；耐高温,可高压灭菌；透明性,
便于观察细胞生长；细胞相容性,利于贴附和生长；无毒性和惰性,对细胞无毒害,不产生有害物质,不吸附培养基；低速即悬浮,静止即沉降,便于换液和收获；微粒大小均匀；可回收重复使用 。
3,悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程,主要对于非贴壁性依赖性细胞,如杂交瘤细胞等 。
动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的,
经常借鉴发酵理论和经验,但有自身的特点,由于动物细胞没有细胞壁,不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切,对环境适应性差 。 在悬浮培养中要注意发挥 动物细胞的特性 。
常用的反应器有通气式搅拌混和气升式生物反应器 。
方法的优点是操作简单,培养条件相对均一,传质和传氧较好,容易放大培养 。 细胞体积小,密度低,培养病毒易失去标记而降低免疫能力 。
4.固定化培养细胞包埋在微载体内或胶囊内,即细胞固定化后,进行悬浮培养 。 适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养 。
细胞密度高,抗剪切力和污染等优点,是生产首选方法 。
吸附：通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面,微载体和中空纤维培养等 。
共价交联：双功能试剂处理细胞,使细胞之间交联的固定化方法 。
包埋：细胞包埋在载体内部 。 网格型为高分子凝胶细网格,而微囊型为高分子半透膜 。 包埋材料有人工聚合物,
琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等 。
微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内 。
多聚赖氨酸 /海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚赖氨酸覆盖,形成一层多孔可透薄膜,再使凝胶载体液化,
便可制成微囊 。
杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合,经微囊发生器,微球滴入氯化钙溶液中,形成凝胶,然后用聚氨基酸处理,使微球表面成膜,再用柠檬酸去钙离子,球内海藻酸钠成液态,
细胞在在微囊内悬浮 。
微囊化固定培养工艺在单克隆抗体的生产中获得成功,使抗体截留在膜内,血清中的蛋白质被排出在膜外,产物浓度和纯度较高 。 培养结束后,收获微囊,破微囊,纯化抗体,纯化工艺简单,应用前景广 。
三,细胞培养的操作方式动物细胞的培养的操作方式与微生物培养基本相同 。
（ 一 ） 分批式操作已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞,生产单克隆抗体 。 分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为
3～ 5天,细胞密度达 2～ 5× 105 /ml,最大比生长速率大约为 0.05 h-1。 单克隆抗体的产量约 10～ 100 mg/L。 在大规模搅拌反应器中,细胞密度较低,最终达 5× 106,而在
750～ 1500 cm2的转瓶生产中,细胞密度达 1～ 2× 108。
(二 )流加式操作最常见的流加物质是葡萄糖,谷氨酰胺等能源和碳源物质 。 通过流加控制,可实现高密度培养 。
杂交瘤细胞培养,细胞密度可达 1.4× 107,生产抗体的产量比分批操作提高几～ 10倍,可达 500 mg/L。
由于培养体积不断变化,流加对过程的控制能力仍然有限 在实际生产中应用少 。
（ 三 ） 半连续式操作动物细胞培养生产药物中经常采用 。 已应用于大规模生产乙肝表面抗原,tPA等基因工程产物 。
半连续操作特别适用于分泌表达型细胞,如杂交瘤细胞的培养,尤其是微载体系统 。
微载体系统培养基因工程 CHO细胞,待细胞长满载体后,
反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原,制备乙肝疫苗 。
该方式操作简单,使细胞密度和产量维持在较高水平,能在较长时间内进行持续生产,反复收获产物,生产效率高,
是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式 。
（ 四 ） 连续式操作不断收获产物,生产中用于非贴壁依赖性细胞培养 。
在动物细胞培养中,比生长速率比稀释速率大 。 很难建立单一限制性基质的衡化培养,需要多种营养物质流加 。
稀释速率可从 0到最大生长速率之间变化,高稀释速率将带出细胞 。 在稳态,抗体的生产可维持几个星期甚至几个月 。
连续操作的培养条件稳定,抗体处于最佳生产状态,可准确控制最优化参数,产率较高,但必须控制培养基的流加速度和液位高度 。
（ 五 ） 灌流式操作细胞被截留在反应器内的连续操作,是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式 。
截留细胞方式：过滤系统有两种,一种是安装在反应器内部或外环的旋转过滤器,另一种是切线过滤设备 。
灌流体系,100％ 截留细胞,如固定化包埋细胞,可通过中空纤维,平板膜,凝胶颗粒和微囊等实现；部分截留细胞,如使用微载体系统,贴壁系统,分离悬浮系统等实现,
其中分离悬浮系统包括使用膜过滤,旋转过滤,离心,重力沉降等分离技术 。
流化床包埋培养人鼠杂交瘤细胞,整个反应器有效浓度达
4× 108/ml,单位体积产量提高 200～ 300倍 。
优点：
1） 大大提高了细胞生长密度和产物浓度 。
2） 利用培养基,降低细胞代谢废物,细胞生长良好 。
3） 产物为分泌蛋白质,滞留时间短,避免了产物的聚合,降解等产量和活性形式的变化,有利于纯化 。
4） 中空纤维生物反应器,固定床或流化床反应器,膜生物反应器等的唯一可操作方式 。
缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程,由于过滤器容易堵塞,从而限制培养次数 。
四,动物细胞培养反应器
（ 一 ） 转瓶最早的大规模培养的反应器 。 结构简单,操作培养简便,
不进行过程控制 。 现在主要用于生产疫苗如流行性腮腺炎,
风诊麻疹等或用作种子罐 。
（ 二 ） 搅拌罐反应器其结构与微生物发酵罐相似 。 主要区别：较低的高径比,
满足细胞对溶解氧的需求；低搅拌转速,大幅倾斜度桨叶或无桨,避免机械伤害；圆形罐底,防止细胞及载体沿体壁的沉积 。
大规模培养生产药物的主要设备,用于悬浮细胞,微载体,
微囊和巨载体培养等 。
(三 )气升式生物反应器没有搅拌装置,气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管 。
湍流温和而且均匀,循环量大,细胞与培养液混合均匀 。
剪切力小,细胞的伤害小 。 喷射供氧,氧传递速率高,供氧良好 。 适用于悬浮细胞分批培养,微载体和连续培养 。
已有全自动密闭结构的气升式反应器,气体从罐底输入,
沿中央内管上升,一部分气体溢出,另一部分被引导沿罐内壁下降,到达底部与新气体混合再度上升 。 通过计算机控制混合气体的组分,维持培养基内的容氧和 pH值 。
Celltech公司气升式反应器培养杂交瘤细胞,生产单克隆抗体 。 抗体合成大多数处于稳定期和衰退期,不同细胞株系,生产周期为 140－ 400h。 从 10L逐级放大到 10000L,共
17d,生产抗体 100g,比传统摇瓶提高约 5倍 。
(四 )流化床生物反应器细胞固定在多孔微载体中,培养基以适当的流速自下而上经过,使多孔载体处于悬浮的流态的反应器 。 Verax公司 CF－ IMMO多级和 SF－ 2000流化床反应器,用于生产疫苗和基因工程产品 。
上部微载体依靠沉降作用与培养基分离,
一部分培养基被收集,提取产物,同时排出部分废物；其余部分再流加等体积新培养基,提供营养,实现高密度培养 。
这种反应器结构比较简单,传质性能好,
采用膜气体交换器,能快速提供氧气 。
固定床反应器：
填料为无细胞毒性的生物兼容性可附着细胞的惰性材料,可以是不锈钢,玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料 。
与流化床反应器的区别为固定床反应器使用实心载体,流化床反应器使用有孔载体 。
现用多级流化床和多孔微球培养 。
（ 五 ） 中空纤维生物反应器一个特制的圆筒,内部装有数千根中空纤维管束 。
接种孔 水套层 产物出口培养基入口产物出口培养基入口内膜外膜腔室细胞培养基分散后,灌入床层 。 纤维管壁薄,半透膜,截留不同分子量 。
纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长 。
细胞接种于外室,贴附在纤维外壁,吸收从内室渗透出来的营养成分,生长繁殖 。
1－ 3周后可占据所有的纤维空间,并在纤维外壁表面上堆积成多层,细胞密度可达 108/ml。
细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室,产物只能在外室积累和浓缩 。
细胞代谢的废物是小分子物质,可渗透进入内室,从内腔开口排出,避免了对细胞的毒性 。
在收获时,打开纤维管之间的外室开口,产物就流出来 。
此时虽然细胞停止分裂,但细胞的存活,健康和核形态不变,代谢和分化功能仍可保持数月 。
纤维材料,聚砜,丙烯共聚物,聚丙烯,纤维素,醋酸纤维素,聚甲基丙烯酸甲酯等 。 纤维素亲水性强,对渗透性影响较大,不适合于 Vero细胞及其他贴壁细胞培养 。 醋酸纤维和聚甲基丙烯酸甲酯亲水性弱,极性大,适宜于贴壁细胞培养 。
优点,占地小,产量和质量高,成本低 。
不足,不能重复使用,不耐高压灭菌,只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌,不能取样检测 。
中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统,应用广泛,主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 。 已有多家公司生产制造和销售中空纤维生物反应器,其发展的趋势是达到高密度培养的目的 。
第五节 动物细胞的增殖行为与培养过程动力学一、动物细胞的增殖周期单细胞增殖周期：
细胞间期间期 1(G1)、
DNA合成期 (S期 )、
间期 2(G2)
细胞分裂期 （ M期 ） 。
M期为有丝分裂期,超螺旋化的染色单体,经过前期,中期,后期和末期,被纺锤体拉向两极,中间形成细胞板,
一个细胞分裂成两个子细胞 。
M期一般时间很短,为 0.5～ 1小时 。
同一类细胞的周期及其各期持续时间是一定的,但不同类型的细胞分裂周期及各期时间都不同,差异主要取决于
G1期,而 S和 G2期相对稳定 。
对连续细胞系,失去了细胞周期控制,培养条件及培养基成分会影响细胞周期 。 当人工培养条件不适,细胞将发生程序化死亡即凋亡过程,整个细胞分解后被膜包裹形成凋亡小体 。 在培养过程中,缺乏生长因子或血清,营养受限和逆境等均可引发凋亡发生 。
二,悬浮培养细胞生长动力学体外培养的细胞是以群体形式进行增殖和生长的,其动力学过程与单细胞微生物的生长相似 。 动物细胞培养的核心参数是活细胞浓度,可用细胞比生长速率 （ μ）,比死亡速率 (Kd)和活细胞分数 (fv)来描述,计算生长动力学 。
1,悬浮培养细胞生长一般动力学充分混合的悬浮培养游离细胞的反应器,假设流加操作时流出率为 0,分批操作时流加率和流出率均为 0,密度不变,
反应器内则质量守恒：
V,反应器内的培养液体积,
Fi,流加新培养液的体积速度,
Fo：消耗培养液的体积流速 。
oi
FF
dt
dV
假定总细胞处于平衡状态：
总细胞的积累速率 =细胞的流加速率－细胞的流出速率＋
细胞生长速率－细胞裂解速率。在不进料情况下，总细胞平衡：
NVNF
dt
NVd
apo 0
)(
N：细胞总浓度，
uap：表观比生长速率，包括细胞的生长和死亡。
只有活细胞才能分裂,并假定活细胞不发生死亡：
dlvap NkNN
μ为真实比生长速率 ;Nv为活细胞浓度 ;
Nd为死 细胞浓度 ;kl为死细胞比裂解速率。
活细胞占主导，死细胞裂解可忽略，即 k l ＝ 0，那么
v
ap
v
ap
fN
N?
)(
当活细胞转变为死细胞时，没有直接改变细胞的总浓度，
那么活细胞处于平衡：
VNFN
dt
VNd
vaov
v 0)(
μa为活细胞表观比生长率：
da k
对于连续培养，反应体积恒定，所以 Fi=Fo=F。
取样对反应器 V的 影响可忽略。表观比生长速率：
D
dt
Nd
ap
)l n (
D为稀释速率（ Fo/V）
细胞活性降低时,μ远离 μap（ D恒定）。细胞死亡速率,
dt
Nd
Dk vd
)l n (
在高稀释速率下，死亡速率较低。
只有在低稀释速率时，死亡速率才重要。
2,分批培养分批培养时,Fi=Fo=F=0。 用 D=0替换前面方程,可得到分批培养的 μap,μ,kd。
dt
Nd
ap
)ln (
dt
Ndk v
d
)ln (
v
ap
v
ap
fN
N?
)(
在 kl较小时（稳定期）成立，直到静止后期或死亡期。
3,流加培养流加体积对反应器效率影响很大时,Fo=0,但 Fi≠0,所以 V不是常数 。 不用细胞浓度,用细胞数目 （ 分别为 NV
或 NvV） 解方程,得出到流加培养时总细胞,活细胞的表观比生长速率,比死亡速率分别为：
dt
NVd
ap
)ln (
dt
VNd v
a
)ln (
dt
VNd
k vd
ln
5,截留细胞的连续培养流出的总细胞浓度为 No=αsN,αs为流出液细胞浓度与反应器中细胞浓度的比率,截留速率 （ 反应器中截留的细胞分数 ） 为 1-αs。 对于 Fi=Fo=F,V恒定的体系,总细胞浓度为：
NND
dt
dN
aps
D替换为 αsD，可得到 μap,μ,kd
6,细胞裂解期低稀释速率的连续培养 （ 无论细胞是否截留 ） 和分批培养的静止后期和衰亡期,细胞活性较低,细胞裂解相当重要 。
高速搅拌时,细胞裂解也很严重 。
计量细胞生长参数,必须考虑细胞裂解 。 可用细胞释放到培养液中的乳酸脱氢酶 （ LDH） 表征 。
根据培养液中 LDH的浓度可估计死细胞数目 （ 包括完整和自溶细胞 ） 。
三,微载体培养细胞生长动力学在灌流体系中，载体被截留，游离细胞随流出液而流出。
体积恒定的灌流体系中，总细胞平衡为：
NDN
dt
dN
apF
N
N
D
dt
Nd F
ap
)ln (?
表观比生长速率：
dt
Nd
k AAR
)ln (
细胞释放速率：,
四,细胞培养代谢动力学代谢系数：单位活细胞的消耗速率和生产速率，它直接反映了培养过程中的代谢参数随时间和培养条件的变化。
用它进行不同细胞种类或培养条件之间的比较，比单位时间内营养和产物变化要容易和可靠。
1,悬浮培养对于截留细胞,不截留产物蛋白质的反应器,代谢产物平衡浓度 M可表示为：
VNqMFMF
dt
MVd
vMoFi
)(
MF为进料液中的浓度。
M为反应器中的浓度代谢系数 qM为 M比生成速率（单位细胞、单位时间生成的摩尔数）
对于恒定体积反应器，代谢系数为：
v
F
M N
dtdMMMD
q
/
乳酸 /葡萄糖,O2/ATP,氧 /葡萄糖、氧 /谷氨酸、
氨 /谷氨酸、目标产物 /氧等表观得率，把代谢、
底物消耗和产物生成连系起来，估计有氧代谢与糖酵解的关联程度。
2,固定化细胞培养很难确定固定化细胞反应器中的细胞浓度。但可从流入和流出液中测定氧和代谢产物浓度，用代谢产物对时间作图，
通过代谢系数估计细胞密度。代谢产物 M的体积得率为：
)( OFM MMDQ
五,细胞培养产物生成动力学产物截留的培养体系产物截留与细胞截留一样,有利于收获高浓度的产物 。
在截留产物的培养体系中,都不能 100%截留 。 在恒定体积的反应器中,通过滤膜截留产物时,产物质量平衡为：
V
FP
P N
dtdPPPD
q
)/()(
第六节 动物细胞培养过程的检测与工艺控制检测系统和控制系统是现代的生物反应器所不可缺失的,
检测的全面性和精确性代表了反应器本身的水平和性能 。
通过一系列参数的检测,可以准确掌握反应器的运行状态,
如细胞是否处于最佳生长状态,有无污染,产物的积累情况等,采取相应的措施,调控反应过程,实现高效生产 。
动物细胞培养中,检测参数包括细胞生长环境参数 （ 温度,
pH,溶氧,转速,液流量 ） ；培养基成分变化参数 （ 葡萄糖消耗率,乳酸生成率,铵离子浓度 ） ；细胞生长状态参数 （ 形态变化,活性高低,密度大小 ） ；目标产物生产率
（ 产物的合成与积累速度,分泌 ） ；微生物污染参数 。 全面检测这些参数才能做到精确控制整个工艺过程 。
一,细胞生长状态的检测
1,细胞计数与活性分析离线分析：用血球计数板计数,或进行分光光度计比色分析,确定反应器中的细胞数目 。
在线分析：近红外线传感器,可把细胞计数和活性的控制结合在一起 。 其它方法有测定电导与电容的传感器和软件传感器,甚至是实时成像分析检测 。
检查细胞的活性：组织化学染色法和细胞形态的观察检测细胞活性 。
2,细胞凋亡检测细胞死亡有两种形式,即凋亡和坏死,其形态学和生化变化完全不同 。
坏死：细胞受到严重伤害时快速膨胀,染色质凝聚,而死亡,细胞直接裂解,坏死过程不受细胞自主控制 。
凋亡：细胞对环境变化作出的有计划的,执行预定程序的应答过程 。 其特征是细胞收缩,细胞核和 DNA断裂,同时被膜包裹形成带凋亡小体 。 在体内,凋亡小体被邻近细胞或巨噬细胞所吞噬 。
检测：
光学显微镜检查；
荧光显微镜下观察：荧光染料 （ Hoechst,Hoechst/PI,丫啶橙 /溴化乙锭 ） 对细胞染色细胞流式分析：检测培养过程中的细胞凋亡 。
琼脂糖凝胶电泳：
凋亡的主要生化特征是激活一种 Ca2+/Mg2+依赖型的核酸内切酶,将核 DNA切割成 200 bp或更大的片断 。 而坏死细胞不会出现 DNA断裂片段 。
在动物细胞培养中，细胞凋亡是很普遍的现象，在各种环境下都能发生。
培养基除去生长促进因子时，生长因子依赖性细胞系就发生凋亡。改变培养基条件，缺乏锌元素，细胞密度过高，
都会引起细胞凋亡。
细胞毒素也可能引发细胞凋亡。
凋亡细胞能排斥活体染料，台盼篮染色排除法往往低估了细胞的健康状态。
二,微生物污染检测与防止细菌污染,汤培养基于 37℃ 恒温培养,检查 。
类胸膜肺炎生物体污染：细胞仍能生长,甚至无明显变化,
常常不易发觉 。
支原体污染,染色,培养,DNA杂交和共培养,至少同时使用两种方法 。 Hoechst33258荧光染色,荧光显微镜观察 。
使用抗生素,卡那霉素,金霉素处理培养物 。
用特异性的支原体血清处理,可永久清除污染 。
高温处理,支原体和细胞的耐热性不同,支原体敏感 。
使用支原体去除剂,日本制药株式会社 MC-2120 。
三,培养基 成分检测与代谢控制
1,基质消耗的检测营养的消耗可以用葡萄糖的减少为指示,而产物的积累可以用乳酸和铵的增加作为指示,动态检测这两种物质的变化,判别细胞的状态是否正常 。
近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定 。
固定化和中空纤维反应器,用 NMR分析培养空间的成分,
鉴定和定量分析代谢产物 。 也可区分增殖和非增殖细胞 。
分批培养中,葡萄糖的起始浓度一般为 5～ 25 mM,谷氨酰氨的起始浓度为 2～ 6 mM。 控制氨离子浓度低于 2～ 4 mM。
乳酸低于约 60 mmol/L。
2.代谢控制过量葡萄糖，增加乳酸。过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门冬氨酸的积累。
葡萄糖限量：能减少乳酸量，增加葡萄糖的产量系数。
谷氨酰胺限量：减少铵盐和氨基酸的生成。
进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢变得更有效。
在生产工艺中，优化二者之间的关系，使之协调起来。
把细胞活力,ATP,DNA和蛋白质的含量，与生物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合，评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。
目前代谢控制主要是采用多种复杂参数，包括生长速率、
吸收速率、产率和细胞内的代谢产物，是根据基础参数和生物化学参数计算而来。可用于培养过程的快速控制。
仅根据细胞密度值和流加速率计算生长速率，意义并非很大。因为两次测定时间间隔较长，数据本身就后滞，可靠性较差。
对于生长速率恒定的连续培养，细胞内 ATP含量与生长速率相关，自动取样后，用相关试剂盒对 ATP的总量进行在线分析，由在线传感器和计算模型得到实际的细胞数目。
这样，通过营养控制或温度调节可维持连续培养的恒定生长速率。
氨基酸的比吸收速率和比生成速率,细胞内酶 (如乳酸脱氢酶,谷氨酸草酰乙酸转氨酶 )的比释放速率,都可作为培养过程的瞬间参数和控制节点的阀值 。
如果能自动检测产物并计算产率，可通过计算机程序可使过程自动优化。
多元参数分析的计算程序，能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生产条件。
用 HPLC在 20分钟内得到准确的结果，而 HPCE只需 5分钟。
这些新方法要用于培养过程分析，还需进一步发展和完善。
四,搅拌剪切的检测与控制
1,搅拌剪切的检测搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高氧及其他营养物质的传递速率，但搅拌产生剪切力会对细胞造成损伤。
过度搅拌引起的细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表征，它决定了细胞的裂解程度。细胞内 LDH维持一个常数。
通过监测 LDH的释放可评价不同搅拌对细胞损伤程度。
搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构相关联的，如搅拌速度、叶轮顶部速度、综合剪切因素及
Kolmogorov漩涡尺寸等，这些参数还不能用于生物反应器的放大。
不同类型细胞对流体力的应答不同，应注意细胞系的特性。
不同生物反应器产生不同的细胞应力，细胞能承受的机械应力取决于搅拌桨的形状及其直径和转速、罐体及其直径以及液相比例。
根据搅拌转速对细胞细胞损伤的影响，可确定培养基保护添加剂和搅拌桨的伤害作用等。
在搅拌生物反应器中，悬浮细胞受到的损伤来自于空气夹带和气泡破裂。如果不存在旋涡和气体夹带，计算
Kolmogorov漩涡尺寸，可预测搅拌速度对细胞的损伤。
在鼓泡生物反应器中，细胞损伤主要是气液界面处气泡的破裂，其他作用（如气泡的合并和破裂或湍流应力）则不会造成明显的损伤，在实际应用中可以忽略。如果
Kolmogorov漩涡尺寸近似于细胞大小，就不能忽略了。
2,搅拌剪切的控制反应器设计：
在表面通气生物反应器中,要避免形成漩涡 。 高搅拌速度下,安装挡板可减少漩涡并能增加通气和混合 。 填充反应器,没有顶部气体空间,就可完全消除气液界面的气体夹带和气泡破裂 。
鼓泡式生物反应器,气体应该从生物反应器中移走 。 如果生物反应器顶部气体空间不能完全消除,可使用高径比较大 （ 至少 2～ 3） 的反应器进行悬浮培养 。
在搅拌和鼓泡或气升生物反应器中，使用剪切保护剂，可在高速搅拌或剧烈混合时保护细胞。
对于多孔微载体培养，保证微珠充分悬浮和无机械损伤。
多孔微珠内的细胞受到保护，不受机械力损伤，而且如果搅拌强度较高，则细胞不能在微珠外表面生长。
在多孔微载体培养中，要尽可能使用最大的搅拌转速，进行混合，以提高微孔内外营养和代谢产物的传递。
使用多孔微载体之前，最好用各种搅拌 /混合强度检测，
并在显微镜下检查微载体的机械损伤程度。
对于无孔微载体,与贴壁非依赖性细胞的悬浮培养相比,
搅拌强度能对微载体上的细胞产生损伤,但没有漩涡和气泡夹带及气泡破 。
无孔微载体培养的其最大搅拌强度要远低于悬浮培养 。 开始培养时,搅拌速率应该能保证微载体悬浮 。
如果剪切作用太大,对细胞造成伤害时,细胞会从微载体表面脱离,脱落速度随着搅拌强度的增加而增加 。
在微载体培养中,使用葡聚糖为培养基添加剂时,能增大培养基粘度,从而保护微载体培养中细胞不受机械损伤,
这是一个纯粹的物理保护机制 。 当培养基粘度增大时,旋涡尺寸也随着增大,为此有可能提高搅拌速率,而细胞不受损伤 。
在动物细胞培养中,搅拌速率 （ 20～ 200 r/min） 要比细菌发酵 (1000～ 3000 r/min)低得多,所以需要更慢的驱动器,即使是小范围的控制 。
较大范围的电子负调节引起能量的大量损失,导致搅拌速率不稳定 。
虽然标准的速度控制器能完全控制搅拌,但流速计的控制也许最有用 。
3,使用剪切保护剂使用一些添加剂可保护细胞不受流体机械的损伤 。
血清和聚醚类非离子表面活性剂,其它剪切保护剂包括纤维素衍生物和淀粉,细胞提取物和蛋白质等 。
要么通过营养或生物学机理降低了细胞的脆性,要么通过理化机制增加了细胞与气体或液体界面的相互作用,从而改变剪切的强度或频率 。
生物保护机制：保护剂改变了细胞本身,使其抗剪切力物理保护机制：细胞抗剪切力的能力并没有改变,但影响了传递剪切力的强度和频率,减轻了细胞损伤 。
生物学效应有两种,一种为快反应生物机制,细胞改变很快而且不需要经过代谢过程；另一种为慢反应代谢机制,
细胞改变由代谢变化引起,往往需要较长的时间 。
悬浮培养游离细胞时,保护剂聚乙二醇和非离子表面活性剂 F-68和 F-88 的效果较好,减轻流体的剪切力,研究最广泛,已使用 30多年,在绝大多数情况下首先选择 。 PVA
研究并不广泛,但效果也很好 。
混合分子量的 PVP能保护鼓泡式反应器内杂交瘤的剪切损伤 。 在通气或搅拌反应器中,聚乙烯乙二醇和 PVA表现出与 F-68一样好的保护作用,而对细胞没有任何毒害作用 。
0.1％ 的 F-68和 F-88以及各种 PEG和 PVA就足够提供机械保护作用 。
血清是一种效果很好剪切损伤保护剂 。
在搅拌或通气培养中,它促进细胞生长具有剂量依赖性,
最高体积浓度可达 10％ 。
只要不抑制细胞生长,任何类型的血清都可以使用,一般
2％ ～ 5%的血清就能提供足够的保护作用 。
添加血清使药物蛋白的纯化变得复杂,还可能刺激生物应答反应或带来意想不到的变化及病毒污染,因此,应避免使用血清 。
实验表明,合成的添加剂 PEG,PVA具有和血清一样好的机械保护作用 。
纤维素衍生物应用于悬浮培养动物细胞作为剪切保护剂,
包括人,鼠和猴细胞 。
保护作用取决于细胞类型,甲基纤维素的种类和组成 。
较高浓度,较大分子量的甲基纤维素能保护昆虫细胞 。
搅拌或通气生物反应器,甲基纤维素对 CHO有保护作用 。
甲基纤维素和羧甲基纤维素能引起细胞集聚 。
尽管研究了 40多年,对于甲基纤维素的保护作用机制和通用性仍然了解很少 。
纤维素衍生物作为剪切保护剂的前景是光明的,但广泛应用还需要做很多工作 。
蛋白质和细胞提取物，包括蛋白胨、乳白蛋白水解产物、
胰蛋白磷酸盐、酵母提取物、酵母水解产物等，有各种不同的试验结果，而且研究不够充分。
牛血清白蛋白作为添加剂广泛应用于无血清培养基，许多研究者把它作为剪切保护剂。
在众多的蛋白添加剂中，牛血清白蛋白是唯一的值得推荐使用的剪切保护剂。
一些蛋白混合物（除血清外）和纯蛋白已用作剪切保护剂，但缺乏合适的控制实验，保护效应很不清晰。
五,溶解氧的检测与控制
1,通气供氧影响氧传递的因素是通入气体中的氧浓度,搅拌速率和气液接触面,直接鼓泡空气或氧,可增加气一液接触面积 。
把渗氧硅管或聚丙烯管浸没在培养基中,进行无泡通气 。
通过增加纯氧,氧浓度随氧压增加而升高 。
如果更希望得到较低的氧浓度,在空气中混合氮气,可降低氧传递动力 。
对于鼓泡式生物反应器,具有很高的氧传递速率,但对动物细胞容易受到伤害,而且容易产生泡沫 。 在搅拌罐反应器和鼓泡反应器中,常使用剪切保护剂以保护细胞 。 为防止泡沫形成,可用浓度为 6~100 ppm的硅消泡剂,
微载体鼓泡培养要采用保守方法,如低气流速率,小气泡直径,以利于氧传递,低搅拌强度并使用消泡剂 。 另外,
还可加入剪切保护剂 （ 如 F-68或聚乙二醇 ） 以减少微载体接触,浮动和聚集 。
膜通气是无气泡供氧,优点是氧传递更为有效,剪切力小,
泡沫形成量小 。
对于大规模的反应器系统,膜通气有其局限性,主要是由于设计的复杂性和需要面积较大的膜 。 运行过程中其缺点是难于对膜反应器进行清洗和灭菌 。
在大规模生产中,反应器设计都有溶氧检测装置 。 根据不同细胞类型的最适溶氧水平不同进行控制 。 通过向培养液中加入不同比例的氧气,空气或氮气或二氧化碳来控制溶氧量,溶氧量的控制常常与 pH值控制结合在一起,根据需要进行调节 。
溶解氧检测电极为偏振电极,虽然是稳定,准确的传感器,
但仍然存在一些不足 。 电极工作时间不超过 6～ 8周,而且取决于氧压力 。 培养开始后再校正电极十分困难,98%响应时间在 1分钟之内 。 为克服这些缺点,在培养开始时,
安装二个电极,当一个使用几周周后,再接通第二个电极 。
也可更换电极插孔 。
在高密度培养时,必须对供氧系统进行很好地平衡设计 。
六,温度和 pH的检测与控制
1.温度动物细胞对温度变化很敏感,对温度控制要求十分严格 。
采用高灵敏的温度计 （ 灵敏度为 ± 0.25℃ ） 来在线检测,
通过温控仪自动开关,将温度控制在误差为 0.5度范围内 。
根据温度探针 （ 铂 100）,进行反馈控制 。
预加热培养基,或加热反应器的水套层,使温度恒定 。
对于循环流动水套层,水温度略高于反应器温度 1～ 3℃ 。
对小体积反应器 （ 如 10L）,外用电子加热片,反应器内部设有冷却水管,可维持细胞的最适温度 。
2,pH值检测与控制动物细胞培养基呈偏碱性,加入微量 酚红,根据颜色的变化,显示 pH变化 。 开始时,培养液 pH为 7.4。 在培养过程中,随着细胞浓度增加,产生较多的 CO2和乳酸,pH会下降,但不能低于 pH7.0。 精确控制 pH非常重要,一般为
6.7-7.9,其波动范围为 0.05-0.9。
大规模培养中,有 pH计能随时检测 。 直接加 HCl或加 NaOH
不适合动物细胞培养 。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高 HEPES
对细胞有 。 常用碳酸氢盐缓冲剂,加入 CO2可降低 pH值,
加入碳酸氢盐可提高 pH值 。 碳酸氢盐缓冲液的缓冲能力弱,
安全的作法是通过控制溶氧量间接控制 pH值 。 增加溶氧量会使培养基中 CO2被置换出来,导致 pH值升高 。 因此应该合理配置,从而达到控制目的 。
七,流加与液位的检测与控制
1,流量检测与控制高密度细胞连续培养过程中,必须对培养基流量及液位进行精确控制 。 较大范围的流加速率变化,可降低细胞活性 。 液位变化可影响液体的流动方式及氧传递速率 。
通过蠕动泵或其它无计量泵不能对流加液体进行有效控制，可用一组节点控制环和电子流量计来补偿。用磁感应或热电原理检测流量，还没有流量范围为 1～ 5 L/h的装置。
对于微量流加操作，可使用自动阀，把基质容器接在电子天平上，然后与计算机偶联，来控制阀门。这非常准确，几乎类似于连续流加培养基。
2,液位检测与控制液位测定方法有多种,传统方法是使用液位传感器,它是根据电导率和电容性设计的,由反应器制造公司提供,但都受泡沫的影响 。 可使用压电传感器,分别安装在反应器顶部和底部,检测流体静力学压力,其压差对应于液位高度 。 还可用超声波装置检测液位,但取决于在反应器底部的声纳探头 。
在细胞培养过程中,由于细胞代谢的结果,细胞悬浮的摩尔渗透压浓度在增加 。 尽管可用膜渗透压计,但还没有在线检测系统 。
目前,用冰点渗透压计进行离线测量,为了稳定渗透压,
须安装蒸馏水进口系统,根据样品读数,对系统进行调节 。
八,目标产物的检测与控制生产过程中也要对细胞分泌的目标产物进行跟踪检测,这可根据目标产物的性质,采取各种免疫方法进行测定,判断细胞是否在有效地合成并积累目标蛋白质 。
动物细胞培养的产物并非 100％ 具有生物活性,它赖以糖基化完整性和蛋白酶的降解程度 。
活性影响因素：培养方式,生长时期,葡萄糖和氨离子浓度,培养液的成分和 pH,氧浓度等 。 选择适宜的生理状态与培养条件,获得修饰正确的蛋白质产物 。
影响产物的因素：非培养液成分,添加丁酸,增加渗透压,
提高比生长速率 。
思考题
（ 1）名词解释：无限细胞系，固定化培养，生长基质。
（ 2） 分析比较大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞表达系统制药的优缺点。
（ 3） 分析动物细胞培养工艺过程检测和控制的特点，如何优化过程控制？
要有糖基化,才能使药物发挥真正的功能 。 细菌和酵母等产品要么是包涵体,要么难以糖基化功能修饰 。 动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质,大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要 。
人畜病毒疫苗,口蹄疫苗,狂犬病疫苗,牛白血病和脊髓灰质炎,乙肝疫苗 。
干扰素,单克隆抗体,重组基因工程产品 。
组织型血纤蛋白溶酶原激活剂,免疫珠蛋白 G,M,尿激酶,人生长因子等 。
第一节 动物细胞制药的表达系统与特征昆虫系统,哺乳动物细胞系统,最成功,重要表达活性外源蛋白的有效系统,应用于药物蛋白质的表达 。
一,哺乳动物细胞表达系统与特征
1,动物细胞的特征细胞膜,细胞质和细胞核没有细胞壁 。
亚细胞器,功能独特 。
2,动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域 。 通过胞内运输 （ 囊泡包裹 ） 实现区域之间的物质,信息和能量流动,通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换 。
在动物细胞培养中,葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体,因此动物细胞的培养具有一定的灵活性 。
葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿,反之亦然 。
谷氨酰胺是动物细胞的氮源,谷氨酰胺受限时,可增加其他氨基酸的消耗得以补偿 。
糖代谢特点：
动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。
丙酮酸还可转化为乙酰辅酶 A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生 CO2和水。小部分（ 4％～ 8％）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为 4,5,7碳糖和还原力
NADPH,5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。
葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。
氨基酸代谢特点：
吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。
大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，
对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、
嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。
谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物 α -酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。
不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。
在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。
在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以 ATP和
NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。
常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。
3,蛋白质糖基化蛋白质合成是以 mRNA为模板,在核糖体上完成 。 而蛋白质的糖基化无需模板指导,因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化 。
糖蛋白的单糖单元,α-D-葡萄糖,α-D-半乳糖,α-D-甘露糖,α-D-木糖,α-D-岩藻糖,N-乙酰 -α-D-葡萄糖胺,N-
乙酰 -α-D-半乳糖胺和 α-N-乙酰神经氨酸 （ 或唾液酸 ） 。
糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为 N-
糖基化,或与氧原子结合为 O-糖基化 。 这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同 。
N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上,其模体的保守序列为 Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨基酸 )。 如果 X为 Trp,Asp,Glu和 Leu,对糖基化有负影响,而第三位 Thr能增强糖基化 。
N-糖基化分为高甘露糖型,复合型和杂合型三种类型,共同核心是 3个甘露糖和 2个 N-乙酰葡萄糖胺组成的 5糖
（ Man3GluNAc2）,其他糖形成支链 。
高甘露糖型的支链为甘露聚糖 （ 5～ 9聚体 ）,无其他糖 。
复合型含有 2个以上支链,如乙酰半乳糖胺,果糖和唾液酸等 。
杂合型至少含有一条复合糖链,另一个链含有甘露糖 。
O-聚糖连接在 Thr/Ser的羟基上,还没有发现保守序列 。
O-聚糖有四种不同的核心结构,都含有 N-乙酰半乳糖胺基,糖基化会影响蛋白质的局部构象 。
O-糖基化比较小,一般为 1～ 6个寡聚糖,但比 N-糖基化变化更大 。
O-糖基化只在高尔基体上进行,糖基单元有木糖,葡萄糖 。
糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用,都具有相同的核心结构：胆胺 -PO4-Man2-
GlcHN2-肌醇 -PO4-脂 。
胆胺形成膜内蛋白的桥,而肌醇在膜内 。
在细胞培养生产重组蛋白时,磷脂酶 C可切割此类蛋白,
有利于纯化 。
细胞特异性糖基化途径 —— 淋巴细胞中进行,它不依赖于内质网和高尔基体 。
IgG的糖基化,等分 GlcNAc残基连接在核心甘露糖上,该糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用 。
IgG蛋白的铰链区,富含 Ser,Thr和 Pro,5个 Ser全部糖基化 。
促黄体激素,促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生 。
尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。
鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。
CHO细胞不能合成等分 N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。
要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。
细胞系 Fuc Gal 唾液酸
α1,6 α1,3
Fuc
α1,3
Gal
SO4-
GalNAc α2,3
α2,
6
糖基化 等分GluNAc
BHK ++ 0 + 0 ++ 0 - 0
CHO ++ - 0 0 ++ 0 + 0
鼠杂交瘤 ++ 0 ++ 0 ++ 0 +++ 0
C127 ++ 0 ++ ++ ++ +
+
+++ 0
J558L ++ 0 ++ - ++ +
+
+++ 0
人淋巴细胞 ++ 0 0 0 + + 0 ++
人垂体 ++ 0 0 +++ + + 0 ++
Namalwa ++ 0 0 0 ++ +
+
- -
人鼠杂交瘤 ++ 0 0 0 + + + 0
2,哺乳动物细胞表达系统基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞系,即永久性细胞 。 表达的蛋白质能正确加工,修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子,接近或类似天然产物 。
糖基化等修饰是糖蛋白行使功能所必需的,而且对产品质量有影响,如生物活性,稳定性,免疫原性等 。 原核细胞表达的 EPO无糖基化,在体内表现无活性 。 原核表达的
GM－ CSF虽有活性,但在体内产生抗体 。
动物细胞表达产物分泌到培养液,容易分离纯化 。 约有 70
％ 批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造,而且数目还在不断增加 。
表达系统 O-糖基化 寡聚甘露糖 高甘露糖 复合体大肠杆菌 0 0 0 0
酿酒酵母 ＋＋ 0 ＋＋＋
＋
－
昆虫 Sf9 ＋＋ ＋＋＋＋ 0 －
仓鼠 CHO ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
仓鼠 BHK ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
鼠杂交瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
鼠骨髓瘤 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
C127 ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
J558L ＋＋ － 0 ＋＋
人淋巴细胞 ＋＋ 0 0 ＋
Namalwa ＋＋ ＋＋ 0 ＋＋
人鼠杂交瘤 － ＋＋ 0 ＋＋
大肠杆菌 酵母 哺乳动物细胞产物浓度 高 高 低分子量 低 高 高二硫键 有限 不受限制 不受限制分泌 无 有或无 有形式 包涵体 单链,天然 单链,天然折叠 不正确 正确 正确糖基化 无 可能 完全逆转录病毒 无 无 可能热原 可能 无 无培养特点 容易 容易 较难,成本高分离纯化 复杂 复杂 简单细胞类型 表 达 水 平
（ μg/ml）
猴 CV1 1～ 10
猴 CV1 0.05
猴 COS 1
小鼠成纤维细胞 C127 1～ 5
小鼠成纤维细胞 3T3 0.1～ 0.5
CHO（ dhfr－ ） 0.01~0.05
CHO（ dhfr－ ） 10
动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢,生产效率较低,
产量远远落后于其他表达系统 。
骨髓细胞 MPG－ 11生产 IgG的能力为 5pg/(细胞,分钟 )，
10L反应器,密度为 107/ml,生产能力不到 1g/d。
连续细胞系增加了生长和代谢速率,但同时导致了副产物的增加 。
动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感,对温度,pH,渗透压,剪切力等忍受能力差 。 培养基要求高,需要添加氨基酸,维生素等,往往需要附加血清,提供生长因子,费用较高 。 同时可能有潜在的致病因子,免疫原性存在 。
表达载体的改进和宿主细胞的改造是动物细胞表达系统的研发重要内容 。
3,昆虫细胞表达系统与特征表达载体为昆虫病毒,转染昆虫细胞,表达出目标蛋白质 。
昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒 。
苜蓿尺蠖核多角体病毒－秋黏虫细胞表达系统,家蚕核多角体病毒－家蚕幼虫表达系统 。
Micro－ Gene Sys公司表达艾滋病基因工程疫苗,随后猪生长素,CD4膜蛋白及疟疾疫苗,鸡新城病毒疫苗,血吸虫 GST疫苗,乙肝表面抗原,重组人 GM－ CSF等 。 日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市 。 生物试剂盒的标准品大多用昆虫表达系统生产 。
至少有 600多种昆虫可以作为宿主,每年有数百个基因利用昆虫系统进行表达,越来越成为非常有用的表达宿主 。
优点
1） 安全：杆状病毒无致病性,产品安全性受 FDA认可 。
2） 易饲养：家蚕丧失了野外生存能力,饲养,发育快,
3） 高量表达：用强启动子,外源基因可超量表达 。 表达产物在昆虫细胞内能结晶,对产物纯化非常有意义 。
4） 高效表达：可容纳较大的外源基因 （ 12kb）,表达数个外源基因,并且正确装配成有功能的分子 。 如表达抗体的重链和轻链,自主装配成有功能的抗体 。
5） 翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工,
包括糖基化,脂肪酸酰基化,磷酸化,氨基酸的乙酰化,
氨酰化等,大部分产物显示出良好的活性 。
缺点：
1） 重组率低,筛选困难,周期长,需要 4－ 10天 。
2） 外源基因的表达在转染的晚期,大约在 20h后起始基因表达,在 72－ 94h细胞裂解死亡,基因表达时间约 30－
50h,高水平表达不连续且时间短,这对表达不利 。
3） 昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同,它不提供复杂的 N糖基化,如添加半乳糖和唾液酸残基,有可能造成溶解性,稳定性,免疫性等变化 。 表达水平非常高,加工装备跟不上,蛋白质修饰效率可能不高 。
研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体；
决定基因表达时期启动子,无血清培养昆虫细胞系 。
第二节 基因工程动物细胞系的构建构建高效表达载体转染动物细胞筛选鉴定获得生产用工程化细胞系动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。
病毒载体：
逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。
同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。
痘病毒载体可插入 25～ 40 kb外源基因，甚至是多个基因。
无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。
美国 Genentech公司已用 SV40载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。
质粒载体：
微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。
大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。
抗生素抗性标记，原核细胞筛选。
动物细胞的复制子，
在宿主细胞中稳定表达。
还有丝状噬菌体复制子。
启动子序列：含有 RNA聚合酶识别和结合位点,以便有效转录 。 TATA盒,确定起始位置； GG盒,影响转录频率 。
来源于病毒,动物基因和噬菌体的启动子 。
动 物 病 毒 启 动 子,逆 转 录 病 毒 的 长 末 端 重 复 序 列
（ LTRS）,SV40病毒的早期和晚期启动子,腺病毒的晚期启动子,人巨噬病毒 （ CMV） 立即早期基因启动子 。
动物基因的启动子：转录因子 EF-1α启动子,泛素蛋白启动子,β-肌动蛋白启动子,干扰素 -α启动子,IgG启动子,
鼠金属硫蛋白基因启动子等 。
噬菌体 T7启动子比动物基因启动子表达水平高 。
PolyA信号序列：保持 mRNA的稳定性,防止降解,保证了转录产物的加工和正确性,但序列不宜太长,避免能量过度消耗 。 添加 PolyA信号和 5′端转录暂停位点,可以减少上游序列转录通读造成的背景 。
牛生长素 （ BGH） 基因的 PolyA信号比 SV40 PolyA更强,
常用于高效表达载体中 。
终止序列,AAUAAA或连续的终止密码 UGA,UAA和
UAG,能防止转录通读,使转录在正确的位点结束 。
在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子,有利于提高外源基因的转录水平 。
双顺反子表达载体：
两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一 mRNA中的第二个基因得到翻译。将 dhfr与目标基因串连,dhfr的 cDNA插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。
顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。
使筛选容易，而且能高效表达。
选择适宜的启动子,可实现定向表达 。
CMV启动子和人 EF-1α启动子,可实现同一载体上的二个基因的独立表达 。
组织特异性启动子：如鼠,山羊酪蛋白启动子,可使基因主要在乳腺中表达 。
N端设计分泌信号肽：如 Ig κ链的可变区和恒定区之间序列,使外源基因的表达产物向胞外分泌 。
C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面 。
亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核,线粒体,内质网或细胞质中,这对基因的功能研究非常合适 。
基因的扩增系统：
在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。
最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（ DHFR）基因系统和谷氨酰氨合成酶（ GS）基因系统。
氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使 dhfr基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。
硫胺蛋氨酸使 GS系统的基因得到大量扩增。
二,受体细胞
1,人源细胞株系
Namalwa：类淋巴母细胞,非整体核型 。 表达 IgM,悬浮生长 。 外源基因的表达水平较高,可用无血清培养基高密度培养,已成功地表达了 rhEPO,rhG-CSF,tPA等 。 英国 Wellcome公司用 Namalwa细胞的反应器达 8000L,用
Sendai病毒诱导,大规模生产 α干扰素,并批准上市 。
WI-38：二倍体成纤维细胞系,2n=46,第一个被用于制备疫苗 。 贴壁生长,对很多病毒敏感,广泛用于疫苗生产 。
MRC-5：二倍体成纤维细胞系,但生长较 WI-38快,对逆境有一定抗性也用于制备疫苗 。
2,哺乳动物细胞株系
CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系,贴壁型生长,是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞 。 核型为亚二倍体,分泌表达外源蛋白,而内源蛋白分泌很少 。 贴壁型生长细胞,但可进行悬浮培养,
对剪切力和渗透压有较高的忍受能力 。 蛋白质翻译后的修饰准确,表达产物的结构,性质和生物活性接近天然 。
有多种衍生突变株应用于药物的生产,培养时需要添加脯氨酸 。 二氢叶酸还原酶缺陷株表达的药物有 tPA,EPO、
HBsAg疫苗,G-CSF,凝血因子 Ⅷ,DNA酶 Ⅰ,已上市 。
使用氨甲酰喋呤,增加外源基因的拷贝数,提高蛋白质表达水平 。
BHK－ 21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞,非整倍体 。 用于增殖病毒,制备疫苗和重组蛋白 。 BHK-21表达的重组凝血因子 Ⅷ 已被获准上市 。
C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞,贴壁型生长 。 C127细胞系已表达多种外源基因,其中 EPO的水平达 10 mg/L,生产 rhGH已被批准上市 。
3T3,HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。
骨髓瘤细胞,J558L是小鼠 BALB/c骨髓瘤细胞,分泌 IgA，
用于转染研究 。 NSO和 SP2/O－ Ag14不分泌 Ig,与淋巴细胞融合筛选杂交瘤,分泌制备特异性抗体 。
杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系,能在无血清培养基中高密度悬浮生长,容易转染和生长,能进行糖基化等加工修饰,大量分泌和高效表达 。 很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备 。
Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，
多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用 Vero E6增殖多种病毒，
如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，
已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。
COS：是从 SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞 CV1中分离得到的,广泛用于外源基因瞬时表达的研究 。
GH3用于生长激素研究,293细胞系用于基因治疗的研究。
3,昆虫细胞株系
Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到,细胞较大,容易放大,高效表达外源基因 。
Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞 （ SF21） 中分离得到,是最常用的昆虫表达细胞 。 对杆状病毒高度敏感,生长快,能高效表达外源基因 。 抗机械剪切,能在无血清培养基的搅拌反应器中生长 。
TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到,无血清培养,快速倍增 。 分泌表达重组蛋白的能力比 Sf9细胞系高 20多倍,能适应悬浮培养 。
三,细胞转染转染 （ 是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称 。
基因导入真核细胞的方法很多,主要有化学转染,物理转染和病毒介导的转化 。
方法 表 达 类型毒性 细胞类型 特点基因枪 瞬时,
稳定无 多种细胞组织,器官有效,仪器操作显微注射 瞬时,
稳定无 多种细胞 有效,技术难度大电穿孔 瞬时,
稳定无 多种细胞 有效,仪器操作冲击波 瞬时,
稳定无 多种细胞,
局部组织简单有效,
仪器操作方法 表达类型毒性 细胞类型 特点逆 转 录 病毒瞬时,
稳定无 对应的宿主细胞有效原 生 质 体融合瞬时,
稳定无 悬浮细胞 技术复杂生物转染特点化学转染是最常用的转染方法。
其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（ DEAE）－葡聚糖
（ dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。
磷酸钙与 DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的 DEAE－葡聚糖与带负电荷的 DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹
DNA形成脂质体。
渗透性休克和 DMSO等化学试剂能促进 DNA进入细胞。
转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。
影响因素：细胞培养物的密度,DNA的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。
方法 表达类型毒性 细胞类型 特点磷酸钙 瞬时,
稳定无 贴壁细胞,
悬浮细胞简单
DEAE-葡聚糖瞬时 有 CV1,COS 简单阳离子树脂 瞬时,
稳定有或无贴壁,原代悬浮细胞简单,有效化学转染的特点四,转染体筛选与分离转染后 1～ 6天收获细胞,进行核酸分子杂交或蛋白质杂交,检测外源基因的瞬时表达 。
为了获得稳定整合的细胞系,先在非选择性培养基上培养 24～ 48小时,让细胞倍增 1～ 2代,使转染 DNA表达 。
再按 1,15比例转移到选择性培养基上,每 2～ 4天更换培养基,持续 2～ 3周,促进抗性细胞生长,清除死细胞残骸,最后得到独立的克隆 。
在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，
因此需要显性选择标记来分离转染细胞。
哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。
选择剂 基因 使用浓度氨甲喋呤 dhfr－ 0.01～ 300μmol/L
氨喋呤 tk＋ 0.4 μmol/L
5-溴脱氧尿苷 tk－ 30 μg/ml
G418,Zeocin neo 100～ 800μg/ml
潮霉素 B hyg 10～ 400μg/ml
杀瘟稻菌素 bsd 2～ 10μg/ml
霉酚酸 gpt 25 μg/ml
嘌呤霉素 乙酰基转移酶 0.5～ 10μg/ml
Xyl-A ada 4 μmol/L
报告基因 特点 使用与分析方法
cat 内源活性低,蛋白稳定,线性范围窄,
体外,荧光或免疫分析
lacZ 有内源活性,X-gal染色,线性范围宽体内外,染色,比色,
化学发光或荧光分析碱性磷酸酶分泌型,线性范围宽,
受到细胞类型限制体外,比色,化学发光或荧光分析
gus 蛋白质稳定,线性范围宽,X-Gluc染色体内外,染色,比色,
化学发光或荧光分析
gfp 无内源活性,分子量小,
稳定,无需底物,紫外线激发体内外,荧光分析第三节 动物细胞培养的需求与培养基的制备动物细胞离体后,失去了消化等系统,不能利用多糖,
蛋白质等聚合程度高的化合物 。
只能利用简单的单体化合物如单糖,氨基酸等,为了维持细胞正常生长,还必须添加维生素,无机盐类,
生长类因子及激素,结合蛋白质,贴附与伸展因子及其它附加成分等 。
动物细胞对培养环境的要求高,不同细胞系的要求也不尽相同,培养基要尽可能与体内生活条件接近 。
一,动物细胞培养的营养需求
1.糖类糖类是细胞主要的营养物质,分解后释放出能量 ATP。
培养基中都必须添加葡萄糖,有时添加核糖等 。
提高细胞生长的碳源和能源,主要是葡萄糖和谷氨酰胺 。
2,氨基酸氨基酸是蛋白质和酶的组成单位 。 氨基酸还参与合成一些含氮化合物,核苷酸的四种嘌呤和嘧啶碱基,儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等 。 氨基酸可通过生糖或生酮途径转变为糖或脂肪酸,间接提供能量 。
动物细胞,8－ 10种必须氨基酸 。
离体容易失去,20种氨基酸中至少 12种是必需氨基酸：
精氨酸,半胱氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,
蛋氨酸,苯丙氨酸,苏氨酸,色氨酸,酪氨酸,缬氨酸等 。
谷氨酰胺还可作为重要的碳源和能源而被利用 。
3,维生素维生素是一类微量的小分子有机生物活性物质,对代谢和生长起调节和控制作用 。
水溶性维生素包括 B族维生素和维生素 C。 B族维生素以辅酶或辅基形式参与酶反应,主要调节酶活性和代谢活性 。
维生素 C,抗坏血酸,在体内参与还原反应,羟化反应,
促进胶原蛋白合成和粘多糖合成,抗氧化作用 。
脂溶性维生素包括维生素 A,D,E,K四种 。
维生素 A维持正常视觉和上皮组织 。 维生素 D为视固醇类化合物,主要是调节钙磷代谢 。 维生素 E即生育酚,是抗氧化剂,防止生物膜中磷脂的不饱和脂肪酸被氧化 。 维生素 K,促进合成凝血酶原,促进血液凝固 。
5,无机盐类无机盐是细胞代谢所需的酶的辅基,同时保持细胞的渗透压和缓冲 pH的变化 。
Na＋ 和 Cl－ 参与生理电活动,维持水平衡,保持渗透压和酸碱平衡 。 离体培养为细胞提供足够的 Na和 Cl离子是基本条件,一般生理盐水的离子浓度 （ 0.9% NaCl） 。
Ca2＋,Mg2＋,对细胞间的互黏稳定起重要作用 。 在离体培养时,螯合细胞间的 Ca2＋ 和 Mg2＋,可以达到分散细胞的目的 。
磷是核酸,磷脂等的组成成分 。
碳酸盐缓冲液是重要的体内缓冲体系,与 K＋,Cl－ 等在维持酸碱平衡具有重要作用 。
6,生长类因子及激素细胞之间是相互联系的,而非孤立的 。 特别是高度分化功能的动物细胞更是如此 。
细胞离体生长时,必要添加激素与细胞生长因子等 。 胰岛素是最常用的激素,促进糖原和脂肪酸的合成,对细胞的生长有刺激作用 。 其它激素有促卵泡激素,甲状腺素,乳激素,生育酚等 。
细胞因子有表皮生长因子,成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子,根据不同细胞添加 。
为了细胞的贴壁生长,必需添加贴附因子,纤维结合蛋白,
胶原等,伸展因子如表皮生长因子,成纤维细胞因子等 。
二,动物细胞培养的环境需求
1,水与渗透压细胞生长离不开水,水是细胞反应的重要介质 。 1） 水是一种良好的溶媒,营养物质在水中被吸收,废物在水中被排泄 。 2） 具有热稳定性和导热性,调节稳定温度 。
正常血浆渗透压主要是无机盐 Na＋,K＋,Cl－,HCO3－
等构成,蛋白质构成胶体渗透压较小 。
动物细胞对渗透压有较强的耐受性,常用增减 NaCl的浓度调整渗透压,每增加 1mg/ml NaCl,渗透压增加 32
mOsm/kg。
离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液 。
2,温度不同种类的动物细胞对温度的要求是不同的,变温动物对温度要求没有恒温动物严格 。
哺乳动物细胞最佳培养温度为 37℃,鸡细胞为 39－ 40℃,
而昆虫类细胞为 25－ 28℃ 。
在培养过程中,根据细胞种类选择确定适宜的培养温度 。
哺乳动物细胞的耐受温度范围较窄,在 35-37℃ 内能正常进行代谢和生长,超出范围会引起细胞伤害甚至死亡 。
细胞对低温的耐受性比高温要强,低温抑制生长,但无伤害作用,在冰点温度附近仍能存活 。
3,氧气动物细胞生长必须有氧气,无氧下,能获得能量供应,但细胞缺氧时不能生存 。 离体培养的气体含有 5％ CO2和 95
％ 空气,其中氧浓度为 21％ 。 有时充以 N2气稀释 O2浓度 。
O2浓度在 60%以上为高氧环境,对细胞毒性较大 。
4,pH值动物细胞对 pH值很敏感,低于 6.8或超过 7.6会产生严重影响 。 机体细胞的 pH范围为 6－ 8,血液和体液中,变化范围很小 。 人血液 pH维持 7.36-7.44。 pH低于 7.05会发生酸中毒,高于 7.45发生碱中毒 。 细胞代谢产生 CO2,使培养液变酸,pH发生波动 。 合成培养基偏酸性,为了稳定 pH，
可用缓冲体系配制 。 在开放体系中,CO2逸出,使培养基变碱 。 通入 5％ CO2,可维持在 pH7.2-7.4范围内 。
5,生长基质改变生长表面特性,促进细胞贴附的物质 。
贴附细胞生长需要一个支持介质,采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质,帮助细胞的贴附和生长 。
生长基质为胞外基质成分,多聚赖氨酸,纤维连接蛋白,
胶原,层黏蛋白,韧黏素等 。
生长基质已有商业化产品,用 PBS或 BBS配成 10倍贮存液,
在 37℃ 下包被,静置 2－ 4小时或室温过夜,对器皿表面进行包被,然后无菌生理盐水洗涤后使用 。 有些还可以直接加入培养液 。
生长基质 贮存液浓度 使用浓度 使用方法多聚赖氨酸 0.5 mg/L 0.05 mg/L 表面包被纤维连接蛋白
10 mg/ml 1 mg/ml 加入培养液层粘蛋白 5～ 10μg/ml 表面包被韧粘素 75 μg/ml 5～ 15μg/ml 包被或加入培养液胶原蛋白 1～ 3 mg/ml 0.1 mg/ml 表面包被
6,抗生素动物细胞培养过程中,由于培养基营养丰富,很容易被微生物污染 。 虽然对使用抗生素仍存在质疑,但还是常添加抗生素,以避免轻度污染 。
抗生素使用浓度差别很大,一般范围为 50～ 100 μg/ml。
在大规模生产中,除了青霉素和 β-内酰胺类抗生素外,
其它抗生素可以使用 。
抗生素使用对细胞会产生毒性,而且使实验室保留抗药性微生物,应加以注意和克服 。
抗生素 作用对象 工作浓度 （ μg/ml） 稳定性 （ 天 ）
两性霉素 B 真菌 1～ 2.5 3
制霉菌素 真菌 50 3
氨苄青霉素 G＋,G－ 细菌 100 3
红霉素 G＋ 细菌,支原体 100 3
四环素 G＋,G－ 细菌,支原体
10 4
庆大霉素 G＋,G－ 细菌,支原体
50 5
利福平 G＋,G－ 细菌 50 3
卡那霉素 G＋,G－ 细菌 100 5
链霉素 G＋,G－ 细菌 100 3
氯霉素 G－ 细菌 5 5
青霉素 G G＋ 细菌 100 3
三,动物细胞培养基的种类与组成动物细胞对培养基的要求高,不同细胞系的要求也不尽相同,因此培养基成分复杂而且昂贵 。 但是要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境 。 主要组成成分如下：
糖类,必需氨基酸,维生素,无机盐类,生长类因子及激素,结合蛋白质,贴附与伸展因子及其它附加成分等 。
不同细胞对葡萄糖利用相似,但对氨基酸的利用相差很大,
不同的细胞过程对氨基酸的需求存在差别 。 目前停留在流加谷氨酰胺上 。
血清：蛋白质,氨基酸,葡萄糖,激素和生长因子等 。
胎牛血清,新生牛或成牛血清,马血清,鸡血清,羊血清及人血清,最广泛应用的为胎牛血清和新生牛血清 。
水解乳蛋白和胶原富含氨基酸 。 血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养 。
脂类化合物对动物细胞培养是必需的,实际中类脂及其前体和血清常平行使用 。 添加的蛋白质试剂主要有铁传递蛋白,起离子载体的作用,有时用无机铁盐代替 。 胰岛素起生长素的作用,白蛋白起保护剂作用 。 其他附加成分如核苷类及丙酮酸盐等是培养基的必需成分,有助于细胞克隆和特异化细胞的培养 。
动物细胞培养过程中,被微生物污染 。 常添加抗生素,
以避免轻度污染 。
1,天然培养基直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基,如血浆凝块,血清,淋巴液,胚胎浸出液等 。 营养价值高,成分复杂,不稳定,来源受到限制,不宜大量培养和生产使用 。
2,合成培养基合成培养基用化学成分明确的试剂配制的培养基,组分稳定 。 现在已有几十种合成培养基,大部分已商品化 。
组成：无机盐,糖,氨基酸,维生素及其他成分 。
由于细胞种类和培养条件不同,所用合成培养基也不同,
在动物细胞培养中最常用培养基有 7－ 8种 。
3,无血清培养基无血清培养基是全部用已知成分组配的,不加血清的合成培养基 。 在含有营养和贴壁因子的基础培养基中,加入适宜的细胞生长因子,细胞良好生长,适合于制药生产 。
无血清培养基提高了培养的质量,避免了使用血清带来的麻烦,产品纯化容易,组分稳定,可大量配制 。
无血清培养基通常需要添加激素与生长因子,结合蛋白,
贴壁与伸展因子,低分子营养成分等 。
大多数无血清培养基含有蛋白质和激素等大分子物质,适宜于多种细胞系的培养 。 对于大规模生产用的无血清培养基,往往成分不完全清楚,但简单而且低成本 。
四,培养基的控制
1,培养用水质细胞培养水质最低要求电导率在 1X106Ω cm以上 。 水存放时间不宜超过 2周 。 对于制药,必需使用纯净水配制培养基,普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物,还必需除热源,达到纯净水标准 。
2,缓冲液缓冲液：弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成的,pH恒定但不干扰试验 。 不同种类细胞对 pH 要求不一致,不同生长阶段对 pH要求也不同 。 原代细胞 pH要求严格,而传代细胞要求较宽 。 细胞培养过程中代谢产生酸性物质,使培养基的 pH不断下降 。 缓冲液中和培养液中的酸性物质 。
最广泛使用为碳酸氢钠 /碳酸,其次为磷酸二氢钠 /磷酸氢二钠,调节二者的比例,配制成不同 pH缓冲液 。
碳酸盐缓冲液除了直接的缓冲作用外,还有间接作用,碳酸生成挥发性 CO2后很快逸出 。 细胞呼吸产生的 CO2与水形成碳酸,任何碱在培养液中都被中和,生产相应碳酸氢盐其他缓冲液,Tricine-Glycine,MOPS,TES,HEPES,
DIPSO,HEPPSO 等等有机缓冲液,缓冲能力强 。 Tris
所含氨基具有高的化学反应活性,能抑制细胞生长,并通过生物膜,它调节 pH要依赖于温度的变化,因此不宜作为培养液 。 离体培养中,缓冲液多为平衡盐溶液的重要组分之一,很少单纯使用 。
3,生理盐水与平衡盐溶液在缓冲液的基础上,添加调节渗透压的盐类,在一定程度上能满足细胞对 pH和盐离子要求 。
缓冲液或缓冲盐溶液用于,配制溶液,处理细胞的溶液 。 对于直接接触,长期培养的培养液,常用生理盐水和平衡盐溶液,是渗透压与胞浆渗透压平衡的溶液 。
生理盐水供给细胞水分和各种离子,维持一定渗透压,并能良好溶解试剂和药物 。 有各种不同成分的生理盐水,分别加入 pH缓冲剂与指示剂,葡萄糖,形成平衡盐溶液 。
平衡盐溶液：集缓冲液的缓冲能力,生理盐水的等渗能力,
营养供给为一体,具有多种功能和作用 。
BSS配制：
1） 先分别溶解 CaCl2,MgCl2,MgSO4。
2） 在另一容器中依次溶解其他试剂 。
3） 在另一容器中用 5.6% NaHCO3数滴溶解酚红 。
4） 将含 Ca2+,Mg2+溶液缓慢倒入步骤 2配制的溶液中,搅拌,防止沉淀 。
5） 再加入酚红溶液 。
6） 补足水,并用 NaHCO3调节 pH。
含葡萄糖的 BSS过滤除菌,不含葡萄糖时常规高压灭菌 。
小量培养液可置 4度保存 。 一旦出现沉淀,要重新配制 。
注意事项：
细胞只利用 L型氨基酸,不能利用 D型,对于 DL混合型氨基酸,使用量应该加倍 。
谷氨酰胺溶液中很不稳定,要单独配制成浓缩液 。
NaHCO3一般配成 3.7％,5.6%,7.4%三种浓度,过滤除菌或高压灭菌,4度保存,使用前加入,调节培养基 pH。
为了优化细胞生长环境,还添加其他成分,如嘌呤和嘧啶类,维生素 C,谷胱甘肽,巯基乙醇 。
一般情况下,培养基成分如氨基酸,维生素,葡萄糖,缓冲液等,补充因子几类,先配制成高倍浓缩的母液,过滤灭菌,冷藏 。 使用时按一定比例稀释,配制成工作液 。
第二节 动物细胞增殖生长的动力学过程一、单细胞生长增殖周期从一个细胞分裂形成两个新细胞的过程为一个细胞周期或一个细胞世代 。 单个细胞周期包括细胞间期,细胞分裂期,
间期又包括间期 1,DNA合成期和间期 2三个时期 。
不同的细胞类型其分裂周期及各期的时间都不同，培养条件及培养基成分也会影响细胞周期,一般地动物细胞分裂周期为 12－ 48小时,典型的细胞周期为 24小时。
对连续细胞系，失去了细胞周期控制，人工培养条件不适，
细胞将发生程序化死亡即凋亡。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等可引发凋亡发生。
二,细胞群体的生长过程细胞群体生长增殖过程与微生物的生长增殖过程相似
1,潜伏期,细胞经历一段悬浮状态,贴附于器皿表面 。
2,对数生长期：细胞分裂旺盛,指数增加 。 细胞相互接触汇合成片,接触抑制,限制分裂和运动,密度不再增加 。
3,静止期,分裂数与死亡数相等的相对动态平衡时期 。
4.衰亡期：细胞死亡数目大于分裂数目的时期 。
三,群体细胞生长的动力学参数细胞分裂代数 G就可用下列公式计算：
G＝ logN－ logN0） /log2
第四节 动物细胞的分离与培养一、细胞的种类生物体是由多种多样的分化细胞构成,如人体的细胞类型达 200余种 。
这些细胞都是由受精卵分裂产生的细胞后代生长增殖分化而来 。 不同细胞具有不同的功能,细胞分化异常导致癌变 。
分化程度越高,脱分化的能力越差 。
在胚胎发育过程中,高等动物细胞的分化是由全能性变成多能性,再变成单能性,进而失去再分化的能力 。
虽然成熟细胞不能再分化,但其细胞核仍然具有全能性,
因此可以通过核移植,克隆动物 。
体外培养细胞,可分为原代细胞系,传代细胞 。
原代培养：
从体内取出的组织细胞进行体外接种培养,原代培养的细胞为原代细胞,它生长分裂并不旺盛,与体内细胞相似,
适合于药物检测实验 。 生产中有些产品仍沿用原代细胞,
如鸡胚细胞,兔或鼠肾细胞,淋巴细胞 。
传代细胞,
原代细胞转接后培养的细胞 。 传代后,细胞分裂增殖旺盛,
能保持一致的二倍体核型,所以又成为二倍体细胞系 。 传代细胞的增殖能力有限,所以也称为有限细胞系 。 如 WI
－ 38,MRC－ 5,2BS等用于生产 。
根据细胞的传代次数和寿命,可分为有限细胞系和无限细胞系或连续细胞系 。
有限细胞系,正常细胞经过多次传代后,一般可连续培养
30－ 50代,就会逐渐失去增殖能力,也就是说它们只能生长有限的时间,经过若干传代培养后将老化死亡 。
无限细胞系：当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后,才能变为无限细胞系 。 如肿瘤细胞就是自发形成的永久细胞系,没有分裂次数的限制 。 物理,化学或生物因素也能获得 。
细胞寿命无限,生长不受细胞密度的影响,倍增时间短不具接触抑制现象,它对培养条件和生长因子等要求低,，
非常适合于工业化生产,理想的药物生产细胞系 。
根据细胞对生长特性和对基质的依赖性,可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞 。
贴壁依赖性细胞：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面,细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子,
使细胞依附在支持物表面,才能生长和增殖,大多数动物细胞都属于此类 。
非贴壁依赖性细胞：生长不依赖于固体支持物表面,可在培养液中悬浮生长,有时被称为悬浮细胞 。 血液,淋巴细胞,肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类,生长干扰素的
Namalwa细胞 。
有些细胞对支持物的依赖性不严格,可贴壁生长,可悬浮生长 。 中国仓鼠卵巢细胞,小鼠 L929细胞,BHK细胞 。
二,工程细胞的获得与保存目前用于制药的动物细胞有 4类,即原代细胞系,二倍体细胞系,异倍体细胞系和融合的或重组的工程细胞系 。
细胞无限传代,使大规模工业化生产药物成为可能 。
异倍体细胞用于产生重组基因工程产品,使动物细胞成为药物生产的一个新领域 。
1,原代细胞系的分离与培养用原代细胞系生产药物需要大量的动物 。
动物组织或器官洗涤 粉碎酶解消化离心或过滤接种培养培养液稀释细胞洗 涤
37度消化,检查是否充分和完全 。
胰蛋白酶：细胞间质较少的软组织,
胚胎,肝,肾及传代细胞胶原酶：纤维,上皮,癌组织工作浓度,0.1-0.3 mg/ml
链霉蛋白酶,粘蛋白酶,蜗牛酶
2,传代细胞培养长满器皿表面的细胞进行分离,接种到新的培养基上,
进行新一轮培养 。
掌握好最佳时期：刚刚全部汇合的细胞,过早产量低,
过晚健康状态不佳 。
过程与原代细胞相同,用 30－ 50倍体的 0.25％ 胰蛋白酶和 EDTA对细胞块消化,消化后再培养 。
要注意消化程度,细胞对酶的反应不同,有的敏感,掌握好适宜的消化时间和方法,不要过度,获得细胞浓度均匀,生长速度一致的传代细胞 。
曾经广泛应用,但不是理想的生产细胞系
3,细胞系的建立与保存一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系,就建立细胞库,
进行长期保存 。 根据药品生产的有关规定,必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库 。
WCB
1
QC
WCB
2
QC
QC
原始培养物
MCB
QC内容：细胞活性检测、无菌实验、核型、
DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其他外源物试验、稳定性和基因型分析等，
工作细胞库必须与主细胞库完全一致。
低温冷冻保存：
用冷冻保护液 （ 含 10％ 血清的培养液,附加 10％ 甘油或
7.5%-10%二甲基亚砜 ） 细胞预冷,稀释成 106细胞 /ml。
分装,火焰下封口 。 缓慢冷冻,细胞放入 CO2低温冰柜或液氮中,温度为 -150— -190℃,细胞的全部活动几乎处于停止状态 。
复苏细胞：
冷冻细胞取出,立即在 37℃ 水浴中,快速融化 。 在保护剂存在下,慢冻快融是保存复苏细胞的要领 。 融化后的细胞可用于进一步实验 。
三,大规模培养方法根据动物细胞的生长特点,只能采用悬浮培养,贴壁培养,
固定化培养等三种主要方法进行大规模培养 。
1,单层贴壁培养细胞贴附于一定的固体支持表面上,进行的培养方法 。 大多数动物细胞属于贴壁依赖性,贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法 。 接种后,细胞经过吸附,接触而 贴附于基质表面,然后进行 生长,分裂繁殖,很快进入对数期 。
一般数天就长满整个表面,形成致密的单层细胞 。
贴壁培养容器,转瓶,玻璃珠,微载体和中空纤维等 。 滚瓶是为早期培养所采用,结构简单,投资少,重复性好,
但劳动强度大,占用空间大,产量低,不易控制和监测 。
细胞贴壁原理：
细胞主要靠静电引力和范德华力贴附在固体表面,因为动物细胞在生理状态下带负电,贴壁培养的固体表面要求具有正电荷和高表面活性 。
适宜的电荷密度是粘附和贴壁的关键,电荷密度低,不能有效粘附,电荷密度高则会对细胞产生毒性 。
优点：容易更换培养液,灌注培养时,能达到高细胞密度；
有利于产物的分泌表达,可改变培养液与细胞的比例 。
缺点：操作较烦杂,检测受到一定限制,培养条件难以均一,传质和传氧差,放大培养是瓶颈 。
2,微载体培养微载体为三维培养系统,细胞贴附于微载体上伸展和增殖,
再悬浮于培养液中 。
微载体培养兼具贴壁和悬浮培养的双重优点,有很大的比表面积,供单层细胞贴附和增殖 。
悬浮微球使细胞生长的环境均一,培养基利用率高,重复性好,减少了劳动强度,容易放大,于 20世纪 80年代正式用于工业化生产干扰素,疫苗和尿激酶原等 。
多孔微载体或多孔微球,极大地增加了比表面积,如
Cytodex-1的比表面积达 6000 cm2/g,Cytopore的比表面积达 28000 cm2/g。 商品化的微载体基质有玻璃,葡聚糖,
纤维素,塑料和明胶等,表面带电基团为 DEAE等 。
玻璃珠：直径约 2～ 3 μm,密度 1.5 g/cm3,难以在低速下悬浮 。 在玻璃表面覆盖塑料,可得到低密度微载体,如
Bioglas和 Ventreglas,而中空玻璃也可达到此密度 。
葡聚糖微载体：带正电,干粉可在 pH7.2的磷酸盐缓冲液中吸胀,清洗灭菌后使用 。
Cytodex 2,电荷性大大下降,吸附能力很低,适合于蛋白质药物的生产 。
纤维素微载体 DE52和 DE53,适合多种细胞培养 。
塑料载体 Biosilon是聚乙烯载体,无吸附性能,可重复使用,但贴壁较慢,对细胞的摩擦损伤较大 。
聚丙烯酰胺载体贴壁较快,亲水性 。
微载体的选择依赖于搅拌系统和工艺过程，可用于转瓶、
搅拌烧瓶和气升式反应器等。
为了提高贴壁能力，对基质表面进行包埋，如血清蛋白、
多聚赖氨酸处理，可加速贴壁过程。
在悬浮培养早期，还可向培养液补充丙酮酸、腺嘌呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶等。
多孔微载体：
直径 0.2～ 5 mm，孔径 20～ 300 μm，达占总体积的 85%，
可实现细胞的固定化，达到高密度培养。
广泛使用的多孔微载体有 Cellsnow,Cytocell（纤维素基质）,Verax,Cultisphere（胶原）,Cytoline 1和 2（聚苯乙烯）,ImmobaSil（硅橡胶）及 Siran（玻璃）等。
主要用于搅拌反应器、固定床和流化床反应器。
贴壁培养的固体表面要求：
正电荷和高度表面活性 。 玻璃,聚苯乙烯塑料,不锈钢金属材料和微载体,多孔微载体或多孔微球 。 商品化的微球基质是葡聚糖,聚丙烯酰胺,明胶交联,聚苯乙烯和纤维素等,带电基团为 DEAE等 。 微载体有 CytodexI,II,III
和 DEAE－纤维素等,已是主要的培养方法 。
理想的微载体所具备的性能：
质地柔软,微球间摩擦轻；耐高温,可高压灭菌；透明性,
便于观察细胞生长；细胞相容性,利于贴附和生长；无毒性和惰性,对细胞无毒害,不产生有害物质,不吸附培养基；低速即悬浮,静止即沉降,便于换液和收获；微粒大小均匀；可回收重复使用 。
3,悬浮培养细胞在反应器内游离悬浮生长的培养过程,主要对于非贴壁性依赖性细胞,如杂交瘤细胞等 。
动物细胞悬浮培养是在微生物发酵的基础上发展而来的,
经常借鉴发酵理论和经验,但有自身的特点,由于动物细胞没有细胞壁,不能耐受剧烈的搅拌和通气剪切,对环境适应性差 。 在悬浮培养中要注意发挥 动物细胞的特性 。
常用的反应器有通气式搅拌混和气升式生物反应器 。
方法的优点是操作简单,培养条件相对均一,传质和传氧较好,容易放大培养 。 细胞体积小,密度低,培养病毒易失去标记而降低免疫能力 。
4.固定化培养细胞包埋在微载体内或胶囊内,即细胞固定化后,进行悬浮培养 。 适宜于贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞的培养 。
细胞密度高,抗剪切力和污染等优点,是生产首选方法 。
吸附：通过物理吸附使细胞贴附在固体载体表面,微载体和中空纤维培养等 。
共价交联：双功能试剂处理细胞,使细胞之间交联的固定化方法 。
包埋：细胞包埋在载体内部 。 网格型为高分子凝胶细网格,而微囊型为高分子半透膜 。 包埋材料有人工聚合物,
琼脂糖凝胶和血纤维蛋白等 。
微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内 。
多聚赖氨酸 /海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚赖氨酸覆盖,形成一层多孔可透薄膜,再使凝胶载体液化,
便可制成微囊 。
杂交瘤细胞与海藻酸钠溶液混合,经微囊发生器,微球滴入氯化钙溶液中,形成凝胶,然后用聚氨基酸处理,使微球表面成膜,再用柠檬酸去钙离子,球内海藻酸钠成液态,
细胞在在微囊内悬浮 。
微囊化固定培养工艺在单克隆抗体的生产中获得成功,使抗体截留在膜内,血清中的蛋白质被排出在膜外,产物浓度和纯度较高 。 培养结束后,收获微囊,破微囊,纯化抗体,纯化工艺简单,应用前景广 。
三,细胞培养的操作方式动物细胞的培养的操作方式与微生物培养基本相同 。
（ 一 ） 分批式操作已用于搅拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞,生产单克隆抗体 。 分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为
3～ 5天,细胞密度达 2～ 5× 105 /ml,最大比生长速率大约为 0.05 h-1。 单克隆抗体的产量约 10～ 100 mg/L。 在大规模搅拌反应器中,细胞密度较低,最终达 5× 106,而在
750～ 1500 cm2的转瓶生产中,细胞密度达 1～ 2× 108。
(二 )流加式操作最常见的流加物质是葡萄糖,谷氨酰胺等能源和碳源物质 。 通过流加控制,可实现高密度培养 。
杂交瘤细胞培养,细胞密度可达 1.4× 107,生产抗体的产量比分批操作提高几～ 10倍,可达 500 mg/L。
由于培养体积不断变化,流加对过程的控制能力仍然有限 在实际生产中应用少 。
（ 三 ） 半连续式操作动物细胞培养生产药物中经常采用 。 已应用于大规模生产乙肝表面抗原,tPA等基因工程产物 。
半连续操作特别适用于分泌表达型细胞,如杂交瘤细胞的培养,尤其是微载体系统 。
微载体系统培养基因工程 CHO细胞,待细胞长满载体后,
反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原,制备乙肝疫苗 。
该方式操作简单,使细胞密度和产量维持在较高水平,能在较长时间内进行持续生产,反复收获产物,生产效率高,
是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式 。
（ 四 ） 连续式操作不断收获产物,生产中用于非贴壁依赖性细胞培养 。
在动物细胞培养中,比生长速率比稀释速率大 。 很难建立单一限制性基质的衡化培养,需要多种营养物质流加 。
稀释速率可从 0到最大生长速率之间变化,高稀释速率将带出细胞 。 在稳态,抗体的生产可维持几个星期甚至几个月 。
连续操作的培养条件稳定,抗体处于最佳生产状态,可准确控制最优化参数,产率较高,但必须控制培养基的流加速度和液位高度 。
（ 五 ） 灌流式操作细胞被截留在反应器内的连续操作,是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式 。
截留细胞方式：过滤系统有两种,一种是安装在反应器内部或外环的旋转过滤器,另一种是切线过滤设备 。
灌流体系,100％ 截留细胞,如固定化包埋细胞,可通过中空纤维,平板膜,凝胶颗粒和微囊等实现；部分截留细胞,如使用微载体系统,贴壁系统,分离悬浮系统等实现,
其中分离悬浮系统包括使用膜过滤,旋转过滤,离心,重力沉降等分离技术 。
流化床包埋培养人鼠杂交瘤细胞,整个反应器有效浓度达
4× 108/ml,单位体积产量提高 200～ 300倍 。
优点：
1） 大大提高了细胞生长密度和产物浓度 。
2） 利用培养基,降低细胞代谢废物,细胞生长良好 。
3） 产物为分泌蛋白质,滞留时间短,避免了产物的聚合,降解等产量和活性形式的变化,有利于纯化 。
4） 中空纤维生物反应器,固定床或流化床反应器,膜生物反应器等的唯一可操作方式 。
缺点：要求复杂仪器设备控制灌流操作过程,由于过滤器容易堵塞,从而限制培养次数 。
四,动物细胞培养反应器
（ 一 ） 转瓶最早的大规模培养的反应器 。 结构简单,操作培养简便,
不进行过程控制 。 现在主要用于生产疫苗如流行性腮腺炎,
风诊麻疹等或用作种子罐 。
（ 二 ） 搅拌罐反应器其结构与微生物发酵罐相似 。 主要区别：较低的高径比,
满足细胞对溶解氧的需求；低搅拌转速,大幅倾斜度桨叶或无桨,避免机械伤害；圆形罐底,防止细胞及载体沿体壁的沉积 。
大规模培养生产药物的主要设备,用于悬浮细胞,微载体,
微囊和巨载体培养等 。
(三 )气升式生物反应器没有搅拌装置,气体从罐底的喷射管进入反应器的导流管 。
湍流温和而且均匀,循环量大,细胞与培养液混合均匀 。
剪切力小,细胞的伤害小 。 喷射供氧,氧传递速率高,供氧良好 。 适用于悬浮细胞分批培养,微载体和连续培养 。
已有全自动密闭结构的气升式反应器,气体从罐底输入,
沿中央内管上升,一部分气体溢出,另一部分被引导沿罐内壁下降,到达底部与新气体混合再度上升 。 通过计算机控制混合气体的组分,维持培养基内的容氧和 pH值 。
Celltech公司气升式反应器培养杂交瘤细胞,生产单克隆抗体 。 抗体合成大多数处于稳定期和衰退期,不同细胞株系,生产周期为 140－ 400h。 从 10L逐级放大到 10000L,共
17d,生产抗体 100g,比传统摇瓶提高约 5倍 。
(四 )流化床生物反应器细胞固定在多孔微载体中,培养基以适当的流速自下而上经过,使多孔载体处于悬浮的流态的反应器 。 Verax公司 CF－ IMMO多级和 SF－ 2000流化床反应器,用于生产疫苗和基因工程产品 。
上部微载体依靠沉降作用与培养基分离,
一部分培养基被收集,提取产物,同时排出部分废物；其余部分再流加等体积新培养基,提供营养,实现高密度培养 。
这种反应器结构比较简单,传质性能好,
采用膜气体交换器,能快速提供氧气 。
固定床反应器：
填料为无细胞毒性的生物兼容性可附着细胞的惰性材料,可以是不锈钢,玻璃陶瓷和塑料和合成高分子材料 。
与流化床反应器的区别为固定床反应器使用实心载体,流化床反应器使用有孔载体 。
现用多级流化床和多孔微球培养 。
（ 五 ） 中空纤维生物反应器一个特制的圆筒,内部装有数千根中空纤维管束 。
接种孔 水套层 产物出口培养基入口产物出口培养基入口内膜外膜腔室细胞培养基分散后,灌入床层 。 纤维管壁薄,半透膜,截留不同分子量 。
纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长 。
细胞接种于外室,贴附在纤维外壁,吸收从内室渗透出来的营养成分,生长繁殖 。
1－ 3周后可占据所有的纤维空间,并在纤维外壁表面上堆积成多层,细胞密度可达 108/ml。
细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室,产物只能在外室积累和浓缩 。
细胞代谢的废物是小分子物质,可渗透进入内室,从内腔开口排出,避免了对细胞的毒性 。
在收获时,打开纤维管之间的外室开口,产物就流出来 。
此时虽然细胞停止分裂,但细胞的存活,健康和核形态不变,代谢和分化功能仍可保持数月 。
纤维材料,聚砜,丙烯共聚物,聚丙烯,纤维素,醋酸纤维素,聚甲基丙烯酸甲酯等 。 纤维素亲水性强,对渗透性影响较大,不适合于 Vero细胞及其他贴壁细胞培养 。 醋酸纤维和聚甲基丙烯酸甲酯亲水性弱,极性大,适宜于贴壁细胞培养 。
优点,占地小,产量和质量高,成本低 。
不足,不能重复使用,不耐高压灭菌,只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌,不能取样检测 。
中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统,应用广泛,主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体 。 已有多家公司生产制造和销售中空纤维生物反应器,其发展的趋势是达到高密度培养的目的 。
第五节 动物细胞的增殖行为与培养过程动力学一、动物细胞的增殖周期单细胞增殖周期：
细胞间期间期 1(G1)、
DNA合成期 (S期 )、
间期 2(G2)
细胞分裂期 （ M期 ） 。
M期为有丝分裂期,超螺旋化的染色单体,经过前期,中期,后期和末期,被纺锤体拉向两极,中间形成细胞板,
一个细胞分裂成两个子细胞 。
M期一般时间很短,为 0.5～ 1小时 。
同一类细胞的周期及其各期持续时间是一定的,但不同类型的细胞分裂周期及各期时间都不同,差异主要取决于
G1期,而 S和 G2期相对稳定 。
对连续细胞系,失去了细胞周期控制,培养条件及培养基成分会影响细胞周期 。 当人工培养条件不适,细胞将发生程序化死亡即凋亡过程,整个细胞分解后被膜包裹形成凋亡小体 。 在培养过程中,缺乏生长因子或血清,营养受限和逆境等均可引发凋亡发生 。
二,悬浮培养细胞生长动力学体外培养的细胞是以群体形式进行增殖和生长的,其动力学过程与单细胞微生物的生长相似 。 动物细胞培养的核心参数是活细胞浓度,可用细胞比生长速率 （ μ）,比死亡速率 (Kd)和活细胞分数 (fv)来描述,计算生长动力学 。
1,悬浮培养细胞生长一般动力学充分混合的悬浮培养游离细胞的反应器,假设流加操作时流出率为 0,分批操作时流加率和流出率均为 0,密度不变,
反应器内则质量守恒：
V,反应器内的培养液体积,
Fi,流加新培养液的体积速度,
Fo：消耗培养液的体积流速 。
oi
FF
dt
dV
假定总细胞处于平衡状态：
总细胞的积累速率 =细胞的流加速率－细胞的流出速率＋
细胞生长速率－细胞裂解速率。在不进料情况下，总细胞平衡：
NVNF
dt
NVd
apo 0
)(
N：细胞总浓度，
uap：表观比生长速率，包括细胞的生长和死亡。
只有活细胞才能分裂,并假定活细胞不发生死亡：
dlvap NkNN
μ为真实比生长速率 ;Nv为活细胞浓度 ;
Nd为死 细胞浓度 ;kl为死细胞比裂解速率。
活细胞占主导，死细胞裂解可忽略，即 k l ＝ 0，那么
v
ap
v
ap
fN
N?
)(
当活细胞转变为死细胞时，没有直接改变细胞的总浓度，
那么活细胞处于平衡：
VNFN
dt
VNd
vaov
v 0)(
μa为活细胞表观比生长率：
da k
对于连续培养，反应体积恒定，所以 Fi=Fo=F。
取样对反应器 V的 影响可忽略。表观比生长速率：
D
dt
Nd
ap
)l n (
D为稀释速率（ Fo/V）
细胞活性降低时,μ远离 μap（ D恒定）。细胞死亡速率,
dt
Nd
Dk vd
)l n (
在高稀释速率下，死亡速率较低。
只有在低稀释速率时，死亡速率才重要。
2,分批培养分批培养时,Fi=Fo=F=0。 用 D=0替换前面方程,可得到分批培养的 μap,μ,kd。
dt
Nd
ap
)ln (
dt
Ndk v
d
)ln (
v
ap
v
ap
fN
N?
)(
在 kl较小时（稳定期）成立，直到静止后期或死亡期。
3,流加培养流加体积对反应器效率影响很大时,Fo=0,但 Fi≠0,所以 V不是常数 。 不用细胞浓度,用细胞数目 （ 分别为 NV
或 NvV） 解方程,得出到流加培养时总细胞,活细胞的表观比生长速率,比死亡速率分别为：
dt
NVd
ap
)ln (
dt
VNd v
a
)ln (
dt
VNd
k vd
ln
5,截留细胞的连续培养流出的总细胞浓度为 No=αsN,αs为流出液细胞浓度与反应器中细胞浓度的比率,截留速率 （ 反应器中截留的细胞分数 ） 为 1-αs。 对于 Fi=Fo=F,V恒定的体系,总细胞浓度为：
NND
dt
dN
aps
D替换为 αsD，可得到 μap,μ,kd
6,细胞裂解期低稀释速率的连续培养 （ 无论细胞是否截留 ） 和分批培养的静止后期和衰亡期,细胞活性较低,细胞裂解相当重要 。
高速搅拌时,细胞裂解也很严重 。
计量细胞生长参数,必须考虑细胞裂解 。 可用细胞释放到培养液中的乳酸脱氢酶 （ LDH） 表征 。
根据培养液中 LDH的浓度可估计死细胞数目 （ 包括完整和自溶细胞 ） 。
三,微载体培养细胞生长动力学在灌流体系中，载体被截留，游离细胞随流出液而流出。
体积恒定的灌流体系中，总细胞平衡为：
NDN
dt
dN
apF
N
N
D
dt
Nd F
ap
)ln (?
表观比生长速率：
dt
Nd
k AAR
)ln (
细胞释放速率：,
四,细胞培养代谢动力学代谢系数：单位活细胞的消耗速率和生产速率，它直接反映了培养过程中的代谢参数随时间和培养条件的变化。
用它进行不同细胞种类或培养条件之间的比较，比单位时间内营养和产物变化要容易和可靠。
1,悬浮培养对于截留细胞,不截留产物蛋白质的反应器,代谢产物平衡浓度 M可表示为：
VNqMFMF
dt
MVd
vMoFi
)(
MF为进料液中的浓度。
M为反应器中的浓度代谢系数 qM为 M比生成速率（单位细胞、单位时间生成的摩尔数）
对于恒定体积反应器，代谢系数为：
v
F
M N
dtdMMMD
q
/
乳酸 /葡萄糖,O2/ATP,氧 /葡萄糖、氧 /谷氨酸、
氨 /谷氨酸、目标产物 /氧等表观得率，把代谢、
底物消耗和产物生成连系起来，估计有氧代谢与糖酵解的关联程度。
2,固定化细胞培养很难确定固定化细胞反应器中的细胞浓度。但可从流入和流出液中测定氧和代谢产物浓度，用代谢产物对时间作图，
通过代谢系数估计细胞密度。代谢产物 M的体积得率为：
)( OFM MMDQ
五,细胞培养产物生成动力学产物截留的培养体系产物截留与细胞截留一样,有利于收获高浓度的产物 。
在截留产物的培养体系中,都不能 100%截留 。 在恒定体积的反应器中,通过滤膜截留产物时,产物质量平衡为：
V
FP
P N
dtdPPPD
q
)/()(
第六节 动物细胞培养过程的检测与工艺控制检测系统和控制系统是现代的生物反应器所不可缺失的,
检测的全面性和精确性代表了反应器本身的水平和性能 。
通过一系列参数的检测,可以准确掌握反应器的运行状态,
如细胞是否处于最佳生长状态,有无污染,产物的积累情况等,采取相应的措施,调控反应过程,实现高效生产 。
动物细胞培养中,检测参数包括细胞生长环境参数 （ 温度,
pH,溶氧,转速,液流量 ） ；培养基成分变化参数 （ 葡萄糖消耗率,乳酸生成率,铵离子浓度 ） ；细胞生长状态参数 （ 形态变化,活性高低,密度大小 ） ；目标产物生产率
（ 产物的合成与积累速度,分泌 ） ；微生物污染参数 。 全面检测这些参数才能做到精确控制整个工艺过程 。
一,细胞生长状态的检测
1,细胞计数与活性分析离线分析：用血球计数板计数,或进行分光光度计比色分析,确定反应器中的细胞数目 。
在线分析：近红外线传感器,可把细胞计数和活性的控制结合在一起 。 其它方法有测定电导与电容的传感器和软件传感器,甚至是实时成像分析检测 。
检查细胞的活性：组织化学染色法和细胞形态的观察检测细胞活性 。
2,细胞凋亡检测细胞死亡有两种形式,即凋亡和坏死,其形态学和生化变化完全不同 。
坏死：细胞受到严重伤害时快速膨胀,染色质凝聚,而死亡,细胞直接裂解,坏死过程不受细胞自主控制 。
凋亡：细胞对环境变化作出的有计划的,执行预定程序的应答过程 。 其特征是细胞收缩,细胞核和 DNA断裂,同时被膜包裹形成带凋亡小体 。 在体内,凋亡小体被邻近细胞或巨噬细胞所吞噬 。
检测：
光学显微镜检查；
荧光显微镜下观察：荧光染料 （ Hoechst,Hoechst/PI,丫啶橙 /溴化乙锭 ） 对细胞染色细胞流式分析：检测培养过程中的细胞凋亡 。
琼脂糖凝胶电泳：
凋亡的主要生化特征是激活一种 Ca2+/Mg2+依赖型的核酸内切酶,将核 DNA切割成 200 bp或更大的片断 。 而坏死细胞不会出现 DNA断裂片段 。
在动物细胞培养中，细胞凋亡是很普遍的现象，在各种环境下都能发生。
培养基除去生长促进因子时，生长因子依赖性细胞系就发生凋亡。改变培养基条件，缺乏锌元素，细胞密度过高，
都会引起细胞凋亡。
细胞毒素也可能引发细胞凋亡。
凋亡细胞能排斥活体染料，台盼篮染色排除法往往低估了细胞的健康状态。
二,微生物污染检测与防止细菌污染,汤培养基于 37℃ 恒温培养,检查 。
类胸膜肺炎生物体污染：细胞仍能生长,甚至无明显变化,
常常不易发觉 。
支原体污染,染色,培养,DNA杂交和共培养,至少同时使用两种方法 。 Hoechst33258荧光染色,荧光显微镜观察 。
使用抗生素,卡那霉素,金霉素处理培养物 。
用特异性的支原体血清处理,可永久清除污染 。
高温处理,支原体和细胞的耐热性不同,支原体敏感 。
使用支原体去除剂,日本制药株式会社 MC-2120 。
三,培养基 成分检测与代谢控制
1,基质消耗的检测营养的消耗可以用葡萄糖的减少为指示,而产物的积累可以用乳酸和铵的增加作为指示,动态检测这两种物质的变化,判别细胞的状态是否正常 。
近红外测量技术可实现葡萄糖的在线测定 。
固定化和中空纤维反应器,用 NMR分析培养空间的成分,
鉴定和定量分析代谢产物 。 也可区分增殖和非增殖细胞 。
分批培养中,葡萄糖的起始浓度一般为 5～ 25 mM,谷氨酰氨的起始浓度为 2～ 6 mM。 控制氨离子浓度低于 2～ 4 mM。
乳酸低于约 60 mmol/L。
2.代谢控制过量葡萄糖，增加乳酸。过量谷氨酰胺会导致铵离子、丙氨酸或天门冬氨酸的积累。
葡萄糖限量：能减少乳酸量，增加葡萄糖的产量系数。
谷氨酰胺限量：减少铵盐和氨基酸的生成。
进行双控制（同时控制葡萄糖和谷氨酰胺），乳酸和铵离子将同时减少，使细胞代谢变得更有效。
在生产工艺中，优化二者之间的关系，使之协调起来。
把细胞活力,ATP,DNA和蛋白质的含量，与生物量或细胞计数、底物和产物代谢变化相结合，评价代谢过程，建立调控模型，进行有效控制。
目前代谢控制主要是采用多种复杂参数，包括生长速率、
吸收速率、产率和细胞内的代谢产物，是根据基础参数和生物化学参数计算而来。可用于培养过程的快速控制。
仅根据细胞密度值和流加速率计算生长速率，意义并非很大。因为两次测定时间间隔较长，数据本身就后滞，可靠性较差。
对于生长速率恒定的连续培养，细胞内 ATP含量与生长速率相关，自动取样后，用相关试剂盒对 ATP的总量进行在线分析，由在线传感器和计算模型得到实际的细胞数目。
这样，通过营养控制或温度调节可维持连续培养的恒定生长速率。
氨基酸的比吸收速率和比生成速率,细胞内酶 (如乳酸脱氢酶,谷氨酸草酰乙酸转氨酶 )的比释放速率,都可作为培养过程的瞬间参数和控制节点的阀值 。
如果能自动检测产物并计算产率，可通过计算机程序可使过程自动优化。
多元参数分析的计算程序，能改变所有的相关参数，最终找到一个最佳的生产条件。
用 HPLC在 20分钟内得到准确的结果，而 HPCE只需 5分钟。
这些新方法要用于培养过程分析，还需进一步发展和完善。
四,搅拌剪切的检测与控制
1,搅拌剪切的检测搅拌混合为生物反应器提供了均相环境，提高氧及其他营养物质的传递速率，但搅拌产生剪切力会对细胞造成损伤。
过度搅拌引起的细胞损伤可用细胞外蛋白浓度来表征，它决定了细胞的裂解程度。细胞内 LDH维持一个常数。
通过监测 LDH的释放可评价不同搅拌对细胞损伤程度。
搅拌速度与细胞损伤之间的关系是与反应器的结构相关联的，如搅拌速度、叶轮顶部速度、综合剪切因素及
Kolmogorov漩涡尺寸等，这些参数还不能用于生物反应器的放大。
不同类型细胞对流体力的应答不同，应注意细胞系的特性。
不同生物反应器产生不同的细胞应力，细胞能承受的机械应力取决于搅拌桨的形状及其直径和转速、罐体及其直径以及液相比例。
根据搅拌转速对细胞细胞损伤的影响，可确定培养基保护添加剂和搅拌桨的伤害作用等。
在搅拌生物反应器中，悬浮细胞受到的损伤来自于空气夹带和气泡破裂。如果不存在旋涡和气体夹带，计算
Kolmogorov漩涡尺寸，可预测搅拌速度对细胞的损伤。
在鼓泡生物反应器中，细胞损伤主要是气液界面处气泡的破裂，其他作用（如气泡的合并和破裂或湍流应力）则不会造成明显的损伤，在实际应用中可以忽略。如果
Kolmogorov漩涡尺寸近似于细胞大小，就不能忽略了。
2,搅拌剪切的控制反应器设计：
在表面通气生物反应器中,要避免形成漩涡 。 高搅拌速度下,安装挡板可减少漩涡并能增加通气和混合 。 填充反应器,没有顶部气体空间,就可完全消除气液界面的气体夹带和气泡破裂 。
鼓泡式生物反应器,气体应该从生物反应器中移走 。 如果生物反应器顶部气体空间不能完全消除,可使用高径比较大 （ 至少 2～ 3） 的反应器进行悬浮培养 。
在搅拌和鼓泡或气升生物反应器中，使用剪切保护剂，可在高速搅拌或剧烈混合时保护细胞。
对于多孔微载体培养，保证微珠充分悬浮和无机械损伤。
多孔微珠内的细胞受到保护，不受机械力损伤，而且如果搅拌强度较高，则细胞不能在微珠外表面生长。
在多孔微载体培养中，要尽可能使用最大的搅拌转速，进行混合，以提高微孔内外营养和代谢产物的传递。
使用多孔微载体之前，最好用各种搅拌 /混合强度检测，
并在显微镜下检查微载体的机械损伤程度。
对于无孔微载体,与贴壁非依赖性细胞的悬浮培养相比,
搅拌强度能对微载体上的细胞产生损伤,但没有漩涡和气泡夹带及气泡破 。
无孔微载体培养的其最大搅拌强度要远低于悬浮培养 。 开始培养时,搅拌速率应该能保证微载体悬浮 。
如果剪切作用太大,对细胞造成伤害时,细胞会从微载体表面脱离,脱落速度随着搅拌强度的增加而增加 。
在微载体培养中,使用葡聚糖为培养基添加剂时,能增大培养基粘度,从而保护微载体培养中细胞不受机械损伤,
这是一个纯粹的物理保护机制 。 当培养基粘度增大时,旋涡尺寸也随着增大,为此有可能提高搅拌速率,而细胞不受损伤 。
在动物细胞培养中,搅拌速率 （ 20～ 200 r/min） 要比细菌发酵 (1000～ 3000 r/min)低得多,所以需要更慢的驱动器,即使是小范围的控制 。
较大范围的电子负调节引起能量的大量损失,导致搅拌速率不稳定 。
虽然标准的速度控制器能完全控制搅拌,但流速计的控制也许最有用 。
3,使用剪切保护剂使用一些添加剂可保护细胞不受流体机械的损伤 。
血清和聚醚类非离子表面活性剂,其它剪切保护剂包括纤维素衍生物和淀粉,细胞提取物和蛋白质等 。
要么通过营养或生物学机理降低了细胞的脆性,要么通过理化机制增加了细胞与气体或液体界面的相互作用,从而改变剪切的强度或频率 。
生物保护机制：保护剂改变了细胞本身,使其抗剪切力物理保护机制：细胞抗剪切力的能力并没有改变,但影响了传递剪切力的强度和频率,减轻了细胞损伤 。
生物学效应有两种,一种为快反应生物机制,细胞改变很快而且不需要经过代谢过程；另一种为慢反应代谢机制,
细胞改变由代谢变化引起,往往需要较长的时间 。
悬浮培养游离细胞时,保护剂聚乙二醇和非离子表面活性剂 F-68和 F-88 的效果较好,减轻流体的剪切力,研究最广泛,已使用 30多年,在绝大多数情况下首先选择 。 PVA
研究并不广泛,但效果也很好 。
混合分子量的 PVP能保护鼓泡式反应器内杂交瘤的剪切损伤 。 在通气或搅拌反应器中,聚乙烯乙二醇和 PVA表现出与 F-68一样好的保护作用,而对细胞没有任何毒害作用 。
0.1％ 的 F-68和 F-88以及各种 PEG和 PVA就足够提供机械保护作用 。
血清是一种效果很好剪切损伤保护剂 。
在搅拌或通气培养中,它促进细胞生长具有剂量依赖性,
最高体积浓度可达 10％ 。
只要不抑制细胞生长,任何类型的血清都可以使用,一般
2％ ～ 5%的血清就能提供足够的保护作用 。
添加血清使药物蛋白的纯化变得复杂,还可能刺激生物应答反应或带来意想不到的变化及病毒污染,因此,应避免使用血清 。
实验表明,合成的添加剂 PEG,PVA具有和血清一样好的机械保护作用 。
纤维素衍生物应用于悬浮培养动物细胞作为剪切保护剂,
包括人,鼠和猴细胞 。
保护作用取决于细胞类型,甲基纤维素的种类和组成 。
较高浓度,较大分子量的甲基纤维素能保护昆虫细胞 。
搅拌或通气生物反应器,甲基纤维素对 CHO有保护作用 。
甲基纤维素和羧甲基纤维素能引起细胞集聚 。
尽管研究了 40多年,对于甲基纤维素的保护作用机制和通用性仍然了解很少 。
纤维素衍生物作为剪切保护剂的前景是光明的,但广泛应用还需要做很多工作 。
蛋白质和细胞提取物，包括蛋白胨、乳白蛋白水解产物、
胰蛋白磷酸盐、酵母提取物、酵母水解产物等，有各种不同的试验结果，而且研究不够充分。
牛血清白蛋白作为添加剂广泛应用于无血清培养基，许多研究者把它作为剪切保护剂。
在众多的蛋白添加剂中，牛血清白蛋白是唯一的值得推荐使用的剪切保护剂。
一些蛋白混合物（除血清外）和纯蛋白已用作剪切保护剂，但缺乏合适的控制实验，保护效应很不清晰。
五,溶解氧的检测与控制
1,通气供氧影响氧传递的因素是通入气体中的氧浓度,搅拌速率和气液接触面,直接鼓泡空气或氧,可增加气一液接触面积 。
把渗氧硅管或聚丙烯管浸没在培养基中,进行无泡通气 。
通过增加纯氧,氧浓度随氧压增加而升高 。
如果更希望得到较低的氧浓度,在空气中混合氮气,可降低氧传递动力 。
对于鼓泡式生物反应器,具有很高的氧传递速率,但对动物细胞容易受到伤害,而且容易产生泡沫 。 在搅拌罐反应器和鼓泡反应器中,常使用剪切保护剂以保护细胞 。 为防止泡沫形成,可用浓度为 6~100 ppm的硅消泡剂,
微载体鼓泡培养要采用保守方法,如低气流速率,小气泡直径,以利于氧传递,低搅拌强度并使用消泡剂 。 另外,
还可加入剪切保护剂 （ 如 F-68或聚乙二醇 ） 以减少微载体接触,浮动和聚集 。
膜通气是无气泡供氧,优点是氧传递更为有效,剪切力小,
泡沫形成量小 。
对于大规模的反应器系统,膜通气有其局限性,主要是由于设计的复杂性和需要面积较大的膜 。 运行过程中其缺点是难于对膜反应器进行清洗和灭菌 。
在大规模生产中,反应器设计都有溶氧检测装置 。 根据不同细胞类型的最适溶氧水平不同进行控制 。 通过向培养液中加入不同比例的氧气,空气或氮气或二氧化碳来控制溶氧量,溶氧量的控制常常与 pH值控制结合在一起,根据需要进行调节 。
溶解氧检测电极为偏振电极,虽然是稳定,准确的传感器,
但仍然存在一些不足 。 电极工作时间不超过 6～ 8周,而且取决于氧压力 。 培养开始后再校正电极十分困难,98%响应时间在 1分钟之内 。 为克服这些缺点,在培养开始时,
安装二个电极,当一个使用几周周后,再接通第二个电极 。
也可更换电极插孔 。
在高密度培养时,必须对供氧系统进行很好地平衡设计 。
六,温度和 pH的检测与控制
1.温度动物细胞对温度变化很敏感,对温度控制要求十分严格 。
采用高灵敏的温度计 （ 灵敏度为 ± 0.25℃ ） 来在线检测,
通过温控仪自动开关,将温度控制在误差为 0.5度范围内 。
根据温度探针 （ 铂 100）,进行反馈控制 。
预加热培养基,或加热反应器的水套层,使温度恒定 。
对于循环流动水套层,水温度略高于反应器温度 1～ 3℃ 。
对小体积反应器 （ 如 10L）,外用电子加热片,反应器内部设有冷却水管,可维持细胞的最适温度 。
2,pH值检测与控制动物细胞培养基呈偏碱性,加入微量 酚红,根据颜色的变化,显示 pH变化 。 开始时,培养液 pH为 7.4。 在培养过程中,随着细胞浓度增加,产生较多的 CO2和乳酸,pH会下降,但不能低于 pH7.0。 精确控制 pH非常重要,一般为
6.7-7.9,其波动范围为 0.05-0.9。
大规模培养中,有 pH计能随时检测 。 直接加 HCl或加 NaOH
不适合动物细胞培养 。 磷酸盐缓冲液中的磷酸及高 HEPES
对细胞有 。 常用碳酸氢盐缓冲剂,加入 CO2可降低 pH值,
加入碳酸氢盐可提高 pH值 。 碳酸氢盐缓冲液的缓冲能力弱,
安全的作法是通过控制溶氧量间接控制 pH值 。 增加溶氧量会使培养基中 CO2被置换出来,导致 pH值升高 。 因此应该合理配置,从而达到控制目的 。
七,流加与液位的检测与控制
1,流量检测与控制高密度细胞连续培养过程中,必须对培养基流量及液位进行精确控制 。 较大范围的流加速率变化,可降低细胞活性 。 液位变化可影响液体的流动方式及氧传递速率 。
通过蠕动泵或其它无计量泵不能对流加液体进行有效控制，可用一组节点控制环和电子流量计来补偿。用磁感应或热电原理检测流量，还没有流量范围为 1～ 5 L/h的装置。
对于微量流加操作，可使用自动阀，把基质容器接在电子天平上，然后与计算机偶联，来控制阀门。这非常准确，几乎类似于连续流加培养基。
2,液位检测与控制液位测定方法有多种,传统方法是使用液位传感器,它是根据电导率和电容性设计的,由反应器制造公司提供,但都受泡沫的影响 。 可使用压电传感器,分别安装在反应器顶部和底部,检测流体静力学压力,其压差对应于液位高度 。 还可用超声波装置检测液位,但取决于在反应器底部的声纳探头 。
在细胞培养过程中,由于细胞代谢的结果,细胞悬浮的摩尔渗透压浓度在增加 。 尽管可用膜渗透压计,但还没有在线检测系统 。
目前,用冰点渗透压计进行离线测量,为了稳定渗透压,
须安装蒸馏水进口系统,根据样品读数,对系统进行调节 。
八,目标产物的检测与控制生产过程中也要对细胞分泌的目标产物进行跟踪检测,这可根据目标产物的性质,采取各种免疫方法进行测定,判断细胞是否在有效地合成并积累目标蛋白质 。
动物细胞培养的产物并非 100％ 具有生物活性,它赖以糖基化完整性和蛋白酶的降解程度 。
活性影响因素：培养方式,生长时期,葡萄糖和氨离子浓度,培养液的成分和 pH,氧浓度等 。 选择适宜的生理状态与培养条件,获得修饰正确的蛋白质产物 。
影响产物的因素：非培养液成分,添加丁酸,增加渗透压,
提高比生长速率 。
思考题
（ 1）名词解释：无限细胞系，固定化培养，生长基质。
（ 2） 分析比较大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞表达系统制药的优缺点。
（ 3） 分析动物细胞培养工艺过程检测和控制的特点，如何优化过程控制？
