器官发生与体细胞胚胎发生一,器官发生
（ 一 ） 概念：离体培养的组织,细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程 。
（ 二 ） 发生方式：有两种发生方式
（ 1） 直接发生,（ 具有初生分生能力的 ） 外植体直接分化成器官的过程 。 （ 由茎尖,腋芽,
原球茎,块茎,鳞茎等器官发生 ）
（ 2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）
经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
二 ） 胚状体方式 (somatic embryo) 指由培养细胞诱导分化出具胚芽,胚根,胚轴的胚状结构,进而长成完整植株 。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1)外植体细胞脱分化 。 外植体发生细胞分裂,或进而形成愈伤组织 。 这一阶段同不定芽方式一样 。
2)胚状体形成 在植物有性生殖中,精于和卵子结合形成合子,合子进一步发育成胚 。 但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后,发生持续细胞分裂增殖,并依次经过原胚期,球形胚期,心形胚期,鱼雷形胚期和子叶期,进而成为成熟的有机体 。
我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构,称为胚状体 。
3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1)外植体细胞脱分化 。 外植体发生细胞分裂,或进而形成愈伤组织 。 这一阶段同不定芽方式一样 。
2)胚状体形成 在植物有性生殖中,精于和卵子结合形成合子,合子进一步发育成胚 。 在组织培养条件下胚状体的发育过程类似于合子胚的发育：细胞经脱分化后,发生持续细胞分裂增殖,并依次经过原胚期,球形胚期,心形胚期,鱼雷形胚期和子叶期,进而成为成熟的有机体 。 我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构,称为胚状体 。
3)胚状体再发育成完整植株 在外观上,这种方式和不定芽均有光滑,圆形突起的形状 。
胚状体与不定芽的区别胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：
①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，
从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。
②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。
③胚状体的维管组织的分布是独立的,v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。
胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，
便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。
胚状体与合子胚的比较合子胚 胚状体质量 萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源 受精卵 体细胞胚柄 有，明显 即使有也不明显形态 固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率 低 高
（三）影响体细胞胚胎发生的因素
1．生长调节物质
（ 1） 生长素类：
我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析（教程 P99），在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养基），通常所用的生长素是 2,4-D，浓度范围 0.5— 1mg/L。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作
“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）
上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养基：，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。
（ 2） 细胞分裂素类：
细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，
这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然 BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为 0.1μmol/L的玉米素却能促进这个过程，而 BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。
（ 3） 赤霉素类：
赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生,但对于许多植物而言,赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用 。
（ 4） 脱落酸：
抑制剂特别是 ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来,ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是 0.1~1μM）的 ABA用于荷兰芹属培养物时，
可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。
2,氮源氮源的形态有还原态氮（ NH4+）和氧化态氮
（ NO3— ）两种。在以 KNO3为唯一氮源（如
White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，
去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量 NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。
Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中 ( 培养基均为 White培养基 )得到以下结果：
[NH4+— 氮 ]（ M） [NO3— — 氮 ] （ M） 体 胚发生数 （ 个 /2ml）
10 40 1131± 219
0 55 19± 0.3
0 95 11.3± 4.1
从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。
三．长期培养物形态发生潜力的丧失有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力,但经过反复继代保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降,有些甚至完全损失 。 为了解释这种现象,现在有三种假说 。
1,遗传说该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，
即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。
2,生理说从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化组织的形成的实例中,不难分析,随着不断的培养继代的进行,培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变,而导致不能形态发生 。 在这种情况下,细胞虽然停止了器官和胚胎的分化,
但并不一定就丧失了这种分化能力 。 因而,在这种情况下,如果改变外部处理条件,应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复 。
3,竞争说这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者 Smith 和 Street（ 1974）的看法，在胡萝卜细胞长其连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生长素（ 2,4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；基次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上,Jones（ 1974）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，
在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，
使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。
快速繁殖与脱毒培养第一节 快速繁殖（微繁殖）
概念：所谓快速繁殖,就是得用组织培养的方法,使植物的部分器官,组织在人工控制的适宜条件下,迅速扩大培养,
并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法 。
特点：繁殖速度快；使用材料少,生产效率高,省时省工；
节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行,不受病虫害侵害 。
主要适用于 （ 1） 加速某些难繁或繁殖速度低的植物,特别是一些珍稀名贵的花卉,需要发展的濒危植物的繁殖 。 （ 2）
用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物,如油棕,猕猴桃,非洲菊等 。 （ 3） 需要去除病毒的植物 。 （ 4）
原种很少,生产上又急需推广的植物 。
快速繁殖过程快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。
1,外植体的选择 选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的,而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径 。
通过腋芽的形成来增加芽的数量时,应从带有营养芽的部分得到外植体，并注意以下问题。（ 1）外植体大小，如为一般繁殖而非脱毒繁殖，可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体。
（ 2）取材植株的生理状态对培养成败是极重要的，一般在植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，使植物保持营养生长状态，对某些需低温或高温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等，常要处理后才可剥取茎尖进行培养。（ 3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，
在一些草本植物（如菊花等）中，使用顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长较旺盛有产。（ 4）多年生的木本植物随着年龄的增加，
分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培养要困难得多，此时，常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，修剪、
保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用细胞分裂素喷洒植株的方法等。
在通过不定芽途径使芽增殖时,可以根据不同的植物采用不同的外植体，如根、
茎、叶或花器官的各部分，在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用，
如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地生根等可用叶片，某些兰花等可以用茎尖；很多种植物，特别是单子叶植物，
可以作用花器官，如黄花菜、鸢尾等。
在使用体细胞胚胎发生途径时,常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体
2．外植体的消毒
（ 三 ） 芽的诱导及扩大化繁殖 （ 增殖 ）
这是快繁技术中最重要性一环，在这一阶段潜在的植物体体（芽或胚状体）通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条件途径在数量上得迅速增殖，由于外植体种类的不同，在增殖时可能采用的途径不同。
1,促进腋芽的形成和生长 在高等植物的每一个叶腋中通常都存在着腋芽,每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一个枝条,项端优势可抑制腋芽生长,使用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势,促进腋芽生长 。 在培养条件下,为了促使腋芽生长,
需在培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂素,有时同时可加入少量的生长素以促进腋芽的生长 （ 注意：生长素过多易导致愈伤化 ） 。 由于细胞分裂素的持续作用,腋芽生长成枝条,新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又可生长,这样反复数次就可以形成一丛嫩枝,将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的培养基上,这一过程又能重复进行,这样就可以在短时间内产生大量的芽 。 有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其项端优势也不易被打破,接种的茎尖只能长成不分枝的一根枝条,
此时可以用切段法 （ 每个切段带有一个腋芽 ） 加以繁殖 。
用促进腋芽生长的方式进行增殖时，一般速度较其它两种方法要慢些，但每经一个流程，嫩枝就以对数速度增长，并且由于茎尖的细胞是均一的二倍体，又不易受环境条件的影响而发生变异，
所以遗传的稳定性较好，适用这种方法繁殖的植物种类也较多。
2,诱导不定芽的形成 从现存的芽之外的任何组织器官上通过器官发生行政机关后期怕芽称为不定芽 。
通过不定芽形成途径进行快繁,对于很多有贮藏器官的植物如百合,风信子等是很合适的,因为这些植物在自然条件下的营养繁殖速度一般不太快,而它的鳞片,叶基部或花梗等在培养时都容易产生不定芽或小鳞茎或小球茎等不定器官,而且这一过程常可在试管中反复进行 。
不定芽也可以在愈伤组织上上产生,但如果经过愈伤组织阶段,
特别是多次继代的愈伤组织,不但器官发生的能力会逐渐降低以至完全丧失,而且后代的遗传性不能稳定,所以在快速繁殖中除少数作物外常不使用这种方法 。
对于不定芽的形成,除特殊情况外,一般都要在培养基中同时加入适当的细胞分裂素和生长素 。
3,诱导胚状体的形成 在自然界只有少数植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体,但在培养条件下,现在已知有 30多个科,150多种植物可以产生胚状体 。 诱导胚状体时一般使用胚分生组织或生殖器官的组织作为外植体 。 在一个含有丰富还原态氮的基本培养基,在存在生长素,特别是 2,4-D时诱导胚状体的发生,
然后转移到降低浓度呀没有生长素的培养基上使胚状体成熟和生长 。
通过胚状体发生途径可以在一个委小的容器中产生比前两种增殖方法高得多的增殖速度,而且由于胚状体是两极性的可以免去诱导生根的步骤,加上它容易分散,可以减少前两种增殖方法中因分离,切割,接种所需消耗的大量人力,有利于将来实行机械化的操作 。 如果能够控制好胚状体发生和生长的同步性,诱导休眠和制造人工种子的技术无疑将是最理想的快速繁方法,但是目前除柑桔,枣椰,油棕和咖啡等少数作物外,这种方法使用并不普遍 。
这是因为很多重要的经济作物还不能诱导胚状体的发生或者产生的胚状体难以形成植株,或成苗率太低 。 另外遗传性的变异和由胚状体形成的植株的返幼 （ 多年生植物的胚状体长成的植株和实生苗一样要经过一个幼年期才能开花结果 ） 也是重要的障碍 。
（ 三 ） 根的诱导这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，
以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困难些，其中从成年树得到的材料就更困难。由于生长的嫩枝本身能全盛丰富的生长素，所以一部分植物可在无激素的培养基上生根。
1．剪下无根苗转接到生根培养基中，试管苗的生根，
对基本培养基的种类要求不严，如 MS,B5,White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除 White外，都富含
N,P,K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到 1／ 2,1／ 3或 1／ 4，甚至更低的水平。生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，
生长素浓度在 0.1-10mg/l，使用较多的是 NAA，其次为 IAA和 IBA，生长素浓度过高时容易引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养基中蔗糖的浓度降低到 1.0-
1.5%，以增强植株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根，可在培养基中加入 1%左右的活性碳，为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到 3000-
10000lux，光周期可用 24小时光照或 16小时,8小时黑暗以利于光形成建成。
2,对较难诱导生根的植物,可先半无根苗浸泡在高浓度生长素 （ 100mg/L） 的无菌水中几小时到 1天,用无菌水洗净生长素后再接种到生根培养基 。 对蔷薇科的果树如苹果,梨等,
可在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚
（ 间苯三酚 ） 以促进根的形成,浓度约 150
mg/L,但也发现对一种李树而 PG加入后反而抑制根的形成,说明 PG的刺激效应可能因基因型而不同 。
3．嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木上，
如三倍体西瓜苗接到瓠子上，在 25-30℃,饱和湿度条件下，三天伤口长出愈伤，一周可成活。
（四）移栽植物无病毒苗的培育一,病毒在植物上的危害病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的,如草莓病毒的危害,使草莓产量严重降低,品质大大退化 。
葡萄扇叶病毒使葡萄减产 l0%-18%,为害马铃薯的病虫害则更多,大约有几卜种,田此,给马铃薯生产带来严重障碍 。 花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值,其表现是花少而小,产生畸形,变色等 。
由于病毒对植物造成如此严重的危害 。 所以世界各国都开始重视这方面的研究,如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系 。 美国用组织培养法,使苹果无病毒苗已工厂化育苗,并在各国普遍开展 。
二,无病毒苗培育的意义用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。
三、脱毒的方法
（一） 热处理脱毒
1,热处理法的发现及应用热处理又称温治疗法 (theomtherapy),原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时,
组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化,在高温下,不能生成或生成病毒很少,而破坏却日趋严重,以致病毒含量不断降低,这样持续一段时间,病毒自行消灭,从而达到脱毒的目的 。
(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官,剪下的接穗或种植的材料,在 50℃ 左右的温水中浸渍
10min至数小时,方法简便易行,但易使材料受伤 。
(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好,将生长的盆栽植株移入温热治疗室
(箱 )内,一般在 35— 40℃ 。 处理时间因植物而异,短则几十分钟,长可达数月 。
热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒,
因此热处理需与其他方法配合应用,才可获得良好的效果 。
（二）茎尖培养脱毒
1,茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,
病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点 (约
0.1～ 1.0mm区域 )则几乎不含或含病毒很少,
这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度 。 在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病毒 。
茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,后代稳定,所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径 。
茎尖培养方法在进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,因而需用带有适当光源的简单解剖镜 (8— 40
倍 )。 除了在进行植物组织无菌培养一般工具外,还需要一套解剖刀 。 剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越短越好,以防茎尖变干 。 在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒 。 叶片包被严紧的芽,
如菊花,兰花,只须在 75%酒精中浸蘸一下,而叶片包被松散的芽,则要用 0.1%次氯酸钠表面消毒 10min。
将接处好的茎尖置于 22℃ 左右的温度下 。 每天以
16h 2000— 30001x的光照条件下培养 。 由于在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证 。 微茎尖需数月培养才能成功 。
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同
（三） 其他途径脱毒
1。 愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗 。
2,茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株,将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取 0.4—
1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗 。
许多化学药品 (包括嘌呤,嘧啶类似物,氨基酸,抗菌素等 )对离体组织和原生质体具有脱毒效果 。 常用的药品有：
8— 氮鸟嘌呤,2— 硫脲嘧啶,杀稻瘟抗菌素,放线菌素 D、
庆大霉素等 。 例如,将 100μg 2— 硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的 PVY(马铃薯病毒 )。
四,病毒植物的鉴定
（ 一 ） 指示植物 (indmatingplant)法利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法,
就是枯斑和空斑的测定法 。 这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物,又称鉴别寄主 。 它只能鉴定靠汁液传染的病毒 。
指示植物法最早是美国的病毒学家 Holmes 1929年发现的 。 他用感染 TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合,然后在烟叶子上摩擦 2— 3d后叶片止出现了局部坏死斑 。 在一定范围内,
枯斑与侵染性病毒的浓度成正比 。 这种方法条件简单,操作方便,
故一直沿用至今,仍为一种经济而有效的鉴定方法 。 枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出病毒的相对感染力 。
由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，
而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：
一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，
通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。
木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。
（ 二 ） 抗血清 (antisemm)鉴定法用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，
这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。
（ 三 ） 电子显微镜 (elecmc microscope)检查法由于人的眼睛难以观察小于 0.1mm的微粒,
而借助于普通光学显微镜也只能看到小至
200bm的微粒,所以只有通过电子显微镜才能分辨 0.5μm大小的病毒颗粒 。 这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒,检查出有无病毒存在,了解病毒颗粒的大小,形状和结构,又可以鉴定病毒的种类 。 这是一种较为先进的方法,
但需一定的设备和技术 。
这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒 。
（ 四 ） 酶联免疫鉴定法 (Enzyme linked
immunity absorption assay ELISA)
酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶 (过氧化物酶或碱性磷酸酶 )标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，
最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。
五,无病毒植物的利用一,无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性,它们有可能很快又被重新感染 。 所以一旦培育得到无病毒苗,就应很好地隔离与保存 。
二,无病毒苗的利用无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染 。
生产场所应隔离病毒感染途径,做好土壤消毒或防蚜等工作 。 在此种植区及种植规模小的地方,要较长时间才会感染 。 而在种植时间长,轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染 。 一旦感染,便会影响产量和质量的保证 。 因此,应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量 。
三,无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果 。 如草莓可增产 20%— 50%,植株结果多,单果重增加,上等果比例提高 。 菊花切花品种的脱毒株,表现出株高增加,
切花数增多,花朵大,切花较重等特点 。
（ 一 ） 概念：离体培养的组织,细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程 。
（ 二 ） 发生方式：有两种发生方式
（ 1） 直接发生,（ 具有初生分生能力的 ） 外植体直接分化成器官的过程 。 （ 由茎尖,腋芽,
原球茎,块茎,鳞茎等器官发生 ）
（ 2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）
经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
二 ） 胚状体方式 (somatic embryo) 指由培养细胞诱导分化出具胚芽,胚根,胚轴的胚状结构,进而长成完整植株 。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1)外植体细胞脱分化 。 外植体发生细胞分裂,或进而形成愈伤组织 。 这一阶段同不定芽方式一样 。
2)胚状体形成 在植物有性生殖中,精于和卵子结合形成合子,合子进一步发育成胚 。 但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后,发生持续细胞分裂增殖,并依次经过原胚期,球形胚期,心形胚期,鱼雷形胚期和子叶期,进而成为成熟的有机体 。
我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构,称为胚状体 。
3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1)外植体细胞脱分化 。 外植体发生细胞分裂,或进而形成愈伤组织 。 这一阶段同不定芽方式一样 。
2)胚状体形成 在植物有性生殖中,精于和卵子结合形成合子,合子进一步发育成胚 。 在组织培养条件下胚状体的发育过程类似于合子胚的发育：细胞经脱分化后,发生持续细胞分裂增殖,并依次经过原胚期,球形胚期,心形胚期,鱼雷形胚期和子叶期,进而成为成熟的有机体 。 我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构,称为胚状体 。
3)胚状体再发育成完整植株 在外观上,这种方式和不定芽均有光滑,圆形突起的形状 。
胚状体与不定芽的区别胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：
①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，
从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。
②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。
③胚状体的维管组织的分布是独立的,v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。
胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，
便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。
胚状体与合子胚的比较合子胚 胚状体质量 萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源 受精卵 体细胞胚柄 有，明显 即使有也不明显形态 固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率 低 高
（三）影响体细胞胚胎发生的因素
1．生长调节物质
（ 1） 生长素类：
我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析（教程 P99），在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养基），通常所用的生长素是 2,4-D，浓度范围 0.5— 1mg/L。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作
“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）
上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养基：，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。
（ 2） 细胞分裂素类：
细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，
这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然 BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为 0.1μmol/L的玉米素却能促进这个过程，而 BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。
（ 3） 赤霉素类：
赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生,但对于许多植物而言,赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用 。
（ 4） 脱落酸：
抑制剂特别是 ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来,ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是 0.1~1μM）的 ABA用于荷兰芹属培养物时，
可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。
2,氮源氮源的形态有还原态氮（ NH4+）和氧化态氮
（ NO3— ）两种。在以 KNO3为唯一氮源（如
White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，
去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量 NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。
Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中 ( 培养基均为 White培养基 )得到以下结果：
[NH4+— 氮 ]（ M） [NO3— — 氮 ] （ M） 体 胚发生数 （ 个 /2ml）
10 40 1131± 219
0 55 19± 0.3
0 95 11.3± 4.1
从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。
三．长期培养物形态发生潜力的丧失有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力,但经过反复继代保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降,有些甚至完全损失 。 为了解释这种现象,现在有三种假说 。
1,遗传说该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，
即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。
2,生理说从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化组织的形成的实例中,不难分析,随着不断的培养继代的进行,培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变,而导致不能形态发生 。 在这种情况下,细胞虽然停止了器官和胚胎的分化,
但并不一定就丧失了这种分化能力 。 因而,在这种情况下,如果改变外部处理条件,应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复 。
3,竞争说这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者 Smith 和 Street（ 1974）的看法，在胡萝卜细胞长其连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生长素（ 2,4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；基次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上,Jones（ 1974）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，
在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，
使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。
快速繁殖与脱毒培养第一节 快速繁殖（微繁殖）
概念：所谓快速繁殖,就是得用组织培养的方法,使植物的部分器官,组织在人工控制的适宜条件下,迅速扩大培养,
并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法 。
特点：繁殖速度快；使用材料少,生产效率高,省时省工；
节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行,不受病虫害侵害 。
主要适用于 （ 1） 加速某些难繁或繁殖速度低的植物,特别是一些珍稀名贵的花卉,需要发展的濒危植物的繁殖 。 （ 2）
用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物,如油棕,猕猴桃,非洲菊等 。 （ 3） 需要去除病毒的植物 。 （ 4）
原种很少,生产上又急需推广的植物 。
快速繁殖过程快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。
1,外植体的选择 选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的,而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径 。
通过腋芽的形成来增加芽的数量时,应从带有营养芽的部分得到外植体，并注意以下问题。（ 1）外植体大小，如为一般繁殖而非脱毒繁殖，可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体。
（ 2）取材植株的生理状态对培养成败是极重要的，一般在植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，使植物保持营养生长状态，对某些需低温或高温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等，常要处理后才可剥取茎尖进行培养。（ 3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，
在一些草本植物（如菊花等）中，使用顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长较旺盛有产。（ 4）多年生的木本植物随着年龄的增加，
分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培养要困难得多，此时，常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，修剪、
保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用细胞分裂素喷洒植株的方法等。
在通过不定芽途径使芽增殖时,可以根据不同的植物采用不同的外植体，如根、
茎、叶或花器官的各部分，在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用，
如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地生根等可用叶片，某些兰花等可以用茎尖；很多种植物，特别是单子叶植物，
可以作用花器官，如黄花菜、鸢尾等。
在使用体细胞胚胎发生途径时,常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体
2．外植体的消毒
（ 三 ） 芽的诱导及扩大化繁殖 （ 增殖 ）
这是快繁技术中最重要性一环，在这一阶段潜在的植物体体（芽或胚状体）通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条件途径在数量上得迅速增殖，由于外植体种类的不同，在增殖时可能采用的途径不同。
1,促进腋芽的形成和生长 在高等植物的每一个叶腋中通常都存在着腋芽,每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一个枝条,项端优势可抑制腋芽生长,使用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势,促进腋芽生长 。 在培养条件下,为了促使腋芽生长,
需在培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂素,有时同时可加入少量的生长素以促进腋芽的生长 （ 注意：生长素过多易导致愈伤化 ） 。 由于细胞分裂素的持续作用,腋芽生长成枝条,新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又可生长,这样反复数次就可以形成一丛嫩枝,将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的培养基上,这一过程又能重复进行,这样就可以在短时间内产生大量的芽 。 有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其项端优势也不易被打破,接种的茎尖只能长成不分枝的一根枝条,
此时可以用切段法 （ 每个切段带有一个腋芽 ） 加以繁殖 。
用促进腋芽生长的方式进行增殖时，一般速度较其它两种方法要慢些，但每经一个流程，嫩枝就以对数速度增长，并且由于茎尖的细胞是均一的二倍体，又不易受环境条件的影响而发生变异，
所以遗传的稳定性较好，适用这种方法繁殖的植物种类也较多。
2,诱导不定芽的形成 从现存的芽之外的任何组织器官上通过器官发生行政机关后期怕芽称为不定芽 。
通过不定芽形成途径进行快繁,对于很多有贮藏器官的植物如百合,风信子等是很合适的,因为这些植物在自然条件下的营养繁殖速度一般不太快,而它的鳞片,叶基部或花梗等在培养时都容易产生不定芽或小鳞茎或小球茎等不定器官,而且这一过程常可在试管中反复进行 。
不定芽也可以在愈伤组织上上产生,但如果经过愈伤组织阶段,
特别是多次继代的愈伤组织,不但器官发生的能力会逐渐降低以至完全丧失,而且后代的遗传性不能稳定,所以在快速繁殖中除少数作物外常不使用这种方法 。
对于不定芽的形成,除特殊情况外,一般都要在培养基中同时加入适当的细胞分裂素和生长素 。
3,诱导胚状体的形成 在自然界只有少数植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体,但在培养条件下,现在已知有 30多个科,150多种植物可以产生胚状体 。 诱导胚状体时一般使用胚分生组织或生殖器官的组织作为外植体 。 在一个含有丰富还原态氮的基本培养基,在存在生长素,特别是 2,4-D时诱导胚状体的发生,
然后转移到降低浓度呀没有生长素的培养基上使胚状体成熟和生长 。
通过胚状体发生途径可以在一个委小的容器中产生比前两种增殖方法高得多的增殖速度,而且由于胚状体是两极性的可以免去诱导生根的步骤,加上它容易分散,可以减少前两种增殖方法中因分离,切割,接种所需消耗的大量人力,有利于将来实行机械化的操作 。 如果能够控制好胚状体发生和生长的同步性,诱导休眠和制造人工种子的技术无疑将是最理想的快速繁方法,但是目前除柑桔,枣椰,油棕和咖啡等少数作物外,这种方法使用并不普遍 。
这是因为很多重要的经济作物还不能诱导胚状体的发生或者产生的胚状体难以形成植株,或成苗率太低 。 另外遗传性的变异和由胚状体形成的植株的返幼 （ 多年生植物的胚状体长成的植株和实生苗一样要经过一个幼年期才能开花结果 ） 也是重要的障碍 。
（ 三 ） 根的诱导这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，
以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困难些，其中从成年树得到的材料就更困难。由于生长的嫩枝本身能全盛丰富的生长素，所以一部分植物可在无激素的培养基上生根。
1．剪下无根苗转接到生根培养基中，试管苗的生根，
对基本培养基的种类要求不严，如 MS,B5,White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除 White外，都富含
N,P,K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到 1／ 2,1／ 3或 1／ 4，甚至更低的水平。生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，
生长素浓度在 0.1-10mg/l，使用较多的是 NAA，其次为 IAA和 IBA，生长素浓度过高时容易引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养基中蔗糖的浓度降低到 1.0-
1.5%，以增强植株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根，可在培养基中加入 1%左右的活性碳，为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到 3000-
10000lux，光周期可用 24小时光照或 16小时,8小时黑暗以利于光形成建成。
2,对较难诱导生根的植物,可先半无根苗浸泡在高浓度生长素 （ 100mg/L） 的无菌水中几小时到 1天,用无菌水洗净生长素后再接种到生根培养基 。 对蔷薇科的果树如苹果,梨等,
可在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚
（ 间苯三酚 ） 以促进根的形成,浓度约 150
mg/L,但也发现对一种李树而 PG加入后反而抑制根的形成,说明 PG的刺激效应可能因基因型而不同 。
3．嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木上，
如三倍体西瓜苗接到瓠子上，在 25-30℃,饱和湿度条件下，三天伤口长出愈伤，一周可成活。
（四）移栽植物无病毒苗的培育一,病毒在植物上的危害病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的,如草莓病毒的危害,使草莓产量严重降低,品质大大退化 。
葡萄扇叶病毒使葡萄减产 l0%-18%,为害马铃薯的病虫害则更多,大约有几卜种,田此,给马铃薯生产带来严重障碍 。 花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值,其表现是花少而小,产生畸形,变色等 。
由于病毒对植物造成如此严重的危害 。 所以世界各国都开始重视这方面的研究,如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系 。 美国用组织培养法,使苹果无病毒苗已工厂化育苗,并在各国普遍开展 。
二,无病毒苗培育的意义用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。
三、脱毒的方法
（一） 热处理脱毒
1,热处理法的发现及应用热处理又称温治疗法 (theomtherapy),原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时,
组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化,在高温下,不能生成或生成病毒很少,而破坏却日趋严重,以致病毒含量不断降低,这样持续一段时间,病毒自行消灭,从而达到脱毒的目的 。
(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官,剪下的接穗或种植的材料,在 50℃ 左右的温水中浸渍
10min至数小时,方法简便易行,但易使材料受伤 。
(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好,将生长的盆栽植株移入温热治疗室
(箱 )内,一般在 35— 40℃ 。 处理时间因植物而异,短则几十分钟,长可达数月 。
热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒,
因此热处理需与其他方法配合应用,才可获得良好的效果 。
（二）茎尖培养脱毒
1,茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,
病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点 (约
0.1～ 1.0mm区域 )则几乎不含或含病毒很少,
这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度 。 在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病毒 。
茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,后代稳定,所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径 。
茎尖培养方法在进行脱毒培养时,由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作,因而需用带有适当光源的简单解剖镜 (8— 40
倍 )。 除了在进行植物组织无菌培养一般工具外,还需要一套解剖刀 。 剥离茎尖时,应尽快接种,茎尖暴露的时间应当越短越好,以防茎尖变干 。 在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒 。 叶片包被严紧的芽,
如菊花,兰花,只须在 75%酒精中浸蘸一下,而叶片包被松散的芽,则要用 0.1%次氯酸钠表面消毒 10min。
将接处好的茎尖置于 22℃ 左右的温度下 。 每天以
16h 2000— 30001x的光照条件下培养 。 由于在低温和短日照下,茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证 。 微茎尖需数月培养才能成功 。
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同
（三） 其他途径脱毒
1。 愈伤组织培养脱毒通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生愈伤组织,然后从愈伤组织再分化产生芽,长成小植株,可以得到无病毒苗 。
2,茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株,将实生苗砧木在人工培养基上种植培育,再从成年无病树枝上切取 0.4—
1.0mm茎尖,在砧木上进行试管微体嫁接,以获得无病毒幼苗 。
许多化学药品 (包括嘌呤,嘧啶类似物,氨基酸,抗菌素等 )对离体组织和原生质体具有脱毒效果 。 常用的药品有：
8— 氮鸟嘌呤,2— 硫脲嘧啶,杀稻瘟抗菌素,放线菌素 D、
庆大霉素等 。 例如,将 100μg 2— 硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的 PVY(马铃薯病毒 )。
四,病毒植物的鉴定
（ 一 ） 指示植物 (indmatingplant)法利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法,
就是枯斑和空斑的测定法 。 这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物,又称鉴别寄主 。 它只能鉴定靠汁液传染的病毒 。
指示植物法最早是美国的病毒学家 Holmes 1929年发现的 。 他用感染 TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合,然后在烟叶子上摩擦 2— 3d后叶片止出现了局部坏死斑 。 在一定范围内,
枯斑与侵染性病毒的浓度成正比 。 这种方法条件简单,操作方便,
故一直沿用至今,仍为一种经济而有效的鉴定方法 。 枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度,而只能测出病毒的相对感染力 。
由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，
而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：
一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，
通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环状病斑构成。
木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。
（ 二 ） 抗血清 (antisemm)鉴定法用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，
这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。
（ 三 ） 电子显微镜 (elecmc microscope)检查法由于人的眼睛难以观察小于 0.1mm的微粒,
而借助于普通光学显微镜也只能看到小至
200bm的微粒,所以只有通过电子显微镜才能分辨 0.5μm大小的病毒颗粒 。 这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒,检查出有无病毒存在,了解病毒颗粒的大小,形状和结构,又可以鉴定病毒的种类 。 这是一种较为先进的方法,
但需一定的设备和技术 。
这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒 。
（ 四 ） 酶联免疫鉴定法 (Enzyme linked
immunity absorption assay ELISA)
酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶 (过氧化物酶或碱性磷酸酶 )标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，
最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。
五,无病毒植物的利用一,无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性,它们有可能很快又被重新感染 。 所以一旦培育得到无病毒苗,就应很好地隔离与保存 。
二,无病毒苗的利用无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染 。
生产场所应隔离病毒感染途径,做好土壤消毒或防蚜等工作 。 在此种植区及种植规模小的地方,要较长时间才会感染 。 而在种植时间长,轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染 。 一旦感染,便会影响产量和质量的保证 。 因此,应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量 。
三,无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果 。 如草莓可增产 20%— 50%,植株结果多,单果重增加,上等果比例提高 。 菊花切花品种的脱毒株,表现出株高增加,
切花数增多,花朵大,切花较重等特点 。
