Questions
A,pro萃取？
B、胞内酶的萃取？
C、包含体的 pro复性?
第 11章 双水相萃取双水相系统 (aqueous two-phase systen,ATPS)
PEG = 聚已二醇 (polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖 (dextran)
1,Pro如何分布
2、影响因素
3、应用第 11章 双水相萃取
1,ATPS相图
2,蛋白质的 分配平衡
3,影响蛋白质 m的综合因素
4,体系的选择和优化
5,Applications
1 ATPS相图双节线 (bi-nodal)：
图中的曲线 。 双节线以下的区域为均相区,
以上的区域为两相区,即 ATPS 。
系线 (tie line)：
双节线上两点的直线 。
系线 (tie line)反映的信息
A 杠杆规则,系线上各点均为分成组成相同,
而体积不同的两相 。 两相体积近似服从杠杆规则
B 性质差异,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小,
C 临界点 (critical point),当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为 1。 如 K点 。
2 蛋白质的 分配平衡
1),分配系数 m
2),m贡献因子
me,mb和 ma分别为静电,疏水和亲和作用对溶质 m的贡献,
3),静电作用电中性 pro的 m0：
式中,M,溶质分子量 ;,溶质在上下两相表面自由能的差,J/mol。
意义：
A 不受静电作用的影响 (因不带电 );
B 一般> 0，溶质 lnm随 M?而?；
C ATPS不同,同一溶质的也就不同,m随 ATPS不同而改变 。
图是不同 pro 在 pH 为各 pro 的 pI 的
ATPS中的 m,
2 蛋白质的分配平衡陶南电位 (,Donnan potential)
实际 ATPS中有电解质,当这些离子在两相中 m? 1),将两相间产生电位差
带电 pro的 m:
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,
B 由于同一 ATPS中添加不同的盐产生的不同,故 m与 Zpro的关系因盐而异。
2 蛋白质的分配平衡
4),疏水作用相间疏水因子 (HF,hydrophobic factor)
PEG/DX和 PEG/KPi等 ATPS上相 (PEG相 )
疏水性较大,相间的疏水性差用 HF表示,
HF可通过测定疏水性已知的 aa在其 pI处的 maa测算,
RH-aa相对疏水性 (relative hydrophobicity).
是通过测定 aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的 Gly 的
RH=0.所以,上式中的 B为,
mGly为 Gly分配系数,所以,pH=pL时 aa在
ATPS中的分配系数与其 RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的 HF
值,图为测定实例,
2 蛋白质的分配平衡
Pro表面疏水性 (HFS,HF of surface)
利用上 式可确定不同 ATPS的 HF值,如在 pH
= pI的 ATPS中,pro的 m0与 HF值之间呈线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白质的 HFS
图为蛋白质的 m0与 HF的实测关系图 。 图的结果示,pro的 HFS随 NaCl浓度的增大而增大 。 将盐对 pro的 HF影响上式得：
其中?HFSsalt为盐增加而引起的 HFS值增量 。
因此,m的一般形式意义：
3 影响蛋白质 m的综合因素
1),成相聚合物浓度和 M
分子量 M,若降低聚合物的 M,则 pro分配于富含该聚合物的相中 。 如
PEG/DX系统,若降低 DX的 M,则 m
减小 。 这一规律具有普遍意义 。
成相系统的总浓度,增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别 (疏水性等 )增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值 (m=1),即大于 1或小于 1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相,
.
实验结果
3 影响蛋白质 m的综合因素
1),成相聚合物浓度和 M
存在问题,当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附,这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质,
这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑 。
实验结果
3 影响蛋白质 m的综合因素
2),盐
,图为各种离子在 PEF/DX系统中的 m.
图示,HPO42-和 H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在 PEG/DX系统的 m小,因此利用 pH
> 7的磷酸盐 buffer很容易改变,使带负电 pro有较高的 m.
HFS,盐的种类和浓度影响 pro的?HFS,
从而影响 pro的 m。 当盐的浓度很大时
(如 >1mol/dm3),由于强烈的盐析,蛋白质的溶解度达到极限,表现分配系数增大,此时 m与 pro浓度有关 。 利用这一特点,通过调节 ATPS盐浓度,
可选择性萃取不同的 pro。
不良影响,改变各相中成相物质的组成和相体积比 。 如 PEG/Kpi系统中上,
下相 (或称轻重组 )的 PEG和磷钾浓度 。
3 影响蛋白质 m的综合因素
3),pH value
A (pH – pI) value pro(?Z)
lnm
3 影响蛋白质 m的综合因素
3),pH value
B 交错分配法 (cross partitioning),当加入不同种类的盐时,由于相间电位不同,lnm–pH关系曲线也不一样 。 但在 pro的 pI处,由于 Z=0,m应相同,即两条关系曲线交于一点 。 所以,通过测定不同盐类存在下
lnm–pH曲线的交点,可测定蛋白质 \细胞器以及微粒的 pI。
C pH影响磷酸盐解离,即影响 PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数 。 对某些 pro,pH的很小变化会使 m改变 2~3个数量级 。
4),T温度温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取 。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却 。 这是基于：
(1) 成相聚合物 PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性 ;
(2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离 ;
(3) 常温操作节省冷却费用,
4 体系的选择和优化
1）,体系选择的原则：
基本公式：
根据目标 pro和共存杂质的 HFS\M\pI\Z等的差别,综合利用静电,疏水和添加适当种类和浓度的盐,可选择性萃取目标产物 。
若目标产物与杂蛋白的表面疏水性 HFS相差较大,充分发挥盐析作用；
提高成相系统的浓度 (系线长度 ),增大 ATPS的 HF,也是选择性萃取的重要手段 。
改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于 PEG/盐系统的下相；采用 M较大的 PEG可降低 pro的 m,使萃取到 PEG相的 pro总量减少,从而提高目标蛋白质的选择性 。 例如,采用 6.3%PEG6000/10%Kpi系统,
可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯 12倍,而使用低分子量 PEG时,萃取的选择性降低 [17].此外,在磷酸盐存在下于 pH7的范围内调节 pH也可提高目标产物的萃取选择性,
4 体系的选择和优化在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统,双水相萃取放大容易,一般 10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模,因此,常利用多组 10ml刻度离心管,进行分配平衡实验,具体实验步骤如下,
(1) 配制一系列不同浓度,pH及离子强度的双水相,每个双水相改变一个参数,其中 pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节,
(2) 加入料液,再加水使整个系统质量达到 5~10g.离心管封口后充分混合 ;
(3) 在 1800~2000g下离心 3~5min,使两相完全分离 ;
(4) 小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上,下相中目标产物的浓度或生物活性,计算分配系数,上,下两相中目标产物的总量应与加入量对比,以检验是否存在沉淀或界面吸附现象,并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差 。
5 Applications
1),蛋白质,酶的纯化
2),多肽的分离纯化
5 Applications
3),核酸的分离纯化
5 Applications
4),病毒,细胞,细胞器的分离第 10章 反胶束萃取
1 基本术语
2 基本性质
3 反胶束的溶解作用
4 影响因素
5 方法和技术
6 应用作业
1 基本术语胶束 (micelles),向水中加入 S,水溶液的?随 [S]增大而下降 。 当 [S]达到一定值后,S缔合形成水溶性胶束,溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低 。 胶团形成均是 S分子自聚集的结果,是热力学稳定体系 。
自组装 (selfassembly),自动有序聚集的过程临界胶束浓度 (critical micelle concentration,CMC):
S在水溶剂中形成胶束的最低浓度 。
反胶束 (reverse micelles),若向有机溶剂中加入一定浓度 S,在有机溶剂中所会形成胶束 。 当形成反胶束时,水在有机相中的溶解随 [S]线性增大 。
因此,可通过测定有机相中平衡水浓度的变化,
确定形成反胶团的最低表面活性剂浓度 。
反胶束的形态,球形或近似球形,也呈柱状 。
极性核 (polar core),S分子的自组装形成了极性核 。
微水相或,水池,(water pool),反胶束内溶解的水 。
2 基本性质内水池直径 d：反胶束的大小与溶剂和 S的种类与浓度,温度,I等因素有关,一般为 5~20nm,d用下式计算：
W0-有机相中水与 S的摩尔比,又称为含水率 (water content)； M-水分子质量； asurf-界面处一个 S的面积； N-阿弗加德罗常数 。
AOT反胶团直径 dAOT,常用于制备反胶束的 S是二 -(2-已基已基 )琥珀酸酯磺酸钠,商品名为 Aerosol OT,即 AOT。 其在异辛烷中形成反胶团 dAOT:
第 1项为水核直径,第二项 (2*1.2 nm)为二倍 AOT分子长度,一般反胶团的 W0不超过 40,因此,依据上式,利用 ATO形成的水核直径一般不超过 12nm,大致可容纳一个直径为 5~10nm的 pro分子,当 pro分子比与反胶团直径相比大得多时 (如,当 M > 100~200kD),难于溶解到反胶团中,
内水的性质,当 W0较低 (如 S = AOT,W0 = 6~8)时,微水相的水分子受 S亲水基团的强烈束缚,表观粘度上升 50倍,疏水性也极高 。 随 W0的增大,
这些现象逐渐减弱,当 W0>16时,微水相的水与正常的水接近,反胶团内可形成双电层 。 但即使当 W0值很大,水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同,特别是在接近 S亲水头的区域内 。
3 反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用,
反胶团的微水池的水可溶解氨基酸,
肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存的亲水微环境,因此,反胶团萃取可用于氨基酸,肽和蛋白质等生物分子的分离纯化,
特别是蛋白质类生物大分子 。
蛋白质溶解模型：
a,水壳模型,蛋白质位于水池的中心,周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；
b,半岛模型,pro表面存在强烈疏水区,该区直接与有机相接触；
c,pro吸附于反胶团内壁；
d,pro疏水区与几个反胶团的 S疏水尾发生相互作用,被几个小反胶团所,溶解,。
3 反胶束的溶解作用溶解推动力
A 静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,
溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中,图 4.51
为 pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当
pH,即在带正电荷的
pH范围内蛋白质的溶解率接近 100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用 。
。
3 反胶束的溶解作用
B 空间相互作用盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率 W0 随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降,
如,AOT/异辛烷系统的含水率与 I-0.5成正比 。 图中 W0 与
NaCl浓度关系为,
图还示,AOT/异辛烷系统的含水率与 AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性,
3 反胶束的溶解作用在各 pro的 pI处 (排除了静电相互作用的影响 ),反胶团萃取实验研究表明,随着 M增大,pro的分配系数 (m,溶解率 )下降 。
当 M > 20KD时,m很小,表明随 M增大,空间排阻作用增大,
pro的溶解率降低,图的结果还表明,要据 pro间 M的差别可以选择性对 pro进行萃取分离 。
C 疏水性相互作用
aa的疏水性各不相同,研究表明,除 pH和 I外,aa或肽的 m随 aa
疏水性的增大而增大 [39].蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数,疏水性较大的 pro可能以,半岛式,形式溶解 。
D 分配系数 m(or K):
4 反胶束萃取的操作
A 萃取的基本方法
B 反萃取,
C 分级萃取
5 萃取的影响因素
1),pH value
AOT = 二 -(2-已基已基 )琥珀酸酯磺酸钠 。
5 萃取的影响因素
2),盐浓度盐浓度
W0
S&Pro Z
选择性
5 萃取的影响因素
3),盐离子的种类
5 萃取的影响因素
4),蛋白质分子量 M
5 萃取的影响因素
5),S
A 种类
B [S]
5 萃取的影响因素
6),助表面活性剂
6 Applications
1),蛋白质分离
6 Applications
2),胞内酶的提出
3)、蛋白质复性
3)、蛋白质复性作业：超临界萃取的基本原理与应用
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A,pro萃取？
B、胞内酶的萃取？
C、包含体的 pro复性?
第 11章 双水相萃取双水相系统 (aqueous two-phase systen,ATPS)
PEG = 聚已二醇 (polyethylene glycol)
Kpi = 磷酸钾
DX = 葡聚糖 (dextran)
1,Pro如何分布
2、影响因素
3、应用第 11章 双水相萃取
1,ATPS相图
2,蛋白质的 分配平衡
3,影响蛋白质 m的综合因素
4,体系的选择和优化
5,Applications
1 ATPS相图双节线 (bi-nodal)：
图中的曲线 。 双节线以下的区域为均相区,
以上的区域为两相区,即 ATPS 。
系线 (tie line)：
双节线上两点的直线 。
系线 (tie line)反映的信息
A 杠杆规则,系线上各点均为分成组成相同,
而体积不同的两相 。 两相体积近似服从杠杆规则
B 性质差异,系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小,
C 临界点 (critical point),当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为 1。 如 K点 。
2 蛋白质的 分配平衡
1),分配系数 m
2),m贡献因子
me,mb和 ma分别为静电,疏水和亲和作用对溶质 m的贡献,
3),静电作用电中性 pro的 m0：
式中,M,溶质分子量 ;,溶质在上下两相表面自由能的差,J/mol。
意义：
A 不受静电作用的影响 (因不带电 );
B 一般> 0，溶质 lnm随 M?而?；
C ATPS不同,同一溶质的也就不同,m随 ATPS不同而改变 。
图是不同 pro 在 pH 为各 pro 的 pI 的
ATPS中的 m,
2 蛋白质的分配平衡陶南电位 (,Donnan potential)
实际 ATPS中有电解质,当这些离子在两相中 m? 1),将两相间产生电位差
带电 pro的 m:
意义：
A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比,
B 由于同一 ATPS中添加不同的盐产生的不同,故 m与 Zpro的关系因盐而异。
2 蛋白质的分配平衡
4),疏水作用相间疏水因子 (HF,hydrophobic factor)
PEG/DX和 PEG/KPi等 ATPS上相 (PEG相 )
疏水性较大,相间的疏水性差用 HF表示,
HF可通过测定疏水性已知的 aa在其 pI处的 maa测算,
RH-aa相对疏水性 (relative hydrophobicity).
是通过测定 aa在水和已醇中溶解度的差别确定的,并设疏水性最小的 Gly 的
RH=0.所以,上式中的 B为,
mGly为 Gly分配系数,所以,pH=pL时 aa在
ATPS中的分配系数与其 RH值呈线性关系,直线的斜率就是该双水相系统的 HF
值,图为测定实例,
2 蛋白质的分配平衡
Pro表面疏水性 (HFS,HF of surface)
利用上 式可确定不同 ATPS的 HF值,如在 pH
= pI的 ATPS中,pro的 m0与 HF值之间呈线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白质的 HFS
图为蛋白质的 m0与 HF的实测关系图 。 图的结果示,pro的 HFS随 NaCl浓度的增大而增大 。 将盐对 pro的 HF影响上式得：
其中?HFSsalt为盐增加而引起的 HFS值增量 。
因此,m的一般形式意义：
3 影响蛋白质 m的综合因素
1),成相聚合物浓度和 M
分子量 M,若降低聚合物的 M,则 pro分配于富含该聚合物的相中 。 如
PEG/DX系统,若降低 DX的 M,则 m
减小 。 这一规律具有普遍意义 。
成相系统的总浓度,增大时,系统远离临界点,系线长度增加,两相性质的差别 (疏水性等 )增大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值 (m=1),即大于 1或小于 1.因此,成相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质越容易分配于其中的某一相,
.
实验结果
3 影响蛋白质 m的综合因素
1),成相聚合物浓度和 M
存在问题,当系线长度增加时,系统的表面张力增大,可能导致溶质在界面上的吸附,这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,.但对于可溶性蛋白质,
这种界面吸附现象很少发生,一般可不考虑 。
实验结果
3 影响蛋白质 m的综合因素
2),盐
,图为各种离子在 PEF/DX系统中的 m.
图示,HPO42-和 H2PO4-(H1.5PO4-1.5)离子在 PEG/DX系统的 m小,因此利用 pH
> 7的磷酸盐 buffer很容易改变,使带负电 pro有较高的 m.
HFS,盐的种类和浓度影响 pro的?HFS,
从而影响 pro的 m。 当盐的浓度很大时
(如 >1mol/dm3),由于强烈的盐析,蛋白质的溶解度达到极限,表现分配系数增大,此时 m与 pro浓度有关 。 利用这一特点,通过调节 ATPS盐浓度,
可选择性萃取不同的 pro。
不良影响,改变各相中成相物质的组成和相体积比 。 如 PEG/Kpi系统中上,
下相 (或称轻重组 )的 PEG和磷钾浓度 。
3 影响蛋白质 m的综合因素
3),pH value
A (pH – pI) value pro(?Z)
lnm
3 影响蛋白质 m的综合因素
3),pH value
B 交错分配法 (cross partitioning),当加入不同种类的盐时,由于相间电位不同,lnm–pH关系曲线也不一样 。 但在 pro的 pI处,由于 Z=0,m应相同,即两条关系曲线交于一点 。 所以,通过测定不同盐类存在下
lnm–pH曲线的交点,可测定蛋白质 \细胞器以及微粒的 pI。
C pH影响磷酸盐解离,即影响 PEG/Kpi系统的相间电位和蛋白质的分配系数 。 对某些 pro,pH的很小变化会使 m改变 2~3个数量级 。
4),T温度温度影响小,一般温度改变不影响产物的萃取 。 大规模操作一般在室温下进行,不需冷却 。 这是基于：
(1) 成相聚合物 PEG对蛋白质有稳定作用,常温下蛋白质不会发生变性 ;
(2) 常温下溶液粘度较低,容易相分离 ;
(3) 常温操作节省冷却费用,
4 体系的选择和优化
1）,体系选择的原则：
基本公式：
根据目标 pro和共存杂质的 HFS\M\pI\Z等的差别,综合利用静电,疏水和添加适当种类和浓度的盐,可选择性萃取目标产物 。
若目标产物与杂蛋白的表面疏水性 HFS相差较大,充分发挥盐析作用；
提高成相系统的浓度 (系线长度 ),增大 ATPS的 HF,也是选择性萃取的重要手段 。
改变系线长度还可以使细胞碎片选择性分配与于 PEG/盐系统的下相；采用 M较大的 PEG可降低 pro的 m,使萃取到 PEG相的 pro总量减少,从而提高目标蛋白质的选择性 。 例如,采用 6.3%PEG6000/10%Kpi系统,
可从细胞匀浆液中将半乳酸糖苷提纯 12倍,而使用低分子量 PEG时,萃取的选择性降低 [17].此外,在磷酸盐存在下于 pH7的范围内调节 pH也可提高目标产物的萃取选择性,
4 体系的选择和优化在上述理论基础上,设计合理的试验,可确定最佳萃取系统,双水相萃取放大容易,一般 10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模,因此,常利用多组 10ml刻度离心管,进行分配平衡实验,具体实验步骤如下,
(1) 配制一系列不同浓度,pH及离子强度的双水相,每个双水相改变一个参数,其中 pH通常用磷酸盐缓冲液或氨酸调节,
(2) 加入料液,再加水使整个系统质量达到 5~10g.离心管封口后充分混合 ;
(3) 在 1800~2000g下离心 3~5min,使两相完全分离 ;
(4) 小心地用吸管或移液管将上相和下相分别吸出,测定上,下相中目标产物的浓度或生物活性,计算分配系数,上,下两相中目标产物的总量应与加入量对比,以检验是否存在沉淀或界面吸附现象,并可确认浓度或活性测定中产生的系统误差 。
5 Applications
1),蛋白质,酶的纯化
2),多肽的分离纯化
5 Applications
3),核酸的分离纯化
5 Applications
4),病毒,细胞,细胞器的分离第 10章 反胶束萃取
1 基本术语
2 基本性质
3 反胶束的溶解作用
4 影响因素
5 方法和技术
6 应用作业
1 基本术语胶束 (micelles),向水中加入 S,水溶液的?随 [S]增大而下降 。 当 [S]达到一定值后,S缔合形成水溶性胶束,溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低 。 胶团形成均是 S分子自聚集的结果,是热力学稳定体系 。
自组装 (selfassembly),自动有序聚集的过程临界胶束浓度 (critical micelle concentration,CMC):
S在水溶剂中形成胶束的最低浓度 。
反胶束 (reverse micelles),若向有机溶剂中加入一定浓度 S,在有机溶剂中所会形成胶束 。 当形成反胶束时,水在有机相中的溶解随 [S]线性增大 。
因此,可通过测定有机相中平衡水浓度的变化,
确定形成反胶团的最低表面活性剂浓度 。
反胶束的形态,球形或近似球形,也呈柱状 。
极性核 (polar core),S分子的自组装形成了极性核 。
微水相或,水池,(water pool),反胶束内溶解的水 。
2 基本性质内水池直径 d：反胶束的大小与溶剂和 S的种类与浓度,温度,I等因素有关,一般为 5~20nm,d用下式计算：
W0-有机相中水与 S的摩尔比,又称为含水率 (water content)； M-水分子质量； asurf-界面处一个 S的面积； N-阿弗加德罗常数 。
AOT反胶团直径 dAOT,常用于制备反胶束的 S是二 -(2-已基已基 )琥珀酸酯磺酸钠,商品名为 Aerosol OT,即 AOT。 其在异辛烷中形成反胶团 dAOT:
第 1项为水核直径,第二项 (2*1.2 nm)为二倍 AOT分子长度,一般反胶团的 W0不超过 40,因此,依据上式,利用 ATO形成的水核直径一般不超过 12nm,大致可容纳一个直径为 5~10nm的 pro分子,当 pro分子比与反胶团直径相比大得多时 (如,当 M > 100~200kD),难于溶解到反胶团中,
内水的性质,当 W0较低 (如 S = AOT,W0 = 6~8)时,微水相的水分子受 S亲水基团的强烈束缚,表观粘度上升 50倍,疏水性也极高 。 随 W0的增大,
这些现象逐渐减弱,当 W0>16时,微水相的水与正常的水接近,反胶团内可形成双电层 。 但即使当 W0值很大,水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同,特别是在接近 S亲水头的区域内 。
3 反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用,
反胶团的微水池的水可溶解氨基酸,
肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存的亲水微环境,因此,反胶团萃取可用于氨基酸,肽和蛋白质等生物分子的分离纯化,
特别是蛋白质类生物大分子 。
蛋白质溶解模型：
a,水壳模型,蛋白质位于水池的中心,周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；
b,半岛模型,pro表面存在强烈疏水区,该区直接与有机相接触；
c,pro吸附于反胶团内壁；
d,pro疏水区与几个反胶团的 S疏水尾发生相互作用,被几个小反胶团所,溶解,。
3 反胶束的溶解作用溶解推动力
A 静电作用：
理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,
溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中,图 4.51
为 pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当
pH,即在带正电荷的
pH范围内蛋白质的溶解率接近 100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用 。
。
3 反胶束的溶解作用
B 空间相互作用盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率 W0 随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降,
如,AOT/异辛烷系统的含水率与 I-0.5成正比 。 图中 W0 与
NaCl浓度关系为,
图还示,AOT/异辛烷系统的含水率与 AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性,
3 反胶束的溶解作用在各 pro的 pI处 (排除了静电相互作用的影响 ),反胶团萃取实验研究表明,随着 M增大,pro的分配系数 (m,溶解率 )下降 。
当 M > 20KD时,m很小,表明随 M增大,空间排阻作用增大,
pro的溶解率降低,图的结果还表明,要据 pro间 M的差别可以选择性对 pro进行萃取分离 。
C 疏水性相互作用
aa的疏水性各不相同,研究表明,除 pH和 I外,aa或肽的 m随 aa
疏水性的增大而增大 [39].蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数,疏水性较大的 pro可能以,半岛式,形式溶解 。
D 分配系数 m(or K):
4 反胶束萃取的操作
A 萃取的基本方法
B 反萃取,
C 分级萃取
5 萃取的影响因素
1),pH value
AOT = 二 -(2-已基已基 )琥珀酸酯磺酸钠 。
5 萃取的影响因素
2),盐浓度盐浓度
W0
S&Pro Z
选择性
5 萃取的影响因素
3),盐离子的种类
5 萃取的影响因素
4),蛋白质分子量 M
5 萃取的影响因素
5),S
A 种类
B [S]
5 萃取的影响因素
6),助表面活性剂
6 Applications
1),蛋白质分离
6 Applications
2),胞内酶的提出
3)、蛋白质复性
3)、蛋白质复性作业：超临界萃取的基本原理与应用
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