蛋白沉淀法与饮食文化
1）、豆腐的由来：“来其”、“黎其”，汉朝淮南王刘安
2）、一人得道，鸡犬升天问题问题：
A,1941-12-7,7:59am
珍珠港事件 --- 烧伤 --- 蛋白流失，感染
B、急性肾炎 ----- 蛋白流失人血清白蛋白第十章 蛋白质 沉淀法
1、概述
2、蛋白质溶解
3、蛋白质溶液的稳定因素
4、蛋白质沉淀方法分类
5、盐析法
6,|pH水 – pI| Value调节法
7、有机溶剂沉淀法
8,亲水聚合物沉淀法
9,沉淀动力学
10,Applications
1 概述定义常用加入试剂的方法,改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度,使产物离开溶液生成不溶性颗粒,沉降析出 。 沉淀具有浓缩与分离的双重作用 。
与结晶联系在本质上都是新相析出的过程,主要是物理变化,
当然也存在化学反应的沉淀或结晶 。
区别结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出,
沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出 。
1 概述优点
A,设备简单,成本低,放大容易,产物浓度越高沉淀越有利,收率越高；
B,原料液体积很快地减小 10~50倍,从而简化生产工艺,
降低生产费用；
C,使中间产物保持在一个中性温和的环境；
D,及早地将目标 pro.从其 pro.水解酶分离出来,避免 pro降解,提高产物稳定性；
E,用沉淀法作为 pro色谱分离前处理,可使使用色谱分离的限制因素降低到最少 。
缺点：
A,沉淀物可聚集有多种物质,如大量盐类和溶剂,所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；
B,过滤较困难
2 蛋白质溶解蛋白质溶解,相似者相溶
aa的亲水性和疏水性：
有利因素,亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水 aa所占的 %等。如白蛋白不利因素,疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水 aa所占的 %等。如纤维蛋白原。
3 蛋白质溶液的稳定因素
1),水化层 (hydrationshell)
tight hydration shell(0.35g water/1g pro)
loose hydration shell(2g water /1g pro)
2),静电排斥? zeta电势
Nernst Potential—胶核表面电位 (不可测 )
Stern Potential—(不可测 )
Potential—滑面电位 (可测,mobility)
电位
Nernst电位 ionic strength
3),|pH水 – pI|Value
|pH水 – pI| Value? zeta电势?
水化层? 静电排斥?
Tight hydration shell
Protein core
Loose hydration shell
4 蛋白质沉淀方法分类
1）,盐析法
2）,有机溶剂沉淀法
3）,|pH水 – pI| Value调节法
4）,亲水聚合物沉淀法
5）,聚电解质絮凝法
6）,高价金属离子沉淀法
7）,亲和沉淀法
5 盐析法机理,A,?zeta potential； B,?hydration shell
5 盐析法计算,Cohnx经验公式式中,S为蛋白质的溶解度 (g/L)； I
为离子强度； m为盐的摩尔浓度；
β 值为蛋白质在纯水中 (I=0时 )的假想溶解度对数值,是 pH值和温度的函数,在蛋白质 pI时最小； Ks
为盐析常数,与温度和 pH值无关 。
5 盐析法方法,
A,,Ks”分级盐析法：
在一定 pH值及温度下,
改变盐浓度 （ 即 I）
达到沉淀的目的 。
B,,β”分级盐析法：
在一定 I下,改变溶液的 pH值及温度达到沉淀的目的 。
C,应用：一般的初步分离用第一种方法,
进一步纯化时用第二种方法 。
5 盐析法影响因素
A,无机盐种类感胶离子序 (Hofmeister序列 ):
In 1888,Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究 。
阴离子排序为：柠檬酸根 3- >
酒石酸根 3- >F- > IO-3 >
H2PO-4 > SO-4 > CH3COO-
> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 >
ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为,Th4+ > Al3+
> H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ >
Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ >
Na+ > Li+
如何设计实验？ 结论？
5 盐析法结论：
a 不同种类的盐主要影响 Ks；
b 离子半径小,带电多,电荷密度高,盐析效果好 。
无机盐的挑选原则：
a 较高的盐析效能；
b 高溶解度,能配置高离子强度的盐溶液；
c 溶解度受温度的影响小；
d 盐溶液的密度不高,便于蛋白质沉淀和离心分离；
e 不易引起蛋白质的变性；
f 价格低廉；
最常用 (NH4)2SO4。 优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液 pH降低,
在高 pH下产氨,腐蚀性强,有异味,有毒,终产物必须除尽 。
次常用 Na2SO4。 缺点：在 400C以下溶解度较低,主要用于热稳定蛋白 。
5 盐析法
B,无机盐添加方式
5 盐析法
C,温度 T
T影响 Cohn方程中的?值 。
T?,； T?,。
Why?
一般 …,
现在 …
5 盐析法
D,溶液 pH
pH影响 Cohnx方程中的?值 。
见图图有何用？
6 等电点沉淀法等电点沉淀法中的 pH值作用于
β值而隐含在 Cohnx公式中,
pI值通常在 pH4~6范围内变化,一般用无机酸 （ 如盐酸,
磷酸和硫酸 ） 作沉淀剂 。
在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效 。 为了提高等电点法的沉淀能力,常将其与盐析法,有机溶剂法或其他沉淀法一起使用 。
最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险 。
7 有机溶剂沉淀法同盐析一样,随着沉淀剂 ——有机溶机浓度的上升,蛋白质溶解度也呈指数规律下降 。
式中,So为当 （ K/e2）? 0
时 S的外推值； e为水 -有机溶剂混合物的介电常数；
K为常数 (水的介电常数的吸收系数 )。
7 有机溶剂沉淀法有机溶剂的种类：
丙酮 (首选 ),乙醇,甲醇 和乙腈,常用于低盐浓度下沉淀 pro。
机理：
A,有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后,会使水溶液的介电常数降低,而使 pro分子间的静电引力 （ 库仑力 ） 增大,导致凝集和沉淀 。
B,有机溶剂使 pro溶剂化,使原来与 pro结合的水被溶剂所取代,
从而降低了 pro溶解度 。 这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强,丙酮却比乙醇沉淀 pro的能力强,也解释不了丙酮,乙醇之类溶剂在所谓脱去 pro水膜的过程中容易造成 pro变性,而盐析脱水时不造成 pro变性 。
C,丙酮,乙醇等不仅是 pro的沉淀淀剂,而且还是一种变性剂,
可见作用有机溶剂使 pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联 。
7 有机溶剂沉淀法影响因素及控制
A,T：当乙醇与水混合时,会放出大量的稀释热,使溶液 T
显著升高,对不耐热的 pro影响较大 。 解决办法：搅拌,
少量多次加入,以避免温度骤然升高损失 pro活力 。 另一方面温度还会影响有机溶剂对 pro的沉淀能力,一般温度越低,沉淀越完全,所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时,温度控制在 -10?C下进行 。
B,[乙醇 ]：通常随 [乙醇 ]上升,pro溶解度下降 。 如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为 8%时达到最大,而当乙醇浓度为 40%时达到最小 。
C,pH值：在确定了 [乙醇 ]以后,pro最低溶解度出现在蛋白,
的 pI处,因此可以通过调节 pH值来选择性分离蛋白质 。
D,[pro]：避免使用很稀的浓度,因 pro在高浓度下才较稳定 。
7 有机溶剂沉淀法优点：
A,某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽,所得产品的纯度较高,
B,从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便,而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；
缺点：
A,耗用大量溶剂,而溶剂来源,贮存都比较困难麻烦；
B,且沉淀操作需在低温下进行,使用上有一定的局限性；
C,收率也比盐析法低；
D,试剂易燃,有毒 。
8 非离子型聚合物沉淀法某些聚合物,如聚乙二醇 （ PEG）,聚乙烯吡咯烷酮 （ PVP）
和葡聚糖等,具有沉淀蛋白质的作用 。 其中最常用的是
PEG,相对分子质量从 200D到 20KD的不同聚合程度的产品都是有效的,通常在蛋白质沉淀中使用 PEG-6000或
PEG-4000。
计算公式：
式中,S-溶解度； c-PEG浓度； β-常数,受溶液条件的影响 (如 pH值和离子强度 )； K-常数,由 pro大小和 PEG的类型决定 。
适应条件,上式 适用性广,但在低浓度蛋白质,如 1.5g/L和高浓度蛋白质,如 75g/L和 150g/L时,实验结果会偏离线性 。 这时方程需校正
8,非离子型聚合物沉淀法
8,非离子型聚合物沉淀法优点：
A,体系的温度只需控制在室温条件下；
B,沉淀的颗粒往往比较大,产物比较容易收集；
C,PEG非但不会使 pro变性,而且可以提高它的稳定性；
D,PEG无毒,优先使用在临床产品的加工过程中被 。
缺点：
A,PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液 -液萃取来解决；
B,价格较昂贵 。
9,沉淀动力学溶解度是一个平衡特性,但是溶解度值的降低是一个动力学过程 。 当体系变得不稳定以后,分子互相碰撞并产生聚集作用 。 通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：
A,热运动 （ Brownian运动 ） ；
B,对流运动,由机械搅拌产生；
C,差示沉降,由颗粒自由沉降速度不同造成的 。
第 A,B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用,第 ③ 种机理在沉降过程中起主导作用 (如在废水处理中 )。
异向聚集：由 Brownian运动所造成的碰撞导致 。
同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致 。
9,沉淀动力学沉淀过程步骤：
A,初始混合,蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合；
B,晶核生成,新相形成,产生极小的初始固体微粒；
C,扩散限制生长,晶核在 Brownian扩散作用下生长,生成亚微米大小的核,这一步速度很快；
D,流动引起的生长,这些核通过对流传递 （ 搅拌 ） 引起的碰撞进一步生长,产生絮体或较大的聚集体,这一步是在较低的速度下进行的 。
E,絮体的破碎,破碎取决于它们的大小,密度和机械阻力 。
F,聚集体的陈化,在陈化过程中,絮体聚得大小和阻力平衡 。
10 Applications
早在 50年前,Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经典实验的 。 他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶液,并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除,所得产品成功地救治了
1941年珍珠港空袭后的幸存者 。 除此以外,免疫球蛋白,血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的 。
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1）、豆腐的由来：“来其”、“黎其”，汉朝淮南王刘安
2）、一人得道，鸡犬升天问题问题：
A,1941-12-7,7:59am
珍珠港事件 --- 烧伤 --- 蛋白流失，感染
B、急性肾炎 ----- 蛋白流失人血清白蛋白第十章 蛋白质 沉淀法
1、概述
2、蛋白质溶解
3、蛋白质溶液的稳定因素
4、蛋白质沉淀方法分类
5、盐析法
6,|pH水 – pI| Value调节法
7、有机溶剂沉淀法
8,亲水聚合物沉淀法
9,沉淀动力学
10,Applications
1 概述定义常用加入试剂的方法,改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度,使产物离开溶液生成不溶性颗粒,沉降析出 。 沉淀具有浓缩与分离的双重作用 。
与结晶联系在本质上都是新相析出的过程,主要是物理变化,
当然也存在化学反应的沉淀或结晶 。
区别结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出,
沉淀为同类分子或离子以无规排列形式析出 。
1 概述优点
A,设备简单,成本低,放大容易,产物浓度越高沉淀越有利,收率越高；
B,原料液体积很快地减小 10~50倍,从而简化生产工艺,
降低生产费用；
C,使中间产物保持在一个中性温和的环境；
D,及早地将目标 pro.从其 pro.水解酶分离出来,避免 pro降解,提高产物稳定性；
E,用沉淀法作为 pro色谱分离前处理,可使使用色谱分离的限制因素降低到最少 。
缺点：
A,沉淀物可聚集有多种物质,如大量盐类和溶剂,所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；
B,过滤较困难
2 蛋白质溶解蛋白质溶解,相似者相溶
aa的亲水性和疏水性：
有利因素,亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水 aa所占的 %等。如白蛋白不利因素,疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水 aa所占的 %等。如纤维蛋白原。
3 蛋白质溶液的稳定因素
1),水化层 (hydrationshell)
tight hydration shell(0.35g water/1g pro)
loose hydration shell(2g water /1g pro)
2),静电排斥? zeta电势
Nernst Potential—胶核表面电位 (不可测 )
Stern Potential—(不可测 )
Potential—滑面电位 (可测,mobility)
电位
Nernst电位 ionic strength
3),|pH水 – pI|Value
|pH水 – pI| Value? zeta电势?
水化层? 静电排斥?
Tight hydration shell
Protein core
Loose hydration shell
4 蛋白质沉淀方法分类
1）,盐析法
2）,有机溶剂沉淀法
3）,|pH水 – pI| Value调节法
4）,亲水聚合物沉淀法
5）,聚电解质絮凝法
6）,高价金属离子沉淀法
7）,亲和沉淀法
5 盐析法机理,A,?zeta potential； B,?hydration shell
5 盐析法计算,Cohnx经验公式式中,S为蛋白质的溶解度 (g/L)； I
为离子强度； m为盐的摩尔浓度；
β 值为蛋白质在纯水中 (I=0时 )的假想溶解度对数值,是 pH值和温度的函数,在蛋白质 pI时最小； Ks
为盐析常数,与温度和 pH值无关 。
5 盐析法方法,
A,,Ks”分级盐析法：
在一定 pH值及温度下,
改变盐浓度 （ 即 I）
达到沉淀的目的 。
B,,β”分级盐析法：
在一定 I下,改变溶液的 pH值及温度达到沉淀的目的 。
C,应用：一般的初步分离用第一种方法,
进一步纯化时用第二种方法 。
5 盐析法影响因素
A,无机盐种类感胶离子序 (Hofmeister序列 ):
In 1888,Hofmeister对一系列盐沉淀蛋白质的能力进行了测定研究 。
阴离子排序为：柠檬酸根 3- >
酒石酸根 3- >F- > IO-3 >
H2PO-4 > SO-4 > CH3COO-
> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 >
ClO-4 > I- > CNS-;
对阳离子排序为,Th4+ > Al3+
> H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ >
Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ >
Na+ > Li+
如何设计实验？ 结论？
5 盐析法结论：
a 不同种类的盐主要影响 Ks；
b 离子半径小,带电多,电荷密度高,盐析效果好 。
无机盐的挑选原则：
a 较高的盐析效能；
b 高溶解度,能配置高离子强度的盐溶液；
c 溶解度受温度的影响小；
d 盐溶液的密度不高,便于蛋白质沉淀和离心分离；
e 不易引起蛋白质的变性；
f 价格低廉；
最常用 (NH4)2SO4。 优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液 pH降低,
在高 pH下产氨,腐蚀性强,有异味,有毒,终产物必须除尽 。
次常用 Na2SO4。 缺点：在 400C以下溶解度较低,主要用于热稳定蛋白 。
5 盐析法
B,无机盐添加方式
5 盐析法
C,温度 T
T影响 Cohn方程中的?值 。
T?,； T?,。
Why?
一般 …,
现在 …
5 盐析法
D,溶液 pH
pH影响 Cohnx方程中的?值 。
见图图有何用？
6 等电点沉淀法等电点沉淀法中的 pH值作用于
β值而隐含在 Cohnx公式中,
pI值通常在 pH4~6范围内变化,一般用无机酸 （ 如盐酸,
磷酸和硫酸 ） 作沉淀剂 。
在蛋白质疏水性比较大和结合水比较小时这种类型的沉淀更有效 。 为了提高等电点法的沉淀能力,常将其与盐析法,有机溶剂法或其他沉淀法一起使用 。
最大缺点：无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险 。
7 有机溶剂沉淀法同盐析一样,随着沉淀剂 ——有机溶机浓度的上升,蛋白质溶解度也呈指数规律下降 。
式中,So为当 （ K/e2）? 0
时 S的外推值； e为水 -有机溶剂混合物的介电常数；
K为常数 (水的介电常数的吸收系数 )。
7 有机溶剂沉淀法有机溶剂的种类：
丙酮 (首选 ),乙醇,甲醇 和乙腈,常用于低盐浓度下沉淀 pro。
机理：
A,有机溶剂沉淀法的机理是加入溶剂后,会使水溶液的介电常数降低,而使 pro分子间的静电引力 （ 库仑力 ） 增大,导致凝集和沉淀 。
B,有机溶剂使 pro溶剂化,使原来与 pro结合的水被溶剂所取代,
从而降低了 pro溶解度 。 这种理论不能说明为什么乙醇比丙酮的亲水性强,丙酮却比乙醇沉淀 pro的能力强,也解释不了丙酮,乙醇之类溶剂在所谓脱去 pro水膜的过程中容易造成 pro变性,而盐析脱水时不造成 pro变性 。
C,丙酮,乙醇等不仅是 pro的沉淀淀剂,而且还是一种变性剂,
可见作用有机溶剂使 pro在沉淀和变性之间既有区别又相关联 。
7 有机溶剂沉淀法影响因素及控制
A,T：当乙醇与水混合时,会放出大量的稀释热,使溶液 T
显著升高,对不耐热的 pro影响较大 。 解决办法：搅拌,
少量多次加入,以避免温度骤然升高损失 pro活力 。 另一方面温度还会影响有机溶剂对 pro的沉淀能力,一般温度越低,沉淀越完全,所以在乙醇沉淀人血浆蛋白时,温度控制在 -10?C下进行 。
B,[乙醇 ]：通常随 [乙醇 ]上升,pro溶解度下降 。 如血纤维蛋白原的最大溶解度在乙醇浓度为 8%时达到最大,而当乙醇浓度为 40%时达到最小 。
C,pH值：在确定了 [乙醇 ]以后,pro最低溶解度出现在蛋白,
的 pI处,因此可以通过调节 pH值来选择性分离蛋白质 。
D,[pro]：避免使用很稀的浓度,因 pro在高浓度下才较稳定 。
7 有机溶剂沉淀法优点：
A,某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽,所得产品的纯度较高,
B,从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便,而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂；
缺点：
A,耗用大量溶剂,而溶剂来源,贮存都比较困难麻烦；
B,且沉淀操作需在低温下进行,使用上有一定的局限性；
C,收率也比盐析法低；
D,试剂易燃,有毒 。
8 非离子型聚合物沉淀法某些聚合物,如聚乙二醇 （ PEG）,聚乙烯吡咯烷酮 （ PVP）
和葡聚糖等,具有沉淀蛋白质的作用 。 其中最常用的是
PEG,相对分子质量从 200D到 20KD的不同聚合程度的产品都是有效的,通常在蛋白质沉淀中使用 PEG-6000或
PEG-4000。
计算公式：
式中,S-溶解度； c-PEG浓度； β-常数,受溶液条件的影响 (如 pH值和离子强度 )； K-常数,由 pro大小和 PEG的类型决定 。
适应条件,上式 适用性广,但在低浓度蛋白质,如 1.5g/L和高浓度蛋白质,如 75g/L和 150g/L时,实验结果会偏离线性 。 这时方程需校正
8,非离子型聚合物沉淀法
8,非离子型聚合物沉淀法优点：
A,体系的温度只需控制在室温条件下；
B,沉淀的颗粒往往比较大,产物比较容易收集；
C,PEG非但不会使 pro变性,而且可以提高它的稳定性；
D,PEG无毒,优先使用在临床产品的加工过程中被 。
缺点：
A,PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去为此需用超滤和液 -液萃取来解决；
B,价格较昂贵 。
9,沉淀动力学溶解度是一个平衡特性,但是溶解度值的降低是一个动力学过程 。 当体系变得不稳定以后,分子互相碰撞并产生聚集作用 。 通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：
A,热运动 （ Brownian运动 ） ；
B,对流运动,由机械搅拌产生；
C,差示沉降,由颗粒自由沉降速度不同造成的 。
第 A,B两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用,第 ③ 种机理在沉降过程中起主导作用 (如在废水处理中 )。
异向聚集：由 Brownian运动所造成的碰撞导致 。
同向聚集：而由对流运动所造成的碰撞导致 。
9,沉淀动力学沉淀过程步骤：
A,初始混合,蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混合；
B,晶核生成,新相形成,产生极小的初始固体微粒；
C,扩散限制生长,晶核在 Brownian扩散作用下生长,生成亚微米大小的核,这一步速度很快；
D,流动引起的生长,这些核通过对流传递 （ 搅拌 ） 引起的碰撞进一步生长,产生絮体或较大的聚集体,这一步是在较低的速度下进行的 。
E,絮体的破碎,破碎取决于它们的大小,密度和机械阻力 。
F,聚集体的陈化,在陈化过程中,絮体聚得大小和阻力平衡 。
10 Applications
早在 50年前,Edwin Cohnx及其合作者就是用乙醇来完成蛋白质沉淀经典实验的 。 他们应用低温乙醇分级沉淀人血浆的办法制备了白蛋白溶液,并通过冷冻干燥将乙醇从成品中去除,所得产品成功地救治了
1941年珍珠港空袭后的幸存者 。 除此以外,免疫球蛋白,血纤维蛋白原等其他许多蛋白质都是利用上述方法进行沉淀的 。
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