考试 6
1.X,γ 射线的杀菌机理是什么？
2.氧化剂的杀菌机理是什么？
3.福尔马林的主要成分是什么？
4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓度是多少？
5.青霉素的抗菌机理是什么？
6.直接计数法的特点是什么？有哪些具体方法？
4．比浊计数法
浊 —— 细菌悬浮液的浊度
细菌不完全透光,一定范围内 菌溶液的混浊度与菌数量成 正比
（ 1）制标准曲线（ OD~No）
（ 2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量分光光度法测浊度 1 2 3 4
其他细菌计数法细菌数量 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 个 / mL
细菌数量制标准曲线菌液浊度浊度仪或 721
分光光度仪
（二）间接计数法 (活菌计数法 )
提问,前述方法中计数的不都是活菌,如何分辨菌死活？
繁殖
提问,细菌繁殖的可见现象是什么？
产生菌落 （ 固体培养基培养 ）,菌液混浊 （ 液体培养基培养 ）
计数原理,一个 细菌 可繁殖成 一个 菌落 或 一群细菌,
缺点,慢
分 固体培养法和液体培养法无菌水
1,稀释平板计数法 — 固体培养法第一步：菌样巧妙稀释
1 m L 混合 1m L 混合
9m L 10 m L
1,10
-1
10
-1
,10
-2
10
- 2
10
- 3
10
-4
10
-5
得到不同稀释度
（ 10-x）
菌液菌样被无菌水不同稀释倍率后 平板培养图
10-2 10 -3 10-4 10 -5
各取 1ml,均匀 涂布 于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合 冷却 。
第三步：培养稀 释 度过低,
菌 落 密集 无 法计数可以计数
,但数量过多,费时费力数量合适，统计计算，
作为结果数 量 太 少
,误 差 因素 太 大,
不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落
一般计数平板的细菌生长菌落数以 30~300个为宜 。
第四步,计数
细菌数量 =？
细菌数量 =数出的菌落数 /稀释度
例如,10-5稀释度时菌落数为 125个
细菌数量 =125/10-5=1.25× 107个 /mL
平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
如国标法水中 细菌总数 的测定 。
注意,作空白及取平行样 （ 2～ 3组 ） 均值减小误差平均
2.稀释液体计数法
特点,液体培养,统计学查表计数
又称 MPN法 （ 或最可能数法 ）
Most Probable Number
例如 测定 SRB（ 硫酸盐还原菌,厌氧 ） 的数量
提问,能用稀释平板法计数吗？ 为什么？
一般 不能,厌氧菌暴露在空气中不能生长 （ 除非厌氧培养箱 ）
对这类菌可以利用它们生长时产生的 硫化亚铁黑色特征 进行 深层隔氧液体培养,按 MPN法进行计数。
3 3 2 0
10 -4 10-5 10 -63 10-
10-2 10-3 10-4 10-5
（ 1）稀释
（ 2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，
恒温 37℃ 培养 14天记录变黑的试管情况
（ 3）培养
1ml
+
9ml
培养基
提问,为什么有些试管变黑有些没有？
稀释程度、取样概率
(4)统计－查表－计算
根据 不同稀释度变黑试管
① 统计出 数量指标
三 位数及其中 最低稀释度
（取 变黑的管数最多,稀释度又最低 的 生长管数,为 第一位 数字,后面两个稀释度的 生长管数 后两位数）
提问,上例情况而言统计数量是几？
② 查表
表 —— MPN表
320 10-4
MPN三管法测数统计表数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数
000 0,0 12 1 1,5 22 3 4,0 32 0 9,5
00 1 0,3 13 0 1,6 23 0 3,0 32 1 15,0
01 0 0,3 20 0 0,9 23 1 3,5 32 2 20,0
02 0 0,6 20 1 1,4 23 2 4,0 32 3 30,0
10 0 0,6 20 2 2,0 30 0 2,5 33 0 25,0
10 1 0,4 21 0 1,5 30 1 4,0 33 1 45,0
1 1 0 0,7 21 1 2,0 30 2 6,5 33 2 1 10,0
10 2 1,1 21 2 3,0 31 0 4,5 33 3 14 0,0
1 10 0,7 22 0 2,0 31 1 7,5
1 1 1 1,1 22 1 3,0 31 2 1 1,5
12 0 1,1 22 2 3,5 31 3 16,0
水中大肠菌群,铁细菌、硝化菌、亚硝化菌 也用这种方法进行数量统计。
个菌 /毫升
细菌最可能数 —— 通过其他精确的计数法，确定的各种 数量指标 时 细菌数量的最可能值上面例子中数量指标,320” 对应的细菌最可能数为 9.5个菌 /毫升,
最低稀释度为 10-4，
折算出样品中菌浓度为？ 个菌 /毫升。
3.薄膜计数法
薄膜 —— 微孔滤膜
（ φ0.45um）
（ 2）滤膜培养膜有菌面冲上
原理 —— 膜抽滤 （细菌浓缩） + 膜平板培养 +
计数滤膜,细菌不能通过支撑体,支撑滤膜抽气
（ 1） 抽滤
（滤器及膜事先灭菌）
（ 3） 统计计数
提问,假如 测出 250个菌落,抽滤了 50ml自来水,
自来水中菌浓度是多少呢？
250÷ 50ml=5个 /ml自来水
样品中的细菌数量 =菌落数 ÷ 抽滤样品的体积数
要求 —— 样品洁净
如空气或饮用水 。
？
堵孔、菌太多难以分散
提问,如何用活菌计数法测定较脏的水样？
减少滤液体积,无菌水稀释
(三 )重量法
提问：已知什么条件 通过测定细菌群体重量知道其数量？
已知 单个细菌的平均重量 除法计算
细菌的 湿 重量＝ 10-15~10-11g/个细胞
干重约为 湿重的 10％ ~20％ 。
1,干重法
方法,含菌水样在 105～ 110℃ 下进行干燥恒重 （ 本质测水中悬浮物重量 MLSS或 MLVSS） 。
悬浮物＝无机物 +有机物 （ 包括细菌 ）
提问,如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？
高温 (550℃ )灼烧
无机物化学性质稳定,高温下不会分解
提问,什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？
悬浮物中绝大多数是细菌 。
（ 1）悬浮物中绝大多数为细菌时
细胞数目 =MLSS÷ 个体细菌的平均干重量离心沉淀滤膜过滤计算
105~110 ℃
下进行干燥恒重称重或
MLSS悬浮物
（ 2）除细菌外还有大量无机悬浮物时
W
无
MLVSS挥发性悬浮物 ＝ MLSS－ W无 =细菌群体的干重量
细胞数目 = MLVSS÷ 个体细菌的平均干重量
550 ℃
下灼烧
2h
称重105~110℃ 下进行干燥恒重称重
MLSS
（ 3）有大量 非细菌有机悬浮物 时
提问,如何测定呢？
不能用重量法,应改用其他方法 。
总体来说 重量法 方法 误差较大,
一般只作为菌数粗略估算
如 活性污泥测定 （ 以重量 MLSS、
MLVSS间接表示细菌数量 ）
2.细胞含 N量法
大多数生物包括细菌,细胞内的 蛋白质氮含量比较稳定,一般为蛋白质干重 15％ ~16％,平均为 16％ 。
＊ 还需要 测定哪些条件 可以由以上比例确定 菌样 中细菌浓度？ 如何试验操作 及 计算呢？
3.DNA含量法
同种细菌的 DNA含量一致,可通过测定 DNA的含量来表示细菌的生长量
少量纯细菌培养时细菌数量的测定 。
精确性非常高,对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，
总污染物 影响促反应的方程表达式 ——
v——总污染物微生物利用速度；
V— （ KX)— 最大速度；
X— 微生物浓度
Ks－ 饱和常数
mKS
VS
Ks
劳伦斯方程忽略
KXKX
(四 )其它生理生化 指标 法提问,v指什么？
COD降解 v O2消耗 v＆ ＆ 产物产生 v
？求作试验！
提问,当你需要测定某水样中细菌数量时,你该如何选择方法？
视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取
,生,老,病,死,
（ 根据投食方式 ） 分 间歇式培养 （ 分批培养 ）,
连续式培养 两种情况
1.间歇培养
提问,如何人工进行细菌间歇培养？
只有开始时的 一次性投料和接种细菌 （ 其余时间细菌根据环境变化自行生灭 ）
二、细菌的生长特性
（“坐吃山空型”）
应用,生理特性研究、生物发酵和生物治污
（ 1）活细菌重量变化曲线曲线,群体重量 W(mg/l)—— 时间 t
细菌 内源呼吸增长率 上升 阶段 及细菌大量 死亡 阶段
mg/L 活细菌重量
t0 时间曲线 t`点切线斜率值 =?
t`重量增长速率
t`
增长率 下降 阶段生长情况用活细菌生长曲线来描述
①增长速率上升阶段
提问,为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？
A.营养物丰富,细菌增殖； B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式 储存营养物,细菌 个体重量增大增长率 生上升阶段
mg/mL
0 时间 t
活细胞重量
②增长速率下降阶段
提问,为什么增长速率 较前 下降了？
增长率 下降 阶段
mg/mL
0 时间 t
活细胞重量
营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止
代谢产物积累 对细菌的某些酶产生抑制
③内源呼吸及死亡阶段
——— 内源呼吸 +毒物浓度更高
（ 个体 ） 瘦 → 死
（ 群体 ） 死亡率大于出生率
从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降 。
提问,此时细菌的出生率是否为零呢？ 为什么？
不是,利用死亡细菌的残体营养 (“化做红泥更护花或人吃人” )
各种生物具有类似的规律
实验室通常采用细菌的 数量变化绘制生长曲线,虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途 。
1.X,γ 射线的杀菌机理是什么？
2.氧化剂的杀菌机理是什么？
3.福尔马林的主要成分是什么？
4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓度是多少？
5.青霉素的抗菌机理是什么？
6.直接计数法的特点是什么？有哪些具体方法？
4．比浊计数法
浊 —— 细菌悬浮液的浊度
细菌不完全透光,一定范围内 菌溶液的混浊度与菌数量成 正比
（ 1）制标准曲线（ OD~No）
（ 2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量分光光度法测浊度 1 2 3 4
其他细菌计数法细菌数量 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 个 / mL
细菌数量制标准曲线菌液浊度浊度仪或 721
分光光度仪
（二）间接计数法 (活菌计数法 )
提问,前述方法中计数的不都是活菌,如何分辨菌死活？
繁殖
提问,细菌繁殖的可见现象是什么？
产生菌落 （ 固体培养基培养 ）,菌液混浊 （ 液体培养基培养 ）
计数原理,一个 细菌 可繁殖成 一个 菌落 或 一群细菌,
缺点,慢
分 固体培养法和液体培养法无菌水
1,稀释平板计数法 — 固体培养法第一步：菌样巧妙稀释
1 m L 混合 1m L 混合
9m L 10 m L
1,10
-1
10
-1
,10
-2
10
- 2
10
- 3
10
-4
10
-5
得到不同稀释度
（ 10-x）
菌液菌样被无菌水不同稀释倍率后 平板培养图
10-2 10 -3 10-4 10 -5
各取 1ml,均匀 涂布 于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合 冷却 。
第三步：培养稀 释 度过低,
菌 落 密集 无 法计数可以计数
,但数量过多,费时费力数量合适，统计计算，
作为结果数 量 太 少
,误 差 因素 太 大,
不做计数第二步：接种平板每一个细菌会生成一个菌落
一般计数平板的细菌生长菌落数以 30~300个为宜 。
第四步,计数
细菌数量 =？
细菌数量 =数出的菌落数 /稀释度
例如,10-5稀释度时菌落数为 125个
细菌数量 =125/10-5=1.25× 107个 /mL
平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
如国标法水中 细菌总数 的测定 。
注意,作空白及取平行样 （ 2～ 3组 ） 均值减小误差平均
2.稀释液体计数法
特点,液体培养,统计学查表计数
又称 MPN法 （ 或最可能数法 ）
Most Probable Number
例如 测定 SRB（ 硫酸盐还原菌,厌氧 ） 的数量
提问,能用稀释平板法计数吗？ 为什么？
一般 不能,厌氧菌暴露在空气中不能生长 （ 除非厌氧培养箱 ）
对这类菌可以利用它们生长时产生的 硫化亚铁黑色特征 进行 深层隔氧液体培养,按 MPN法进行计数。
3 3 2 0
10 -4 10-5 10 -63 10-
10-2 10-3 10-4 10-5
（ 1）稀释
（ 2）稀释接种样品在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，
恒温 37℃ 培养 14天记录变黑的试管情况
（ 3）培养
1ml
+
9ml
培养基
提问,为什么有些试管变黑有些没有？
稀释程度、取样概率
(4)统计－查表－计算
根据 不同稀释度变黑试管
① 统计出 数量指标
三 位数及其中 最低稀释度
（取 变黑的管数最多,稀释度又最低 的 生长管数,为 第一位 数字,后面两个稀释度的 生长管数 后两位数）
提问,上例情况而言统计数量是几？
② 查表
表 —— MPN表
320 10-4
MPN三管法测数统计表数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数数量指标细菌最可能数
000 0,0 12 1 1,5 22 3 4,0 32 0 9,5
00 1 0,3 13 0 1,6 23 0 3,0 32 1 15,0
01 0 0,3 20 0 0,9 23 1 3,5 32 2 20,0
02 0 0,6 20 1 1,4 23 2 4,0 32 3 30,0
10 0 0,6 20 2 2,0 30 0 2,5 33 0 25,0
10 1 0,4 21 0 1,5 30 1 4,0 33 1 45,0
1 1 0 0,7 21 1 2,0 30 2 6,5 33 2 1 10,0
10 2 1,1 21 2 3,0 31 0 4,5 33 3 14 0,0
1 10 0,7 22 0 2,0 31 1 7,5
1 1 1 1,1 22 1 3,0 31 2 1 1,5
12 0 1,1 22 2 3,5 31 3 16,0
水中大肠菌群,铁细菌、硝化菌、亚硝化菌 也用这种方法进行数量统计。
个菌 /毫升
细菌最可能数 —— 通过其他精确的计数法，确定的各种 数量指标 时 细菌数量的最可能值上面例子中数量指标,320” 对应的细菌最可能数为 9.5个菌 /毫升,
最低稀释度为 10-4，
折算出样品中菌浓度为？ 个菌 /毫升。
3.薄膜计数法
薄膜 —— 微孔滤膜
（ φ0.45um）
（ 2）滤膜培养膜有菌面冲上
原理 —— 膜抽滤 （细菌浓缩） + 膜平板培养 +
计数滤膜,细菌不能通过支撑体,支撑滤膜抽气
（ 1） 抽滤
（滤器及膜事先灭菌）
（ 3） 统计计数
提问,假如 测出 250个菌落,抽滤了 50ml自来水,
自来水中菌浓度是多少呢？
250÷ 50ml=5个 /ml自来水
样品中的细菌数量 =菌落数 ÷ 抽滤样品的体积数
要求 —— 样品洁净
如空气或饮用水 。
？
堵孔、菌太多难以分散
提问,如何用活菌计数法测定较脏的水样？
减少滤液体积,无菌水稀释
(三 )重量法
提问：已知什么条件 通过测定细菌群体重量知道其数量？
已知 单个细菌的平均重量 除法计算
细菌的 湿 重量＝ 10-15~10-11g/个细胞
干重约为 湿重的 10％ ~20％ 。
1,干重法
方法,含菌水样在 105～ 110℃ 下进行干燥恒重 （ 本质测水中悬浮物重量 MLSS或 MLVSS） 。
悬浮物＝无机物 +有机物 （ 包括细菌 ）
提问,如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？
高温 (550℃ )灼烧
无机物化学性质稳定,高温下不会分解
提问,什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？
悬浮物中绝大多数是细菌 。
（ 1）悬浮物中绝大多数为细菌时
细胞数目 =MLSS÷ 个体细菌的平均干重量离心沉淀滤膜过滤计算
105~110 ℃
下进行干燥恒重称重或
MLSS悬浮物
（ 2）除细菌外还有大量无机悬浮物时
W
无
MLVSS挥发性悬浮物 ＝ MLSS－ W无 =细菌群体的干重量
细胞数目 = MLVSS÷ 个体细菌的平均干重量
550 ℃
下灼烧
2h
称重105~110℃ 下进行干燥恒重称重
MLSS
（ 3）有大量 非细菌有机悬浮物 时
提问,如何测定呢？
不能用重量法,应改用其他方法 。
总体来说 重量法 方法 误差较大,
一般只作为菌数粗略估算
如 活性污泥测定 （ 以重量 MLSS、
MLVSS间接表示细菌数量 ）
2.细胞含 N量法
大多数生物包括细菌,细胞内的 蛋白质氮含量比较稳定,一般为蛋白质干重 15％ ~16％,平均为 16％ 。
＊ 还需要 测定哪些条件 可以由以上比例确定 菌样 中细菌浓度？ 如何试验操作 及 计算呢？
3.DNA含量法
同种细菌的 DNA含量一致,可通过测定 DNA的含量来表示细菌的生长量
少量纯细菌培养时细菌数量的测定 。
精确性非常高,对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，
总污染物 影响促反应的方程表达式 ——
v——总污染物微生物利用速度；
V— （ KX)— 最大速度；
X— 微生物浓度
Ks－ 饱和常数
mKS
VS
Ks
劳伦斯方程忽略
KXKX
(四 )其它生理生化 指标 法提问,v指什么？
COD降解 v O2消耗 v＆ ＆ 产物产生 v
？求作试验！
提问,当你需要测定某水样中细菌数量时,你该如何选择方法？
视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取
,生,老,病,死,
（ 根据投食方式 ） 分 间歇式培养 （ 分批培养 ）,
连续式培养 两种情况
1.间歇培养
提问,如何人工进行细菌间歇培养？
只有开始时的 一次性投料和接种细菌 （ 其余时间细菌根据环境变化自行生灭 ）
二、细菌的生长特性
（“坐吃山空型”）
应用,生理特性研究、生物发酵和生物治污
（ 1）活细菌重量变化曲线曲线,群体重量 W(mg/l)—— 时间 t
细菌 内源呼吸增长率 上升 阶段 及细菌大量 死亡 阶段
mg/L 活细菌重量
t0 时间曲线 t`点切线斜率值 =?
t`重量增长速率
t`
增长率 下降 阶段生长情况用活细菌生长曲线来描述
①增长速率上升阶段
提问,为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？
A.营养物丰富,细菌增殖； B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式 储存营养物,细菌 个体重量增大增长率 生上升阶段
mg/mL
0 时间 t
活细胞重量
②增长速率下降阶段
提问,为什么增长速率 较前 下降了？
增长率 下降 阶段
mg/mL
0 时间 t
活细胞重量
营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止
代谢产物积累 对细菌的某些酶产生抑制
③内源呼吸及死亡阶段
——— 内源呼吸 +毒物浓度更高
（ 个体 ） 瘦 → 死
（ 群体 ） 死亡率大于出生率
从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降 。
提问,此时细菌的出生率是否为零呢？ 为什么？
不是,利用死亡细菌的残体营养 (“化做红泥更护花或人吃人” )
各种生物具有类似的规律
实验室通常采用细菌的 数量变化绘制生长曲线,虽然两种曲线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途 。
