实验通知
A.分组 ———每班以 三 人为单位分成小组，其中 两男一女 ；并从一班到三班依次每 7小组为一大组,分为 五大组 （ 下周一交名单）
B.时间 ———4.24（周六）,4.25（周日）,4.28日下午每半天一大组作试验
上午 7:30 下午 2:00开始
C.内容 ———1.显微镜介绍及基本操作； 2.细菌及其它微生物的特殊结构观察 3.微生物染色技术 4.环境中微生物
D.要求 ———写试验 预习报告,试验前检查 （ 没有不得试验 ），并 提问 （ 回答情况同样作为成绩记录 ）；
1.细菌数量生长曲线包括哪几个阶段？
2,细菌的代时 G为哪个时期的？如何测算？
3.各种废水生物处理法中微生物所处生长状态由什么决定？
4.细菌连续培养有哪些培养方式？如何测稀释率
(D)?
5.为什么恒化培养 D提高产生不同生物逐次“洗脱”
现象?
6.什么是细菌的选育？ 如何进行特殊细菌筛选？
考试 8
（ 2）细菌的驯化
①渐变－ 诱导法 (休眠的酶基因复活 +自然突变 )
方法：
待降解物通常为 有机毒物或惰性物 。
5 6 7 N
选择性培养基（ 待降解物，如石油 ）浓度升高 5 n
大一 → 大四
N
+
1
死
筛选与诱导驯化 可以同时进行
特点,操作简便,驯化的潜力有限，慢。
结果
诱变剂,温度、紫外线、核辐射、酸、碱、化学诱变剂等等 。
②突变 —诱变法
提问,哪些因素可以引起基因突变呢？
提问,基因突变的分子机制？
DNA碱基丢失,增多、错配 等
点突变 → 染色体畸变
基因突变有这样几个特点 。
A,基因突变的特点
发生 Ⅰ,随机性 结果 Ⅱ,无定向性
基因突变在哪一个细菌中发生是随机的,突变基因的部位也是随机的 。 突变的发生没有固定的方向 。
频率 Ⅲ,稀有性 可 Ⅳ,诱变性
突变率 （ 每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的 机率 ） 通常为 10-5~10-10。 十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变 。
人工诱变 可提高 10～ 105倍
Ⅵ,可逆性
修复成功
Ⅴ,稳定性
修复失败
产生的变异性状是稳定的,可遗传的 。
利用基因突变的特点,可以通过人工诱变进行细菌的基因改造 。
常用的诱变剂,紫外线,5— 溴尿嘧啶,亚硝酸,卟啶染料等 。
诱变的步骤
Ⅰ,制出发菌株的单细菌悬浮液
提问,为什么？ 如何在整个过程中尽量使细菌分散呢？
诱变剂与细菌充分接触； 向细菌培养液中加入 玻璃珠,并保持在诱变过程中始终进行振荡搅拌形成出发细菌的单细菌悬浮液 ；
B,方法
Ⅱ,选择合适的诱变剂剂量进行诱变
提问,为什么要有剂量限制呢？
少,效率低 ;过高,是药三分毒,会造成细菌大量死亡 。
例如在进行细菌紫外诱变时,通常使用 15或 20W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液 15~30cm,照射 15~20min。
Ⅲ,筛选突变出的高效菌
提问,如何筛？
选择性培养基评价
诱变法 潜力要远大于诱导法,但操作复杂 。 在实际诱变中,往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体 。 最后这些突变体将会在实验室小试,中试的基础上被投放到生产实践中 。
参见,环境微生物学技术手册,（ 图书馆 X172-6201）
通常生产上更多利用的是 诱导法 。
污泥培养初期 逐步提高污水比例,有些菌种不能适应被 淘汰 (筛选 )，能产生 诱导 酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，且能力逐步提高，使废水达到预期的排放标准；
*诱变 菌株环保市场的开发前景如何?目前国内外有哪些主要的此类公司?
③基因重组法
不同个体基因重新组合
A,形式
自发基因重组与人工基因重组
自发基因重组
a,真 核 生 物 为 杂 交 ；
精卵细胞质融合过程中 所有遗传物质的重组
b,原 核 生 物 为 转 化,转 导,接合 ；
部分遗传物质的转移和重组提问,要获取国外的某些先进技术 （部分基因） 有哪些途径？
工业间谍 （ ——地下工作者）的拿来主义引进 合作开发
细菌亦然
Ⅰ,转化 Transformation（引进）
供体细菌研碎物中的 DNA片段 直接 吸收进入活的受体细菌 并发生基因重新组合的方式 。
受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状 —,转运同化,
转化现象是 1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的,,被命名为格里菲斯实验 （ 证明 DNA是生命遗传物质的经典实验之一 ） 。
引进老鼠体内提取物培养现象活的 S Ⅲ
肺炎双球菌活的 R Ⅱ
肺炎双球菌无毒 杀死 杀死 转化现象加热杀死后的破碎细胞混合注射加热杀死后的破碎细胞格里菲斯实验无毒注射 注射
？？
1944年才通过试验找出了其中的原因。试验方法如下：
S Ⅲ型细菌光滑有毒的细胞 破裂细胞 DNA 抽提物 混合 粗糙无毒的 R Ⅱ细菌
S Ⅲ DNA 抽提物被 有些 R Ⅱ细菌混合 DNA 酶降解 的 DNA 残骸 吸收 S Ⅲ D N A
+
未变化 的 R Ⅱ细菌 少数转化成 S 细菌 R Ⅱ细菌
（ 1/ 10
6
）
+
目前发现自然状态下许多其它 细菌、放线菌、真菌和高等动植物中 都也有转化现象
。
Ⅱ,接合 （ 合作 ）
Ⅲ,转导 （间谍窃取）
间谍？
噬菌体 －细菌病毒
通过噬菌体的携带而 转 移导 手 的基因重组现象称为转导。
转导是 1951年辛德尔 (Zinder)和莱德贝尔格 (1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组 时发现的。
细菌有性生殖
LA-2
A- B+
LA-22
A+ B-
LA-2是能合成色氨酸
（ B+）但 不能 合成组氨酸 （ A-）的沙门氏伤寒杆菌指导色氨酸合成的基因 超微烧结玻璃板细菌不能通过,噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组
,转 移、
导 手”
LA-22是 合成色氨酸 （ B-）但 能合成组氨酸 （ A+）
的 沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁殖速度较慢的 温和噬菌体 P-22
不能
B.人工基因重组 — 遗传工程
遗传工程是 70年代初发展起来的生物技术 。
定义,对遗传物质进行改造 （ 人工干预下 的杂交,转化,
接合,转导 ） 的技术 。
工程,类似工程设计那样有很高的 预见性,精确性与严密性 。
a.遗传工程的方法
遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平 。 所以,又可把它 分为 细胞工程和基因工程 。
细胞工程 —— 两个细胞 原生质体 融合体 外 切 割 导 入遗 传 物 质 基 因 片 段 受 体 细 胞
基因工程 —— 两个细胞 DNA片段 剪接拼接
狭义的讲,遗传工程就是基因工程 。
原理,限制性核酸内切酶在特殊培养基上
（ 如含有青霉素 ）
筛选目的细菌质粒载体（具有 抗性基因 ）
如 抵抗青霉素长出必然是重组成功的细菌外源基因片段详见,生物化学,
有关章节
b.遗传工程在环境工程中的应用
对 特殊基因 进行,剪切－粘贴－链接,制造,超级细菌,
+ +
Ⅰ,降解石油的工程细菌
70年代美国生物学家查克捡巴蒂 (Chakrabarty)针对海洋输油,造成浮油污染,影响海洋生态等问题进行了研究 。 石油成分复杂,是由饱和,
不饱和,直链,支链,芳香 …… 烃类组成,不溶于水 。 而海水含盐量高,
虽发现 90多种微生物有不同程度降解烃类的能力,但不一定能在海水中大量繁殖生存,而且降解速率也较馒,查氏将能降解脂 (含质粒 A)的一种假单胞菌作受体细菌,分别将能降解芳烃 (质粒 B),芳烃 (质粒 C)和多环芳烃 (质粒 D)的质粒,用遗传工程方法人工转入受体细菌,获得多质粒,超级细菌,,可除去原油中 2／ 3的烃 。 浮油在一般条件下降解需一年以上时间,用,超级细菌,只需几小时即可把浮油去除,速度快效率高 。 见下图 。
接合接合接合
Ⅱ,耐汞工程菌
日本水俣事件及瑞典鸟类汞中毒事件后,日本和瑞典对汞在自然界转化做了大量研究工作,提出了汞化合物转化的途径,主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞,使人及生物中毒 。 另一面自然界中存在一些耐汞的微生物,它们的耐汞基因在质粒 R因子上 。
例如,恶臭假单胞菌 一般在超过 2ug／ ml汞浓度中即将中毒死,查克拉巴蒂用质粒转移技术,把嗜油假单胞菌的耐汞质粒 (MER质粒 )转移到恶臭假单胞菌中去,后者获得 MER质粒,可在 50~70ug／ ml氯化汞中生长 。
Ⅲ,脱色工程菌的构建
将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号 Kx和 Kd两株 假单胞菌 通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程 菌 。
基因工程方法看似简单，但在具体 实施上有较大的难度。
A.细菌的质粒本身容易丢失或转移
B.质粒具有不相容性
（ 只有在一定条件下,属于不同的不相容种群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中。）
*使用哪些方法有利于不同质粒的相容?国内那些科研院校进行基因重组工程菌的开发研究?
细菌形态
细菌生理
细菌遗传与变异第四章 其它微生物
A.分组 ———每班以 三 人为单位分成小组，其中 两男一女 ；并从一班到三班依次每 7小组为一大组,分为 五大组 （ 下周一交名单）
B.时间 ———4.24（周六）,4.25（周日）,4.28日下午每半天一大组作试验
上午 7:30 下午 2:00开始
C.内容 ———1.显微镜介绍及基本操作； 2.细菌及其它微生物的特殊结构观察 3.微生物染色技术 4.环境中微生物
D.要求 ———写试验 预习报告,试验前检查 （ 没有不得试验 ），并 提问 （ 回答情况同样作为成绩记录 ）；
1.细菌数量生长曲线包括哪几个阶段？
2,细菌的代时 G为哪个时期的？如何测算？
3.各种废水生物处理法中微生物所处生长状态由什么决定？
4.细菌连续培养有哪些培养方式？如何测稀释率
(D)?
5.为什么恒化培养 D提高产生不同生物逐次“洗脱”
现象?
6.什么是细菌的选育？ 如何进行特殊细菌筛选？
考试 8
（ 2）细菌的驯化
①渐变－ 诱导法 (休眠的酶基因复活 +自然突变 )
方法：
待降解物通常为 有机毒物或惰性物 。
5 6 7 N
选择性培养基（ 待降解物，如石油 ）浓度升高 5 n
大一 → 大四
N
+
1
死
筛选与诱导驯化 可以同时进行
特点,操作简便,驯化的潜力有限，慢。
结果
诱变剂,温度、紫外线、核辐射、酸、碱、化学诱变剂等等 。
②突变 —诱变法
提问,哪些因素可以引起基因突变呢？
提问,基因突变的分子机制？
DNA碱基丢失,增多、错配 等
点突变 → 染色体畸变
基因突变有这样几个特点 。
A,基因突变的特点
发生 Ⅰ,随机性 结果 Ⅱ,无定向性
基因突变在哪一个细菌中发生是随机的,突变基因的部位也是随机的 。 突变的发生没有固定的方向 。
频率 Ⅲ,稀有性 可 Ⅳ,诱变性
突变率 （ 每一细菌在每一世代中发生某一性状突变的 机率 ） 通常为 10-5~10-10。 十万至一百亿个细菌中才可能有一个细菌的基因发生突变 。
人工诱变 可提高 10～ 105倍
Ⅵ,可逆性
修复成功
Ⅴ,稳定性
修复失败
产生的变异性状是稳定的,可遗传的 。
利用基因突变的特点,可以通过人工诱变进行细菌的基因改造 。
常用的诱变剂,紫外线,5— 溴尿嘧啶,亚硝酸,卟啶染料等 。
诱变的步骤
Ⅰ,制出发菌株的单细菌悬浮液
提问,为什么？ 如何在整个过程中尽量使细菌分散呢？
诱变剂与细菌充分接触； 向细菌培养液中加入 玻璃珠,并保持在诱变过程中始终进行振荡搅拌形成出发细菌的单细菌悬浮液 ；
B,方法
Ⅱ,选择合适的诱变剂剂量进行诱变
提问,为什么要有剂量限制呢？
少,效率低 ;过高,是药三分毒,会造成细菌大量死亡 。
例如在进行细菌紫外诱变时,通常使用 15或 20W的紫外灯距离细菌单细菌悬浮液 15~30cm,照射 15~20min。
Ⅲ,筛选突变出的高效菌
提问,如何筛？
选择性培养基评价
诱变法 潜力要远大于诱导法,但操作复杂 。 在实际诱变中,往往要经过几次不同诱变方法的诱变处理以及大量繁琐的筛选分离工作才有可能获得理想的突变体 。 最后这些突变体将会在实验室小试,中试的基础上被投放到生产实践中 。
参见,环境微生物学技术手册,（ 图书馆 X172-6201）
通常生产上更多利用的是 诱导法 。
污泥培养初期 逐步提高污水比例,有些菌种不能适应被 淘汰 (筛选 )，能产生 诱导 酶的菌株及自发突变体中能来降解此类废水的菌种能够生存而被保留下来，且能力逐步提高，使废水达到预期的排放标准；
*诱变 菌株环保市场的开发前景如何?目前国内外有哪些主要的此类公司?
③基因重组法
不同个体基因重新组合
A,形式
自发基因重组与人工基因重组
自发基因重组
a,真 核 生 物 为 杂 交 ；
精卵细胞质融合过程中 所有遗传物质的重组
b,原 核 生 物 为 转 化,转 导,接合 ；
部分遗传物质的转移和重组提问,要获取国外的某些先进技术 （部分基因） 有哪些途径？
工业间谍 （ ——地下工作者）的拿来主义引进 合作开发
细菌亦然
Ⅰ,转化 Transformation（引进）
供体细菌研碎物中的 DNA片段 直接 吸收进入活的受体细菌 并发生基因重新组合的方式 。
受体细菌获得了供体细菌的部分遗传性状 —,转运同化,
转化现象是 1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现的,,被命名为格里菲斯实验 （ 证明 DNA是生命遗传物质的经典实验之一 ） 。
引进老鼠体内提取物培养现象活的 S Ⅲ
肺炎双球菌活的 R Ⅱ
肺炎双球菌无毒 杀死 杀死 转化现象加热杀死后的破碎细胞混合注射加热杀死后的破碎细胞格里菲斯实验无毒注射 注射
？？
1944年才通过试验找出了其中的原因。试验方法如下：
S Ⅲ型细菌光滑有毒的细胞 破裂细胞 DNA 抽提物 混合 粗糙无毒的 R Ⅱ细菌
S Ⅲ DNA 抽提物被 有些 R Ⅱ细菌混合 DNA 酶降解 的 DNA 残骸 吸收 S Ⅲ D N A
+
未变化 的 R Ⅱ细菌 少数转化成 S 细菌 R Ⅱ细菌
（ 1/ 10
6
）
+
目前发现自然状态下许多其它 细菌、放线菌、真菌和高等动植物中 都也有转化现象
。
Ⅱ,接合 （ 合作 ）
Ⅲ,转导 （间谍窃取）
间谍？
噬菌体 －细菌病毒
通过噬菌体的携带而 转 移导 手 的基因重组现象称为转导。
转导是 1951年辛德尔 (Zinder)和莱德贝尔格 (1Jederberg)在研究鼠沙门氏伤寒杆菌重组 时发现的。
细菌有性生殖
LA-2
A- B+
LA-22
A+ B-
LA-2是能合成色氨酸
（ B+）但 不能 合成组氨酸 （ A-）的沙门氏伤寒杆菌指导色氨酸合成的基因 超微烧结玻璃板细菌不能通过,噬菌体可以通过转导能合成色氨酸间谍侵入、重组
,转 移、
导 手”
LA-22是 合成色氨酸 （ B-）但 能合成组氨酸 （ A+）
的 沙门氏伤寒杆菌一些细胞中含有繁殖速度较慢的 温和噬菌体 P-22
不能
B.人工基因重组 — 遗传工程
遗传工程是 70年代初发展起来的生物技术 。
定义,对遗传物质进行改造 （ 人工干预下 的杂交,转化,
接合,转导 ） 的技术 。
工程,类似工程设计那样有很高的 预见性,精确性与严密性 。
a.遗传工程的方法
遗传工程方法包括两个水平的研究：一种是细胞水平；另一种是基因水平 。 所以,又可把它 分为 细胞工程和基因工程 。
细胞工程 —— 两个细胞 原生质体 融合体 外 切 割 导 入遗 传 物 质 基 因 片 段 受 体 细 胞
基因工程 —— 两个细胞 DNA片段 剪接拼接
狭义的讲,遗传工程就是基因工程 。
原理,限制性核酸内切酶在特殊培养基上
（ 如含有青霉素 ）
筛选目的细菌质粒载体（具有 抗性基因 ）
如 抵抗青霉素长出必然是重组成功的细菌外源基因片段详见,生物化学,
有关章节
b.遗传工程在环境工程中的应用
对 特殊基因 进行,剪切－粘贴－链接,制造,超级细菌,
+ +
Ⅰ,降解石油的工程细菌
70年代美国生物学家查克捡巴蒂 (Chakrabarty)针对海洋输油,造成浮油污染,影响海洋生态等问题进行了研究 。 石油成分复杂,是由饱和,
不饱和,直链,支链,芳香 …… 烃类组成,不溶于水 。 而海水含盐量高,
虽发现 90多种微生物有不同程度降解烃类的能力,但不一定能在海水中大量繁殖生存,而且降解速率也较馒,查氏将能降解脂 (含质粒 A)的一种假单胞菌作受体细菌,分别将能降解芳烃 (质粒 B),芳烃 (质粒 C)和多环芳烃 (质粒 D)的质粒,用遗传工程方法人工转入受体细菌,获得多质粒,超级细菌,,可除去原油中 2／ 3的烃 。 浮油在一般条件下降解需一年以上时间,用,超级细菌,只需几小时即可把浮油去除,速度快效率高 。 见下图 。
接合接合接合
Ⅱ,耐汞工程菌
日本水俣事件及瑞典鸟类汞中毒事件后,日本和瑞典对汞在自然界转化做了大量研究工作,提出了汞化合物转化的途径,主要是某些微生物使水体汞元素甲基化形成甲基汞,使人及生物中毒 。 另一面自然界中存在一些耐汞的微生物,它们的耐汞基因在质粒 R因子上 。
例如,恶臭假单胞菌 一般在超过 2ug／ ml汞浓度中即将中毒死,查克拉巴蒂用质粒转移技术,把嗜油假单胞菌的耐汞质粒 (MER质粒 )转移到恶臭假单胞菌中去,后者获得 MER质粒,可在 50~70ug／ ml氯化汞中生长 。
Ⅲ,脱色工程菌的构建
将分别含有降解偶氮染料质粒的偏号 Kx和 Kd两株 假单胞菌 通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程 菌 。
基因工程方法看似简单，但在具体 实施上有较大的难度。
A.细菌的质粒本身容易丢失或转移
B.质粒具有不相容性
（ 只有在一定条件下,属于不同的不相容种群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中。）
*使用哪些方法有利于不同质粒的相容?国内那些科研院校进行基因重组工程菌的开发研究?
细菌形态
细菌生理
细菌遗传与变异第四章 其它微生物
