生物显微技术主讲教师：倪华课程基础
细胞生物学
分子生物学
免疫学细胞大小微米 (um) 1um=1/1000毫米 (mm)
纳米 (nm) 1nm=1/1000微米 (um)
原核细胞,1— 10μm
细菌,3— 4μm
支原体,0.1μm
动物细胞,10— 100μm
第一章 显微镜显微镜发展简史
1590年前后,荷兰人 Hans父子发明了放大 10倍的原始显微镜 。
十七世纪英国物理学家虎克和意大利解剖学家马尔皮基设计了性能较好的显微镜用于植物学和医学研究 。
40年代制造出来相差显微镜 。
1932年德国人发明电子显微镜 。
1960-1962制成超高压电镜。
80年代，研制成功扫描隧道显微镜。
第一节 光学显微镜一、光学显微镜的原理与构造
成像原理光射到物体上，再从物体射入物镜、目镜，
最后射入观察者的眼睛，在此过程中成像并放大。
性能
分辨率,
放大率,
镜口率：
焦点深度：
镜像亮度：
视野亮度：
分辨率
分辨率 是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。
普通光学显微镜分辨率的极限是 0.2μm。
可把物体放大 1500倍 。
放大率
最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率 。
总放大率 =物镜放大率 × 目镜放大率显微镜的构造
光学系统
机械系统光学系统
物镜
目镜
照明装置
滤光装置物镜
分类干燥系物镜 消色差物镜油浸系物镜 复消色差物镜水浸系物镜 平场物镜
功能,a 产生物体的第一次倒立实像 。
b 放大作用目镜
分类惠更斯目镜补偿目镜平场目镜广角目镜功能,a 将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。
b 将像再放大 4-16倍。
二、常用光学显微镜
普通显微镜
相差显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜
实体显微镜莱卡倒置显微镜 尼康 E-600显微镜相差显微镜
40年代制造出来,1953年诺贝尔物理奖 。
特点,能观察无色,透明,活细胞中的细微结构 。
优点,不需要对标本进行染色,这就避免了在染色过程中由于化学作用可能引起的标本内部结构的变化 。
用途,相差显微镜可用于观察活细胞或未经染色的切片 。
暗视野显微镜
原理：暗视野显微镜的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,
因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的 。
丁道尔现象
应用：最适于观察微粒,能够观察到
0.004μm以上的微粒存在 。 还可以观察活体的存在以及活体的运动状态 。
荧光显微镜
特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；
用于观察能激发出荧光的结构。
用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
实体显微镜
用途：立体显微镜主要是用来观察不透明的物体或生物标本的外部形态。
受光源、景深和其它成像因子的影响，
放大倍率在 60倍以下,解像效果较佳。
三、显微镜的使用与维护：
从低倍镜开始。调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，为了避免物镜压在标本玻片上，可从侧面窥视。
一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。
从低倍镜转换为高倍镜。
使用油镜时将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。
调焦显微镜的维护
微调是显微镜机械装置中较精细而又容易损坏的元件，拧到了限位以后，就拧不动了。此时决不能强拧。否则，必然损坏。调焦时，遇到这样情况，应将微调退回 3~5圈，重用粗调调焦，
待初见物像后，在改用微调。
使用高倍镜观察液体标本时，一定要加盖玻片。
油镜使用后，一定要擦拭干净。
仪器出了故障，不要勉强使用。否则，可能引起更大的故障和不良后果。
第二节激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal
Microscope,LSCM
LSCM原理
用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的 3倍。
可以获得样品不同深度层次的图像，对较厚的样本进行无损伤的系列 "光学切片 "，得到其各层面的信息。这些图像信息都储于计算机内，
通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的三维立体结构。
LSCM的生物学应用
细胞的三维重建,各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、
细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析
细胞定量荧光测定
细胞内钙离子 pH值和其它离子的动态分析
细胞胞间通讯和膜的流动性第三节 电子显微镜
1932年德国人发明电子显微镜
分辨率：极限分辨率 0.2-0.25nm,为光镜的 1000
倍
透射电镜 （ transmission electron microscope ）
超高压电镜
扫描电镜（ scanning electron microscope ）
透射电镜
成像原理热阴极发射电子经聚光镜聚焦成束投射到样品,电子路径发生改变收集透射电子,形成图象透射电镜特点
必须制作超薄切片 7.5-15nm
在真空中进行观察，标本不是生活状态。
电子的穿透能力有限。
與其他分析方法比較，穿透式電子顯微鏡分析是一種破壞性分析 。
超高压电镜
优点,可观察厚的切片提高分辨率减少辐射损伤
缺点,使标本发生严重变化。
扫描电镜 原理：
扫描电镜的特点
可以观察样品表面的立体结构。
试样制备相对简单。 用于扫描电镜观察的样品一般需要经过干燥处理，确保在真空中观察不变形。另外，为了防止电子在标本上聚集，需要进行镀膜处理，使样品导电。
目前扫描电镜的分辨力为 6~10nm，扫描电镜的最大有效放大倍率为 20000X。 20-20万倍之间连续可调；
电子显微镜在生物学中的应用
目前，与电子显微镜相适应，产生了很多衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子（核酸）电镜技术、复型和冷冻蚀刻技术、
电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。
这就推进了电子显微镜对细胞超微结构和分子结构的研究。电子显微镜在 细胞超微结构研究、
病毒结构研究、生物大分子结构研究、超微病理学 研究等生命科学、生物医学等领域有广泛的应用。
当代显微镜的发展趋势
采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。
自动化与电子化。
观察体外培养细胞首选的显微镜是：
A 光镜 B 倒置相差显微镜 C 暗视野显微镜 D
实体显微镜
光镜组织切片和电镜组织切片：
A均为超薄切片 B 均用化学染料染色 C 均可制冷冻切片 D 均为固定组织
扫描电镜是主要用于观察：
A 生物膜内部结构细胞器的内部结构,B 组织和细胞的表面结构 C 细胞内的多糖 D 细胞核内的结构
激光共聚焦扫描显微镜可以观察细胞的
A 细胞内部结构 B 细胞的表面结构 C 细胞的立体结构
1982年，研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器 —— 扫描隧道显微镜（ Scanning Tunneling Microscope,以下简称
STM）。
1986年，发明者宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖原子力显微镜（ Atomic Force Microscope,AFM）
横向力显微镜（ Lateral Force Microscope,LFM）
统称为扫描探针显微镜（ Scanning Probe Microscope,SPM）。
扫描隧道显微镜 (Scanning Tunneling
Microscope,STM）
隧道效应,
当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性质，既对两导体之间的距离非常敏感，如果把距离减少 0.1纳米，隧道电流就会增大一个数量级。
STM的工作原理扫描隧道显微镜工作工作过程
我们可以把扫描隧道显微镜的工作过程总结为：利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。
1、原子级高分辨率。 STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达 0.1nm和 0.01nm。
2、可实时地得到实空间中表面的三维图像。
3、样品不受损伤，保持完好。
4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，
对生理状态下的活细胞表面结构也能进行研究。
5、扫描速度快，获取数据的时间短，成像快，有可能展开生命过程的动力学研究。
STM的优点,
1．在 STM的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差．
2,STM所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。如果在样品表面覆盖导电层，则由于导电层的粒度和均匀性等问题又限制了图象对真实表面的分辨率,
局限性,
在纳米范围内,STM已在表面科学,材料科学,生命科学等各个领域获得了广泛应用 。
真空,大气和溶液条件下的 DNA研究,球蛋白,胶原蛋白及红血球的研究等 。
STM不仅能够对样品表面进行成像,而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰 。
STM的应用液体中观察原子图象下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶表面的 STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见 。
1990年,IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用 35个惰性气体氙原子组成,IBM”三个英文字母。
科学家把碳 60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的,
这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。
DNA分子拉成的 DNA图象原子力显微镜（ Atomic Force
Microscope,AFM）
原子力显微镜同样具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体，从而弥补了 STM的不足。
STM及随后发展起来的 SPM技术是在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用的有力手段,能够获得用其它实验方法很难得到的结果,为纳米科技的诞生与发展起了根本性的推动作用 。
结 语
细胞生物学
分子生物学
免疫学细胞大小微米 (um) 1um=1/1000毫米 (mm)
纳米 (nm) 1nm=1/1000微米 (um)
原核细胞,1— 10μm
细菌,3— 4μm
支原体,0.1μm
动物细胞,10— 100μm
第一章 显微镜显微镜发展简史
1590年前后,荷兰人 Hans父子发明了放大 10倍的原始显微镜 。
十七世纪英国物理学家虎克和意大利解剖学家马尔皮基设计了性能较好的显微镜用于植物学和医学研究 。
40年代制造出来相差显微镜 。
1932年德国人发明电子显微镜 。
1960-1962制成超高压电镜。
80年代，研制成功扫描隧道显微镜。
第一节 光学显微镜一、光学显微镜的原理与构造
成像原理光射到物体上，再从物体射入物镜、目镜，
最后射入观察者的眼睛，在此过程中成像并放大。
性能
分辨率,
放大率,
镜口率：
焦点深度：
镜像亮度：
视野亮度：
分辨率
分辨率 是指能区分两个物点间最小距离的能力。两物点间的最小距离称为分辨距离。分辨距离越小，分辨率越高，也就是分辨细微结构的能力越大。
普通光学显微镜分辨率的极限是 0.2μm。
可把物体放大 1500倍 。
放大率
最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率 。
总放大率 =物镜放大率 × 目镜放大率显微镜的构造
光学系统
机械系统光学系统
物镜
目镜
照明装置
滤光装置物镜
分类干燥系物镜 消色差物镜油浸系物镜 复消色差物镜水浸系物镜 平场物镜
功能,a 产生物体的第一次倒立实像 。
b 放大作用目镜
分类惠更斯目镜补偿目镜平场目镜广角目镜功能,a 将物镜形成的倒立实像变成正立的虚像。
b 将像再放大 4-16倍。
二、常用光学显微镜
普通显微镜
相差显微镜
暗视野显微镜
荧光显微镜
实体显微镜莱卡倒置显微镜 尼康 E-600显微镜相差显微镜
40年代制造出来,1953年诺贝尔物理奖 。
特点,能观察无色,透明,活细胞中的细微结构 。
优点,不需要对标本进行染色,这就避免了在染色过程中由于化学作用可能引起的标本内部结构的变化 。
用途,相差显微镜可用于观察活细胞或未经染色的切片 。
暗视野显微镜
原理：暗视野显微镜的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,
因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的 。
丁道尔现象
应用：最适于观察微粒,能够观察到
0.004μm以上的微粒存在 。 还可以观察活体的存在以及活体的运动状态 。
荧光显微镜
特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；
用于观察能激发出荧光的结构。
用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
实体显微镜
用途：立体显微镜主要是用来观察不透明的物体或生物标本的外部形态。
受光源、景深和其它成像因子的影响，
放大倍率在 60倍以下,解像效果较佳。
三、显微镜的使用与维护：
从低倍镜开始。调焦时，先用粗动手轮将镜筒下降，为了避免物镜压在标本玻片上，可从侧面窥视。
一边从目镜中观察视野，一边利用粗动手轮将镜筒徐徐上升，待初见物像后，改用微动手轮作精细调焦，直至物像最清晰为止。
从低倍镜转换为高倍镜。
使用油镜时将镜筒升高后再转换，最后按低倍镜的调焦方法重新调焦。
调焦显微镜的维护
微调是显微镜机械装置中较精细而又容易损坏的元件，拧到了限位以后，就拧不动了。此时决不能强拧。否则，必然损坏。调焦时，遇到这样情况，应将微调退回 3~5圈，重用粗调调焦，
待初见物像后，在改用微调。
使用高倍镜观察液体标本时，一定要加盖玻片。
油镜使用后，一定要擦拭干净。
仪器出了故障，不要勉强使用。否则，可能引起更大的故障和不良后果。
第二节激光扫描共聚焦显微镜
Laser Scanning Confocal
Microscope,LSCM
LSCM原理
用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的 3倍。
可以获得样品不同深度层次的图像，对较厚的样本进行无损伤的系列 "光学切片 "，得到其各层面的信息。这些图像信息都储于计算机内，
通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的三维立体结构。
LSCM的生物学应用
细胞的三维重建,各类细胞骨架形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、
细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析
细胞定量荧光测定
细胞内钙离子 pH值和其它离子的动态分析
细胞胞间通讯和膜的流动性第三节 电子显微镜
1932年德国人发明电子显微镜
分辨率：极限分辨率 0.2-0.25nm,为光镜的 1000
倍
透射电镜 （ transmission electron microscope ）
超高压电镜
扫描电镜（ scanning electron microscope ）
透射电镜
成像原理热阴极发射电子经聚光镜聚焦成束投射到样品,电子路径发生改变收集透射电子,形成图象透射电镜特点
必须制作超薄切片 7.5-15nm
在真空中进行观察，标本不是生活状态。
电子的穿透能力有限。
與其他分析方法比較，穿透式電子顯微鏡分析是一種破壞性分析 。
超高压电镜
优点,可观察厚的切片提高分辨率减少辐射损伤
缺点,使标本发生严重变化。
扫描电镜 原理：
扫描电镜的特点
可以观察样品表面的立体结构。
试样制备相对简单。 用于扫描电镜观察的样品一般需要经过干燥处理，确保在真空中观察不变形。另外，为了防止电子在标本上聚集，需要进行镀膜处理，使样品导电。
目前扫描电镜的分辨力为 6~10nm，扫描电镜的最大有效放大倍率为 20000X。 20-20万倍之间连续可调；
电子显微镜在生物学中的应用
目前，与电子显微镜相适应，产生了很多衍生技术，如负染技术、胶体金免疫标记技术、大分子（核酸）电镜技术、复型和冷冻蚀刻技术、
电镜放射自显影技术及电镜酶细胞化学技术等。
这就推进了电子显微镜对细胞超微结构和分子结构的研究。电子显微镜在 细胞超微结构研究、
病毒结构研究、生物大分子结构研究、超微病理学 研究等生命科学、生物医学等领域有广泛的应用。
当代显微镜的发展趋势
采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、摄影装置于一体。
自动化与电子化。
观察体外培养细胞首选的显微镜是：
A 光镜 B 倒置相差显微镜 C 暗视野显微镜 D
实体显微镜
光镜组织切片和电镜组织切片：
A均为超薄切片 B 均用化学染料染色 C 均可制冷冻切片 D 均为固定组织
扫描电镜是主要用于观察：
A 生物膜内部结构细胞器的内部结构,B 组织和细胞的表面结构 C 细胞内的多糖 D 细胞核内的结构
激光共聚焦扫描显微镜可以观察细胞的
A 细胞内部结构 B 细胞的表面结构 C 细胞的立体结构
1982年，研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器 —— 扫描隧道显微镜（ Scanning Tunneling Microscope,以下简称
STM）。
1986年，发明者宾尼和罗雷尔被授予诺贝尔物理学奖原子力显微镜（ Atomic Force Microscope,AFM）
横向力显微镜（ Lateral Force Microscope,LFM）
统称为扫描探针显微镜（ Scanning Probe Microscope,SPM）。
扫描隧道显微镜 (Scanning Tunneling
Microscope,STM）
隧道效应,
当具有电位势差的两个导体之间的距离小到一定程度时，电子将存在一定的几率穿透两导体之间的势垒从一端向另一端跃迁，这种电子跃迁的现象在量子力学中被称为隧道效应，而跃迁形成的电流叫做隧道电流。隧道电流有一种特殊的性质，既对两导体之间的距离非常敏感，如果把距离减少 0.1纳米，隧道电流就会增大一个数量级。
STM的工作原理扫描隧道显微镜工作工作过程
我们可以把扫描隧道显微镜的工作过程总结为：利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。
1、原子级高分辨率。 STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达 0.1nm和 0.01nm。
2、可实时地得到实空间中表面的三维图像。
3、样品不受损伤，保持完好。
4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，
对生理状态下的活细胞表面结构也能进行研究。
5、扫描速度快，获取数据的时间短，成像快，有可能展开生命过程的动力学研究。
STM的优点,
1．在 STM的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差．
2,STM所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。如果在样品表面覆盖导电层，则由于导电层的粒度和均匀性等问题又限制了图象对真实表面的分辨率,
局限性,
在纳米范围内,STM已在表面科学,材料科学,生命科学等各个领域获得了广泛应用 。
真空,大气和溶液条件下的 DNA研究,球蛋白,胶原蛋白及红血球的研究等 。
STM不仅能够对样品表面进行成像,而且还能在纳米尺度上对材料表面进行刻蚀与修饰 。
STM的应用液体中观察原子图象下图所示的是在电解液中得到的硫酸根离子吸附在铜单晶表面的 STM图象。图中硫酸根离子吸附状态的一级和二级结构清晰可见 。
1990年,IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用 35个惰性气体氙原子组成,IBM”三个英文字母。
科学家把碳 60分子每十个一组放在铜的表面组成了世界上最小的算盘。与普通算盘不同的是，算珠不是用细杆穿起来，而是沿着铜表面的原子台阶排列的,
这是中国科学院化学所的科技人员利用纳米加工技术在石墨表面通过搬迁碳原子而绘制出的世界上最小的中国地图。
DNA分子拉成的 DNA图象原子力显微镜（ Atomic Force
Microscope,AFM）
原子力显微镜同样具有原子级的分辨率。由于原子力显微镜既可以观察导体，也可以观察非导体，从而弥补了 STM的不足。
STM及随后发展起来的 SPM技术是在纳米尺度上研究物质的特性和相互作用的有力手段,能够获得用其它实验方法很难得到的结果,为纳米科技的诞生与发展起了根本性的推动作用 。
结 语
