石蜡切片的制作石蜡切片的过程
动物的处死
动物组织取材
固定
组织固定后的处理
脱水和透明
包埋
切片一、动物的处死
麻醉
空气栓塞
颈椎脱臼或断头
股动脉放血二、动物组织取材
动物组织取材原则：
尽量保持组织的生活状态。
动作要快
不要过度用力夹捏组织，
防止组织变形。
三、固定
1、目的：
尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。
保持细胞和组织原有的形态结构，
保持组织内部成分特征不发生变化。
2、方式：浸入式灌注式灌注式
此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或 50-100ml注射器注入固定液。然后取材，
投入固定液。
灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。
达到充分固定之目的。
3、固定液
醛类固定剂
非醛类固定剂
丙酮及醇类固定剂醛类固定剂
双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。
包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛
通常与其他的试剂联合使用
优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。
缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。
非醛类固定剂
氯化汞（ HgCI2）,蛋白的强固定剂
重铬酸钾,保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。
苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，
醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。
蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。
四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与电镜观察切片的固定与染色。
丙酮及醇类固定剂
丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。
乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。
混合固定剂
固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。
4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4
成分,4%多聚甲醛溶于 1倍的磷酸缓冲液中，
1倍的磷酸缓冲液,PBS MV
NaCl 140mM 58.44
KCl 2.7mM 74.55
NaH2PO4?12H2O,10mM 358.14
KH2PO4 1.8mM 136.09
调 pH至 7.4。
Bouin’s液
苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原
37%-40%福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪
冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质固定组织时应注意：
①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。
②组织块不易过大过厚，必须小于
2cm× 1.5cm× 0.3cm,尤其是组织块厚度必须控制在 0.3cm以内。
③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织 20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。
固定时间的选择
不同的研究目的所需使用的固定液。
材料的大小，组织的特性与致密度。
温度的不同有所差别。
组织固定后的处理
冲洗或漂洗,组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。
修块,大小合适、去除形态不好的部分，
四、脱水
脱水目的,运用某种溶剂置换组织内的水分。
脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等
乙醇,最常用的脱水剂
一般组织,70%---80%----90%--100%--- 100%
特殊组织,30%--40--%--50%---60%---70%---
80%---90%--100%--- 100% 每步 30分钟左右。
要求,完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间
不能过度脱水（使组织变脆）
不同组织脱水时间不同：
大的致密的组织需要延长脱水时间
为加速各级酒精的穿透力，脱水可在 37℃ 温箱中进行。
五、透明或媒浸目的与作用
对组织的最后脱水处理
与包埋剂置换透明剂：
苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂
100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。
六、包埋包埋剂的特点：
具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。
能完全进入组织。
对组织内部成分损伤小。
石蜡包埋
石蜡特点：熔点,45-50℃ 软蜡
55-60℃ 硬蜡 常用
石蜡的处理：
新蜡应溶一次，增加密度。
并用滤纸过滤去处杂质。
加 5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
程序：在溶蜡箱中进行 55-60℃,恒温。
浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（ 1,1）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。
包块：在室温进行七 石蜡切片
载玻片处理：
切片：
展片：背面与玻片。
烘片,37℃ 的温箱内烤干 (约需 12小时 )。
优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。
缺点,是不适于较大的标本,材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。
火棉胶切片法
透明剂：乙醚与乙醇等量混合
包埋剂：火棉胶溶于透明剂
包埋：常温进行
凝固：在乙醚中过夜，
在氯仿中过夜。
在 70%乙醇中保存。
优点,可切大的组织
可切较硬的组织如硬骨
缺点：操作所用时间长
一般切片厚度为 20-30μm。
不能连续切片
全部试剂为易燃物质，注意防火冰冻切片法
取材：液氮保存
载玻片处理
切片
保存,-70℃ 或 -20℃
动物的处死
动物组织取材
固定
组织固定后的处理
脱水和透明
包埋
切片一、动物的处死
麻醉
空气栓塞
颈椎脱臼或断头
股动脉放血二、动物组织取材
动物组织取材原则：
尽量保持组织的生活状态。
动作要快
不要过度用力夹捏组织，
防止组织变形。
三、固定
1、目的：
尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。
保持细胞和组织原有的形态结构，
保持组织内部成分特征不发生变化。
2、方式：浸入式灌注式灌注式
此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或 50-100ml注射器注入固定液。然后取材，
投入固定液。
灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。
达到充分固定之目的。
3、固定液
醛类固定剂
非醛类固定剂
丙酮及醇类固定剂醛类固定剂
双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。
包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛
通常与其他的试剂联合使用
优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。
缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。
非醛类固定剂
氯化汞（ HgCI2）,蛋白的强固定剂
重铬酸钾,保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。
苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，
醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。
蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。
四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与电镜观察切片的固定与染色。
丙酮及醇类固定剂
丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。
乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。
混合固定剂
固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。
4%多聚甲醛磷酸缓冲液 pH7.4
成分,4%多聚甲醛溶于 1倍的磷酸缓冲液中，
1倍的磷酸缓冲液,PBS MV
NaCl 140mM 58.44
KCl 2.7mM 74.55
NaH2PO4?12H2O,10mM 358.14
KH2PO4 1.8mM 136.09
调 pH至 7.4。
Bouin’s液
苦味酸饱和水溶液 75ml 15 固定糖原
37%-40%福尔马林液 25ml 5 固定蛋白和脂肪
冰醋酸 5ml 1 凝固核染色质固定组织时应注意：
①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。
②组织块不易过大过厚，必须小于
2cm× 1.5cm× 0.3cm,尤其是组织块厚度必须控制在 0.3cm以内。
③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织 20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。
固定时间的选择
不同的研究目的所需使用的固定液。
材料的大小，组织的特性与致密度。
温度的不同有所差别。
组织固定后的处理
冲洗或漂洗,组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。
修块,大小合适、去除形态不好的部分，
四、脱水
脱水目的,运用某种溶剂置换组织内的水分。
脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等
乙醇,最常用的脱水剂
一般组织,70%---80%----90%--100%--- 100%
特殊组织,30%--40--%--50%---60%---70%---
80%---90%--100%--- 100% 每步 30分钟左右。
要求,完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间
不能过度脱水（使组织变脆）
不同组织脱水时间不同：
大的致密的组织需要延长脱水时间
为加速各级酒精的穿透力，脱水可在 37℃ 温箱中进行。
五、透明或媒浸目的与作用
对组织的最后脱水处理
与包埋剂置换透明剂：
苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂
100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。
六、包埋包埋剂的特点：
具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。
能完全进入组织。
对组织内部成分损伤小。
石蜡包埋
石蜡特点：熔点,45-50℃ 软蜡
55-60℃ 硬蜡 常用
石蜡的处理：
新蜡应溶一次，增加密度。
并用滤纸过滤去处杂质。
加 5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。
反复溶的旧蜡包埋效果更好。
程序：在溶蜡箱中进行 55-60℃,恒温。
浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（ 1,1）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。
包块：在室温进行七 石蜡切片
载玻片处理：
切片：
展片：背面与玻片。
烘片,37℃ 的温箱内烤干 (约需 12小时 )。
优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。
缺点,是不适于较大的标本,材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。
火棉胶切片法
透明剂：乙醚与乙醇等量混合
包埋剂：火棉胶溶于透明剂
包埋：常温进行
凝固：在乙醚中过夜，
在氯仿中过夜。
在 70%乙醇中保存。
优点,可切大的组织
可切较硬的组织如硬骨
缺点：操作所用时间长
一般切片厚度为 20-30μm。
不能连续切片
全部试剂为易燃物质，注意防火冰冻切片法
取材：液氮保存
载玻片处理
切片
保存,-70℃ 或 -20℃
