原位杂交组织化学核酸分子杂交技术固相杂交,
菌落原位杂交（ colony in situ hybridization）
斑点杂交法（ Dot blot）
Southern印迹杂交（ Southern blot）
Northern印迹杂交（ Northern blot）
组织原位杂交（ Tissue in situ hybridization）
液相杂交定义：
特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。
Detection of DNA
by nucleic acid
hybridization
分类核酸探针标记方法：
1,放射性探针,32P 3H 35S
2,非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：
1,DNA探针,单链 DNA（ Single stranded,ssDNA）和双链 DNA（ Double stranded,dsDNA）
2,cDNA探针,complementary DNA probe
3,cRNA探针,complementary RNA probe
4,寡核苷酸探针原理
探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）
探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合
检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。
优点
不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。
能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。
应用
特定的核酸序列在染色体中的精确定位。
与细胞内的 RNA杂交观察该基因的定位、定量表达。
用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。
原位杂交流程
探针的标记
取材
切片,石蜡切片 冰冻切片
杂交前预处理
杂交
杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针
探针的检测探针的标记缺刻平移法标记 DNA探针
DNA Nick translation
DNA Random primed labeling
RNA probe labeling
原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
Triton X-100
消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（ diastase）等 消化
乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。
杂交杂交的温度
Tm,能使 50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（ melting temperature,简称）。
Tm相关因素,CG含量；核酸的匹配程度；
DNA探针,Tm是 90℃,
RNA探针,Tm是 95℃ 。
甲酰胺可降低杂交 Tm,反应液中每增加 1%的甲酰胺浓度,Tm值可降低 0.72℃ 。
高盐可降低 Tm值苛刻复性温度,Ts = Tm – (10或 15℃)
非苛刻复性温度,Tns =Tm – (30或 35℃)
Tm＝ 79,8一 D十 0.584× ％ GC十 16× lg[Na＋ ]一 F× (％
formamine)一 L
D：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。 DNA,DNA 10
DNA,RNA 5
RNA,RNA 0
％ GC：杂交体中 G十 C碱基的百分比。
[Na＋ ]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。
F：是由甲酰胺引起的 Tm下降常数，在 DNA,DNA、
DNA,RNA和 RNA,RNA杂交中,F值分别为 0.65,0.5和
0.35。
(％ formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。 L用以校正双链长度对 Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。 L值可用公式计算,L＝ B／ I。其中 B
＝ 300十 2000[Na＋ ]( Na＋应为 0.05一 0.5mol),I为双链的长度，用 bp表示。
杂交的温度 时间,16－ 20小时
探针的浓度,应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度。
杂交后处理
洗涤
RNAase消化并洗涤使用地高辛标记的
RNA探针的冰冻切片的原位杂交实验准备
玻璃仪器的处理：洗液、碱过夜、自来水、
蒸馏水,180℃ 灭菌 6小时。
塑料器皿的处理,DEPC处理
药品的配制：药品专用、必要时 DEPC处理
载片的处理：清洁如玻璃仪器硅化处理：多聚赖氨酸处理探针的标记
根据被检测基因的 cDNA序列设计合成引物
RT-PCR的方法得到扩增产物
回收扩增产物克隆到质粒载体
测序
使用地高辛标记的 d-UTP应用体外转录系统转录合成标记的 RNA探针
取材,根据需要把材料切成 3-5mm的小块迅速投入，
液氮中,-70 oC保存。
切片,10μM,-70 oC保存
室温干燥 30分钟或 50oC,2min
固定,4%多聚甲醛（ pH9.5）室温固定 1小时
洗涤,1× PBS,2 × 3min
蛋白抽提,1%Tron-100，室温 20min
预杂交室温 15min,
预杂交液,5 × SSC,50%甲酰胺杂交,55 oC,16小时以上杂交液,5 × SSC
50%甲酰胺
0.02%BSA
250 μg/ml Trna
10%硫酸葡聚糖
1 μg/ml 变性探针杂交后处理：
50%甲酰胺 5 × SSC,15min × 1,55 oC
50%甲酰胺 2× SSC,30min × 1,55 oC
50%甲酰胺 0.2× SSC,30min × 2,55 oC
0.2× SSC,5min × 1，室温
Buffer1 5min × 1，室温
1% Blooking 1hr 室温
0.5% Blooking +碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体
1,5000
4 oC 过夜
Buffer1 10min × 3，室温
Buffer3 5min × 1,室温加显色液，黑暗室温静止显色。
显色液,Buffer3 中含
0.33 mg/ml NBT（ 氮蓝四唑 ）
0.165 mg/ml BCIP（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚磷酸盐 ）
2mM Levamisole
观察出现信号后，去掉显色液，甲基绿对染照相，保存。
原位杂交中注意的问题：
杂交前处理要严格避免 RNA酶的污染。
杂交前后的仪器、器皿、药品要分开使用。
杂交前使用的器皿、试剂严格处理。
杂交前操作带手套。
实验结果的判定
Northern 和 Southern印迹杂交法证明的方式
免疫组织化学检测蛋白的表达。
对照实验：
阳性对照：取阳性组织做实验
阴性实验：不加探针加 sense探针在预杂交液和杂交液中加入 sense探针课堂测验
简述应用地高辛标记的 RNA探针检测石蜡组织切片的原理和基本步骤
菌落原位杂交（ colony in situ hybridization）
斑点杂交法（ Dot blot）
Southern印迹杂交（ Southern blot）
Northern印迹杂交（ Northern blot）
组织原位杂交（ Tissue in situ hybridization）
液相杂交定义：
特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。
Detection of DNA
by nucleic acid
hybridization
分类核酸探针标记方法：
1,放射性探针,32P 3H 35S
2,非放射性探针：生物素、地高辛探针的核酸性质不同：
1,DNA探针,单链 DNA（ Single stranded,ssDNA）和双链 DNA（ Double stranded,dsDNA）
2,cDNA探针,complementary DNA probe
3,cRNA探针,complementary RNA probe
4,寡核苷酸探针原理
探针标记：同位素标记和非同位素标记的探针（生物素标记和地高辛标记）
探针与靶序列根据碱基互补配对原则特异性结合
检测标记的探针：放射自显影、荧光检测和酶法检测。
优点
不需要从组织中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列具有极高的敏感性。
能够完整的保持组织和细胞的形态，能更准确地反映组织细胞的功能状态以及功能上的相互联系。
应用
特定的核酸序列在染色体中的精确定位。
与细胞内的 RNA杂交观察该基因的定位、定量表达。
用特异性的细菌或病毒的核酸作为探针对组织或细胞进行杂交，以确定有无病原体的感染。
原位杂交流程
探针的标记
取材
切片,石蜡切片 冰冻切片
杂交前预处理
杂交
杂交后洗去未结合的及非特异性结合的探针
探针的检测探针的标记缺刻平移法标记 DNA探针
DNA Nick translation
DNA Random primed labeling
RNA probe labeling
原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
Triton X-100
消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（ diastase）等 消化
乙酰化：浸入乙酸酐和三乙醇胺中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。
杂交杂交的温度
Tm,能使 50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度（ melting temperature,简称）。
Tm相关因素,CG含量；核酸的匹配程度；
DNA探针,Tm是 90℃,
RNA探针,Tm是 95℃ 。
甲酰胺可降低杂交 Tm,反应液中每增加 1%的甲酰胺浓度,Tm值可降低 0.72℃ 。
高盐可降低 Tm值苛刻复性温度,Ts = Tm – (10或 15℃)
非苛刻复性温度,Tns =Tm – (30或 35℃)
Tm＝ 79,8一 D十 0.584× ％ GC十 16× lg[Na＋ ]一 F× (％
formamine)一 L
D：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。 DNA,DNA 10
DNA,RNA 5
RNA,RNA 0
％ GC：杂交体中 G十 C碱基的百分比。
[Na＋ ]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。
F：是由甲酰胺引起的 Tm下降常数，在 DNA,DNA、
DNA,RNA和 RNA,RNA杂交中,F值分别为 0.65,0.5和
0.35。
(％ formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。 L用以校正双链长度对 Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。 L值可用公式计算,L＝ B／ I。其中 B
＝ 300十 2000[Na＋ ]( Na＋应为 0.05一 0.5mol),I为双链的长度，用 bp表示。
杂交的温度 时间,16－ 20小时
探针的浓度,应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度。
杂交后处理
洗涤
RNAase消化并洗涤使用地高辛标记的
RNA探针的冰冻切片的原位杂交实验准备
玻璃仪器的处理：洗液、碱过夜、自来水、
蒸馏水,180℃ 灭菌 6小时。
塑料器皿的处理,DEPC处理
药品的配制：药品专用、必要时 DEPC处理
载片的处理：清洁如玻璃仪器硅化处理：多聚赖氨酸处理探针的标记
根据被检测基因的 cDNA序列设计合成引物
RT-PCR的方法得到扩增产物
回收扩增产物克隆到质粒载体
测序
使用地高辛标记的 d-UTP应用体外转录系统转录合成标记的 RNA探针
取材,根据需要把材料切成 3-5mm的小块迅速投入，
液氮中,-70 oC保存。
切片,10μM,-70 oC保存
室温干燥 30分钟或 50oC,2min
固定,4%多聚甲醛（ pH9.5）室温固定 1小时
洗涤,1× PBS,2 × 3min
蛋白抽提,1%Tron-100，室温 20min
预杂交室温 15min,
预杂交液,5 × SSC,50%甲酰胺杂交,55 oC,16小时以上杂交液,5 × SSC
50%甲酰胺
0.02%BSA
250 μg/ml Trna
10%硫酸葡聚糖
1 μg/ml 变性探针杂交后处理：
50%甲酰胺 5 × SSC,15min × 1,55 oC
50%甲酰胺 2× SSC,30min × 1,55 oC
50%甲酰胺 0.2× SSC,30min × 2,55 oC
0.2× SSC,5min × 1，室温
Buffer1 5min × 1，室温
1% Blooking 1hr 室温
0.5% Blooking +碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体
1,5000
4 oC 过夜
Buffer1 10min × 3，室温
Buffer3 5min × 1,室温加显色液，黑暗室温静止显色。
显色液,Buffer3 中含
0.33 mg/ml NBT（ 氮蓝四唑 ）
0.165 mg/ml BCIP（ 5-溴 -4-氯 -3-吲哚磷酸盐 ）
2mM Levamisole
观察出现信号后，去掉显色液，甲基绿对染照相，保存。
原位杂交中注意的问题：
杂交前处理要严格避免 RNA酶的污染。
杂交前后的仪器、器皿、药品要分开使用。
杂交前使用的器皿、试剂严格处理。
杂交前操作带手套。
实验结果的判定
Northern 和 Southern印迹杂交法证明的方式
免疫组织化学检测蛋白的表达。
对照实验：
阳性对照：取阳性组织做实验
阴性实验：不加探针加 sense探针在预杂交液和杂交液中加入 sense探针课堂测验
简述应用地高辛标记的 RNA探针检测石蜡组织切片的原理和基本步骤
