植物细胞、植物组织反应器
1959年,Tulecke和 Nickell首次将微生物培养用的发酵工艺用到高等植物的悬浮培养,此后,生物反应器在植物组织培养中的推广应用进展较为缓慢,其原因是植物组织和细胞培养比微生物培养复杂和困难得多。
虽然生物反应器技术在植物组织培养中的应用存在一定困难,应用也不尽广泛,
但其应用可大大降低劳动力需求,
而且反应器中通过物化条件调控可达到最佳的生长、分化和代谢,不受时间和地点的限制,随时随地进行规模化生产,
这为植物组织培养工业化开辟了广阔的前景。
植物组织培养涉及次级代谢产物生产、生物转化、快繁和人工种子三个方面。针对不同的植物组织培养体系和应用目的,开发适合的生物反应器类型是将生物反应器技术应用于植物组织培养的关键。
2、悬浮植物细胞培养生物反应器植物细胞比细菌大得多,直径约为 10~200?m,
具有细胞壁,培养时常呈杆状,对轴向力具有一定的耐受能力,但对剪切力敏感。在培养时当转速超过一定数值,细胞生长明显下降,并且出现死亡和破碎现象。培养过程中细胞常以团状存在,且在培养后期团状颗粒逐渐增大,过大的颗粒使团中心营养水平不足,影响其次生代谢产物的合成能力,并且团内的微环境难以控制,成团也影响了反应器中的均匀分布,使混合效果较差,尤其是在培养后期和高密度培养过程中,但一定的颗粒大小和分化又对次生代谢物的合成起促进作用。
细胞团的大小取决于培养系统的剪切力大小及其它环境因素的影响。植物细胞代谢速度慢,倍增时间长( 25~100h),需氧量小 [一般小于 0.6L/( L·min),有时供氧过多反而不利 ]。与微生物相比,在达到同样浓度时,氧传递速率要小得多。
基于对植物细胞培养特性的分析,
认为反应器的流动特性和混合效果比氧的传递更为重要。
总之,适于悬浮植物细胞培养的生物反应器要符合以下要求 ( 1)合适的氧传递,( 2)良好的流动特性,( 3)低的剪切力。
目前,应用于植物细胞培养的生物反应器可分为 3种,机械搅拌式、气动式
(鼓泡和气体喷射式)以及以上两种形式的组合型式。
机械搅拌式生物反应器在微生物培养中有广泛应用,同样也可应用于植物细胞培养。机械搅拌式反应器能够得到充分的搅拌,高密度培养时其供氧能力和混合效果要由于气动式反应器。
机械搅拌式反应器应用与植物细胞培养的最大缺点是剪切力大,对植物细胞易造成较大损伤。植物细胞对剪切力的敏感性由细胞的种类、状态、切变力耐受性、剪切速率及反应器本身的结构等多种因素决定。
机械搅拌式反应器对植物细胞的损伤性及对次级代谢产物合成的影响,人们的研究转向气动式反应。气动式反应器没有活动的搅拌装置,容易长期保持无菌操作。
气动式反应器包括两种型式:鼓泡塔和气升式环流反应器(包括内环流和外环流两种)。鼓泡塔由于混合性能差,
应用不尽理想。气升式反应器的可取之处在于其结构简单、剪切力小、传质效果好、运行成本和造价低等。
气升式反应器的缺点是低气速在高密度培养时,其混合效果较差。通气量提高会导致泡沫产生,严重影响植物细胞的生长,并且泡沫会夹带一些有用的挥发性物质,如 CO2 等,可通过加入消泡剂和对反应器内构件进行改造来克服。
为加强气升式反应器的混合效果,
近年又开发了带有低速搅拌的气升式反应器,在培养西洋参和紫草细胞时获得了较好的结果。
综合考虑,气升式反应器结构简单,
氧传递速率较高,剪切力低,并在长期的植物细胞培养过程容易保持更好的无菌操作状况,因而较传统的搅拌反应器更适于植物细胞的培养。
3、固定化植物细胞反应器自 1979年植物细胞固定化成功以来,
许多科学家在此领域进行了广泛深入的研究,使该技术有了长足的进步。固定化细胞较悬浮细胞具有较多的优点,
( 1)有利于次级代谢产物的积累;
( 2)细胞经包埋后,可以减小剪切力的损伤,有利于产物合成和分泌;
( 3)有利于进行连续培养和生物转化等。
植物细胞常用的固定化方法一般为:
凝胶包埋、表面吸附、网格及泡沫固定、
膜固定(包括中空纤维)。
适应于固定化体系培养的生物反应系统则分为:流化床生物反应器、填充床生物反应器和膜生物反应器。
流化床生物反应器,细胞包裹于胶粒、
泡沫颗粒中,通过空气培养基在反应器内的流动使固定化呈流态化悬浮,其缺点在于剪切力和颗粒碰撞会破坏固定细胞。
填充床生物反应器中,细胞固定在胶粒、泡沫,也可以位于支持物的表面,
通过培养液流动实现混合和传质。
填充床的缺点在于
( 1)由于混合效果低,对必要的氧传递、
pH、温度控制和产物的排泄造成困难;
( 2)床中颗粒或支持物的破碎阻塞液体流动,导致床阻塞。
传质效率低和阻塞是固定床要解决的关键问题。
膜反应器是近年使用广泛的一种固定化反应器。最常用的膜反应器是中空纤维和螺线式卷绕反应器。膜反应器的传质效率低和易堵塞问题同样存在,且反应器投资大。
固定化培养反应器主要适用于分泌产物到体外的细胞培养,对于分泌量少的体系,应采用适当的产物释放技术。
固定床的优点在于其单位体积容量大,而大颗粒传质低限制了其应用。
流化床反应器采用小颗粒,传质效果好,而碰撞和剪切力会造成固定化颗粒和细胞的损伤。
膜反应器的固定化反应器提供了优点,包括膜的重复使用性和选择性,但传质和产物的收获成为限制其应用的重要因素。
4、植物器官培养生物反应器相比于细胞培养,植物器官的培养更为复杂。植物器官主要包括:
毛状根芽体细胞胚和幼苗等针对这些不同体系,开发合适的商业化生物反应器系统具有重要的实际意义。
毛状根培养物呈多分支,在培养过程中易结团,形成紧密的球状物和团状物,对反应器中的混合和传质特性具有明显的影响,同时,毛状根培养物在培养过程中对于机械搅拌产生的剪切力敏感,易造成毛状根生长点的坏死和培养物的断裂,造成愈伤化和生长停滞,因而传统的搅拌式难以直接应用于毛状根的培养。
通过芽培养来进行植物组织微培养和快繁技术已得到飞速发展,但对于芽培养的生物研究目前尚处于起步阶段。
芽培养本身具有一定的复杂性,不能承受剪切力,同时长期浸没培养易引起玻璃化现象,所以芽培养的生物反应器设计应考虑到上述问题。
利用生物反应器进行体细胞胚大量培养是人工种子技术向商业化转变的前提条件之一。在生物反应器的合适操作条件下,可以保证体胚的高频率发生。
应用于体胚大规模培养的生物反应器一般为剪切力小,传质效果好的气升式反应器。