典型的微生物新种分离筛选过程分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定第三章 菌株选育理想的工业发酵菌种应符合以下要求：
(1)遗传性状稳定；
(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；
(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；
(4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；
(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；
(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；
(7)对温度,pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；
(8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。
菌株选育典型流程出发菌株（砂土管或冷冻管） 小试原种特性考擦斜面 或摇瓶培养 24h 培养基优化单孢子悬液 菌悬液 挑出高产菌株诱变处理 摇瓶复筛处理前后计数稀释涂平板 传种斜面观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面 保藏菌株对照组比较摇瓶初筛 挑出高产斜面
3.1 自然选育自然选育是指在特定环境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变（ spontaneous mutation）体的古老的育种方法。
自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。后来发展了诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗 (BCG vaccine)。法国的卡尔密脱 (Calmette)和介林 (Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养 230代，前后经历 13年时间，终于在 1923年获得显著减毒的结核杆菌
----卡介苗。
自然选育的作用：
自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。
3.2 诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、
快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。
3.2.1 诱变剂及其诱发机理
1,物理诱变剂物理诱变主要是采用辐射。如紫外线,X射线,γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。本节将主要讨论紫外线。
生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在 265nm波长处，
该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成
DNA链的断裂，或使 DNA分子内或分子之间发生交联反应。
交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。 它会引起
DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。
图 1,嘧啶的紫外线光化产物过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的 DNA，
或使交联的 DNA无法打开，不能进行复制和转录，
从而引起菌体死亡。
在正常的微生物细胞中，紫外线造成的 DNA
损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。
图 2 光复活作用修复胸腺嘧啶二聚体的过程 (PRE
为光复活酶 )
光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶 (photoreactivating
enzyme)，即光裂合酶
(photolyase)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能 (300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，
将 DNA复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。
一般微生物细胞内都具有光复活酶，
所以,微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作 。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度
(45-50℃ 温度下光复活作用最强 )等因素有关。
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复 (dark repair)或切除修复作用 (excision repair)。它可修复由紫外线,γ射线和烷化剂等对 DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。首先由核酸内切酶切开二聚体的 5’末端,形成 3’-OH和 5’-P
的单链缺口，然后，核酸外切酶从 5’-P到 3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口，接着,DNA
聚合酶以另一条互补链为模板，
从原有链上暴露的 3’-OH 端起合成缺失片段，最后，由连接酶将新合成链的 3’-OH与原链的 5’-
P相连接。
光复活作用使胸腺嘧啶二聚体复原成两个胸腺嘧啶，暗修复则是将胸腺嘧啶二聚体切除。细胞中还存在另一种在并不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统，即 重组修复 (recombination
repair)。 重组修复必须在 DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复
(postreplication repair)。
重组修复中 DNA损伤并没有除去，当进行下一轮复制时，留在母链上的损伤仍会给复制带来困难，还需要重组修复来弥补，直到损伤被切除修复消除。但是，随着复制的进行，若干代后，即使损伤未从母链中除去，而在后代的细胞群中也已被稀释，事实上消除了损伤的影响。 图 3 重组修复过程
2,化学诱变剂化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
烷化剂 (alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与 DNA中的碱基或磷酸作用。常见的烷化剂有硫酸二乙酯 (EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、
N-甲基 -N’-硝基 -N-亚硝基胍 (NTG)、亚硝基甲基脲
(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。甲基磺酸甲酯是单功能烷化剂，氮芥是双功能烷化剂。 NTG
和 NMU因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。 双功能烷化剂可引起 DNA二条链交联，造成菌体死亡，所以其毒性比单功能烷化剂强。
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成 6-烷基鸟嘌呤，
并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。
胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对，见图 4。 图 4 EMS 的烷基化造成的碱基转换亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基,如使腺嘌呤
(A)、胞嘧啶 (C)和鸟嘌呤 (G)分别脱氨基成为次黄嘌呤
(H)、尿嘧啶 (U)和黄嘌呤 (X)。复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶 (C)、腺嘌呤 (A)和胞嘧啶
(C)配对，见图 5
图 5 亚硝酸引起碱基氧化脱氨基效应
1.腺嘌呤氧化脱氨基成为次黄嘌呤，与胞嘧啶配对； 2,胞嘧啶氧化脱氨基成为尿嘧啶，
与腺嘌呤配对； 3,鸟嘌呤氧化脱氨基成为黄嘌呤，仍与胞嘧啶配对，不能引起碱基转换
(2)碱基类似物这些化合物有 5-溴尿嘧啶 (5-BU),5-氟尿嘧啶 (5-FU),8氮鸟嘌呤 (8-NG)和 2-氨基嘌呤
(2-AP)等。它们与碱基的结构类似，在 DNA
复制时,它们可以被错误地掺入 DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。
(3)移码突变的诱变剂移码突变是指由一种诱变剂引起 DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，
从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。 由移码突变产生的突变体称为移码突变体。
吖啶类染料 (原黄素、吖啶黄、吖啶橙及 α
-氨基吖啶等 )和一系列称为 ICR类的化合物
(它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物 )都是移码突变的有效诱变剂
3.2.3 诱变育种方法中应注意的问题
1.出发菌株的选择用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源主要有三方面：
(1)自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或 DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差 (这正是它们能在大自然中生存的原因 )。通过诱变育种，它们正突变 (即产量或质量性状向好的方向改变 )的可能性大。
(2)经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
3)已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变 (即产量或质量性状向差的方向改变 )的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，
继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
一般可选择 (1)或 (2)类菌株，第 (2)类较佳，
因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株。
出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2.制备菌悬液待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、
悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期。
悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。
利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现 表型延迟现象 。
所谓的表型延迟 (phenotypic lag)就是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，
造成生产性状衰退。 所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。
另外，还有一种 生理性延迟现象,就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。
这可以用营养缺陷型来说明。
一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。
只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。
3.诱变处理仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，
选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。
要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在 90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，
并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量 (致死率在
70%-80%),甚至更低剂量 (致死率在 30-70%)，
他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
诱变育种中还常常采取 诱变剂复合处理,使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性,复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大,因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理,
诱变剂复合处理及其协同效应菌种 单独处理 复合处理诱变剂 突变率
(%)
诱变剂 突变率
(%)
土曲霉 紫外线
X射线
21.3
19.7
紫外线 + X射线 42.8
土曲霉 氮芥 (0.1%)
紫外线不明显
4.7
紫外线 +氮芥 11.0
链霉菌 紫外线
γ射线
31.0
35.0
紫外线 +γ射线 43.6
金色链霉菌
(2U-84)
二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线
6.06
1.78
12.5
紫外线 +二乙烯三胺紫外线 +硫酸二乙酯
26.6
35.86
灰色链霉菌
(JIC-1)
紫外线 9.8 紫外线 +可见光照射 1次紫外线 +可见光照射 6次
9.7
16.6
3.3 抗噬菌体菌株的选育在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。
消灭噬菌体选育抗噬菌体菌株；噬菌体易变异，
要不断的选育抗噬菌体菌株。
3.3.1 抗噬菌体菌株选育的方法
（ 1）自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。
（ 2）诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，
经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。
3.3.1 抗噬菌体菌株选育的方法
(3) 将 敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株 。
抗噬菌体菌株的特性试验
（ 1）抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。
多次传代考擦稳定性
（ 2）抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，
有考擦碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。
（ 3）真正抗性与溶源性的区别试验：
3.4 杂交育种杂交育种 (Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，
或原核微生物的接合,F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
3.4 杂交育种有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，
这影响了基因重组在微生物中的应用。
3.5 原生质体融合技术原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合” (cell fusion)。
原生质体融合技术始于 1976年,最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。
原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于 10-1(而诱变育种一般仅为 10-8)。
如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、
真核微生物以及动植物和人体的细胞。
原生质体融合技术示意图主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
3,5,1 选择亲株为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，
如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。
在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。
3,5,2 原生质体制备去除细胞壁是制备原生质体的关键 。 一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，
如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。
一些微生物的去壁方法微生物 细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌芽孢杆菌葡萄球菌链霉菌小单胞菌肽聚糖 溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理 (菌丝生长时补充 0.5～
5.0%甘氨酸 或 10～ 34%蔗糖 )
溶菌酶处理 (菌丝生长时补充 0.2～
0.5%甘氨酸 )
革兰氏阴性菌大肠杆菌碱性普罗委登斯菌黄色短杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和 EDTA处理溶菌酶和 EDTA处理溶菌酶处理 (生长时补充 0.41M蔗糖及
0.3u/ml青霉素 )
霉菌 纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌 葡聚糖和几丁质蜗牛酶在菌体生长的培养基中添加 甘氨酸,可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，
有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替 D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。
不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。 蔗糖 的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。
青霉素 能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，
所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。
对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。
如细菌的稳定液常用 SMM液 (用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖 0.5M,顺丁烯二酸 0.02M,MgCl20.02M)和 DF液 (用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖 0.25M,琥珀酸 0.25M,EDTA0.001M,K2HPO40.02M,
KH2PO40.11M,MgCl2 0.01M)。
在链霉菌中用得较多的是 P液 (主要成分蔗糖
0.3M,MgCl20.01M,CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子 )。
真菌中广为使用的是 0.7M NaCl或 0.6M MgSO4
溶液，
高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，
易与菌丝碎片分开。
3,5,3 原生质体融合聚乙二醇 (PEG)能有效地促进原生质体融合。 PEG促进原生质体融合的机理并不清楚，有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。但是,PEG对细胞尤其是原生质体有一定的毒害作用，
因此作用的时间一般不宜过长。 微生物的原生质体只需要与
PEG接触一分钟，就应尽快加入缓冲液进行稀释。 PEG有不同的聚合度，在细菌原生质体融合中，多采用高分子量的 PEG(如
PEG6000),对放线菌则可采用各种分子量的 PEG。一般 PEG的使用浓度范围在 25-40%。另外，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。
3,5,4 原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁,恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要 高渗透压 。
能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。
细菌一般再生率为 3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达 100%。真菌再生率一般在 20-80%。
链霉菌再生率最高可达 50%。
3,5,4 原生质体再生为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。
涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。
因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。
另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型 A+B-和 A-B+，融合重组子应是 A+B+或 A-B-。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。
直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；
间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落,然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。
从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，
宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。
以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。
3,6 基因工程 (gene engineering)
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质 DNA分子提取出来，
在离体条件下切割后，把它与作为载体的
DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
图 基因工程的主要过程
3,6 基因工程 (gene engineering)
目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的
mRNA，然后将其反转录合成 cDNA而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成 DNA片段。
将目标基因的两端和载体 DNA的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组 DNA。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组 DNA技术。
3,6 基因工程 (gene engineering)
以质粒为载体的重组体 DNA可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组 DNA可以通过转导或转染进入受体细胞。
重组 DNA在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组 DNA将有利于积累更多的目标产物。
3,6 基因工程 (gene engineering)
基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组 DNA无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体 DNA中可以较容易地设置多种特定遗传标记 (如药物抗性标记 )，因此筛选工作的目标性和有效性很高，
是其它育种工作所无法比拟的。
3,7 菌种筛选方法所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，
突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，
就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。
菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，
往往将筛选工作分为 初筛 和 复筛 两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，应精确测定每个菌株的生产指标。
筛选方案：
第三轮、第四轮 …( 操作同上 )
初筛和复筛工作可以连续进行多轮，
直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。
3,8 抗性筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有 10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。
抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法 和 阶梯性筛选 法两种手段。
1.一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。
抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。
耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。
耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。
而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。
耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。
2.阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的 代谢物结构类似物 来筛选，大量细胞中 少数抗性菌 在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。
因为药物抗性常受多位点基因的控制，
所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，
而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。
阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏,
所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。
(1)梯度平板法 (Gradient plate) 先将 10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入 7-10ml含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，
药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，
以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。
图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构表 梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌代谢产物 生产菌 代谢拮抗物肌苷肌苷腺嘌呤烟碱酸色氨酸甲硫氨酸酪氨酸亮氨酸吡咯叠氮短小芽孢杆菌棒杆菌鼠伤寒沙门氏杆菌衣藻伤寒沙门氏杆菌大肠杆菌大肠杆菌伤寒沙门氏杆菌金色假单胞菌
8-氮鸟嘌呤
6-巯鸟嘌呤
2,6-二氨基嘌呤
3-乙酰吡啶
6-甲基色氨酸乙硫氨酸对氟苯丙氨酸三氯 -DL-亮氨酸
6-氟色氨酸阶梯性筛选法也有一定的缺点，
它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，
用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，
放入涂布了菌悬液的平板上，一般 9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。
3,9 推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素 生物合成机制 已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多,应用较广,成效亦较为显著。
就一些抗生素而言,经过多年的研究,其代谢机理已较清楚。实践证明,推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多,只需适量筛选,
即可达到所期望的目的。
替考拉宁产生菌 TA2-2组分高含量菌种的推理选育替考拉宁 (teicoplanin)系替考游动放线菌 (Acti-noplanesteichomyceticus)发酵产生的一糖肽类抗生素,是 5个化学结构十分相似化合物 (TA2-1,TA2-2,TA2-3,TA2-4,TA2-5)
的混合物。 5个组分的差异仅在于酰基侧链的不同。 5个组分中 TA2-2为主要有效成份。
替考拉宁化学结构
L-缬氨酸是 TA2-2组分的酰基侧链的生物合成前体。在 L-缬氨酸代谢途径中,L-缬氨酸是该分枝代谢途径的第一个酶 ——乙酰乙酸合酶的反馈抑制剂,因此如果能够解除反馈抑制,就能增加 L-缬氨酸的浓度,有利于 TA2-2组分的生物合成。缬氨酸氧肟酸
(valinehydroxamate,VH)为 L-缬氨酸的结构类似物,如果能够诱变得到缬氨酸氧肟酸的抗性突变株,就有可能选育出 TA2-2组分含量高的替考拉宁高产菌株。
替考拉宁推理选育方法：
1 诱变处理：
将替考游动放线菌 97-5-74的新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液,吸取 5ml于无菌双蝶中,置 254nm,功率 30W紫外灯下
30cm处,振荡照射 100s。
替考拉宁推理选育方法：
2 菌株对缬氨酸氧肟酸敏感性的考察：
将未处理的单孢子悬浮液涂布于含不同浓度的缬氨酸氧肟酸的平板培养基中,培养后观察菌落的生长情况。
3 缬氨酸氧肟酸抗性菌株的选育：
将诱变后的存活孢子涂布在含 0.3%的缬氨酸氧肟酸平板分离培养基中,筛选缬氨酸氧肟酸抗性 (VHr)突变株。
表 缬氨酸氧肟酸对产生菌生长的影响
VH浓度 (%) 生长情况 *
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
++++
++++
+++
++
++
++
+
-
++++:极好 ; +++:好 ; ++:中等 ; +:差 ;-:不生长替考拉宁推理选育结果（ 1）：
替考拉宁推理选育结果（ 2）：
相对生产能力 TA2-2
平均 最高 平均 (%) 最高 (%)
NS
UV
UV+VHr
100
102
127
100
107
135
34
38
47
39.16
41.69
60.09
表 2 自然分离株,UV诱变株及 VHr拮抗株总产量及
TA2-2含量比较替考拉宁推理选育结果（ 3）：
表 3 菌株 98-1-227传代后的生产能力和 TA2-2组分含量传代 相对活力 TA2-2(%)
1
2
3
4
100
102
98
85
56.21
59.99
55.54
48.38
Avermectin产生菌诱导推理选育
avermectin(AVM)系一簇十六元大环内酯类抗生素,它含有 8个结构相似的组份,A1a、
A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a,B2b。
Avermectin化学结构
Avermectins结构每个组份的生物合成途径如下,AVM
内酯环由 5个乙酸,7个丙酸和 1个支链脂肪酸通过 1
个聚酮体的中间体合成。
Figure Biosynthesis of the averectin
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of
SU1 and SU2 on avermectin PKS and milbemycin PKS
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU10,
SU11,and SU12 on avermectin PKS and milbemycin PKS
Averectin用亮氨酸推理选育方法：
1 诱变处理将 S.avermitilisXC1-25新鲜斜面培养物制成单孢子悬浮液,吸取 5ml放入无菌平板中,并置于波长 253.7nm、功率 30W紫外灯下 30cm处开盖、振荡照射 60s备用。
2 含有 L-Ile平板的制备,将不含 L-Ile培养基 20ml
倒入培养皿内,平放,待凝后再倒入 5ml含有
0.1%L-Ile的培养基,平放。
3 Ilei变株的分离,将经 UV处理过的存活孢子,以适当浓度涂布于含有 0.1%L-Ile的平板培养基上培养,Ilei变株系从这种培养基上生长的菌落中分离得到。
Averectin用亮氨酸推理选育结果：
Tab.1 Comparison of AVMB1 productivity among
the natural isolates,UV mutants and the I-lei mutants
B1 (%)
average The highest
NS
UV
UV+I-lei
100
109
114
100
118
122
Structure of the spinosad
spinosad的生物合成多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能基因 大小
（氨基酸）
推定功能 基因 大小
（氨基酸）
推定功能
spnA 2596 PKS spnM 321 聚酮交链桥形成
spnB 2153 PKS spnN 333 福乐糖胺,3-酮基还原酶
spnC 3171 PKS spnO 487 福乐糖胺,2,3-脱氢酶
spnD 4929 PKS spnP 456 福乐糖胺转移酶
spnE 5589 PKS spnQ 463 福乐糖胺,3,4-脱氢酶
spnF 276 聚酮交链桥形成 spnR 386 福乐糖胺：转胺酶
spnG 391 鼠李糖转移酶 spnS 250 福乐糖胺：二甲基转移酶
spnH 251 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-R1 199 未知
spnI 396 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-R2 282 外切脱氧核糖核酸酶
spnJ 540 聚酮交链桥形成 ORF-
L15
256 氧化还原酶
spnK 396 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-
L16
282 lysR调节因子
spnL 284 聚酮交链桥形成顺序推理选育
思考题：根据你学的选育知识，设计
spinosad的 选育？
推理选育步骤
1 培养基的调整
2 自然选育
3.10 培养基的调整一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。
在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是 表达型＝基因型＋环境的作用 。
3.10 培养基的调整基于上述道理，对诱变 1～ 2代 后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。
表 抗霉素 A生产菌在不同环境条件下的生产能力选育菌株号培养基和培养条件组和编号
1 2 3 4 5 6 7
M101 65 120 204 316
M106 240 530 646 1938
M206 690 856 3164
M306 870 1260 1960 4492
M406 1672 2070 4952
M506 5512 7180 7500
M606 7800 9500
图 盐霉素生产菌育种过程产量提高情况
C
A C
B C
D
E
F
A 营养改良
B 培养基调整
C 选育新菌种
D 菌种改良
E 调整营养，
增加种量
F 培养基调整相对效价
1
600
3.10 培养基的调整培养基调整方法：
正交设计相应面方法
(1)遗传性状稳定；
(2)生长速度快，不易被噬菌体等污染；
(3)目标产物的产量尽可能接近理论转化率；
(4)目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离；
(5)尽可能减少产物类似物的产量，以提高目标产物的产量及利于产物分离；
(6)培养基成分简单、来源广、价格低廉；
(7)对温度,pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感；
(8)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。
菌株选育典型流程出发菌株（砂土管或冷冻管） 小试原种特性考擦斜面 或摇瓶培养 24h 培养基优化单孢子悬液 菌悬液 挑出高产菌株诱变处理 摇瓶复筛处理前后计数稀释涂平板 传种斜面观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面 保藏菌株对照组比较摇瓶初筛 挑出高产斜面
3.1 自然选育自然选育是指在特定环境下长期处理某一微生物培养物，同时不断地移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变（ spontaneous mutation）体的古老的育种方法。
自发突变的频率较低，变异程度不大，所以，用该法培育新菌种的过程十分缓慢。后来发展了诱变育种、杂交育种、尤其是基因工程等育种技术。
自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗 (BCG vaccine)。法国的卡尔密脱 (Calmette)和介林 (Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养 230代，前后经历 13年时间，终于在 1923年获得显著减毒的结核杆菌
----卡介苗。
自然选育的作用：
自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。
3.2 诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、
快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。
3.2.1 诱变剂及其诱发机理
1,物理诱变剂物理诱变主要是采用辐射。如紫外线,X射线,γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。本节将主要讨论紫外线。
生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在 265nm波长处，
该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成
DNA链的断裂，或使 DNA分子内或分子之间发生交联反应。
交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。 它会引起
DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。
图 1,嘧啶的紫外线光化产物过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的 DNA，
或使交联的 DNA无法打开，不能进行复制和转录，
从而引起菌体死亡。
在正常的微生物细胞中，紫外线造成的 DNA
损伤是可以得到及时修复的。若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降，这就是光复活作用。
图 2 光复活作用修复胸腺嘧啶二聚体的过程 (PRE
为光复活酶 )
光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶 (photoreactivating
enzyme)，即光裂合酶
(photolyase)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能 (300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，
将 DNA复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能。
一般微生物细胞内都具有光复活酶，
所以,微生物紫外线诱变育种应在避光或红光条件下操作 。但因为在高剂量紫外线诱变处理后，细胞的光复活主要是致死效应的回复，突变效应不回复，所以，有时也可以采用紫外线和可见光交替处理，以增加菌体的突变率；光复活的程度与可见光照射时间、强度和温度
(45-50℃ 温度下光复活作用最强 )等因素有关。
细胞内还存在另一种修复体系，它不需要光激活，所以称为暗修复 (dark repair)或切除修复作用 (excision repair)。它可修复由紫外线,γ射线和烷化剂等对 DNA造成的损伤。
暗修复体系有四种酶参与反应。首先由核酸内切酶切开二聚体的 5’末端,形成 3’-OH和 5’-P
的单链缺口，然后，核酸外切酶从 5’-P到 3’-OH方向切除二聚体，并扩大缺口，接着,DNA
聚合酶以另一条互补链为模板，
从原有链上暴露的 3’-OH 端起合成缺失片段，最后，由连接酶将新合成链的 3’-OH与原链的 5’-
P相连接。
光复活作用使胸腺嘧啶二聚体复原成两个胸腺嘧啶，暗修复则是将胸腺嘧啶二聚体切除。细胞中还存在另一种在并不改变胸腺嘧啶二聚体的情况下的修复系统，即 重组修复 (recombination
repair)。 重组修复必须在 DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复
(postreplication repair)。
重组修复中 DNA损伤并没有除去，当进行下一轮复制时，留在母链上的损伤仍会给复制带来困难，还需要重组修复来弥补，直到损伤被切除修复消除。但是，随着复制的进行，若干代后，即使损伤未从母链中除去，而在后代的细胞群中也已被稀释，事实上消除了损伤的影响。 图 3 重组修复过程
2,化学诱变剂化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
烷化剂 (alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与 DNA中的碱基或磷酸作用。常见的烷化剂有硫酸二乙酯 (EDS)、甲基磺酸乙酯 (EMS)、
N-甲基 -N’-硝基 -N-亚硝基胍 (NTG)、亚硝基甲基脲
(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。甲基磺酸甲酯是单功能烷化剂，氮芥是双功能烷化剂。 NTG
和 NMU因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。 双功能烷化剂可引起 DNA二条链交联，造成菌体死亡，所以其毒性比单功能烷化剂强。
碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成 6-烷基鸟嘌呤，
并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。
胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对，见图 4。 图 4 EMS 的烷基化造成的碱基转换亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基,如使腺嘌呤
(A)、胞嘧啶 (C)和鸟嘌呤 (G)分别脱氨基成为次黄嘌呤
(H)、尿嘧啶 (U)和黄嘌呤 (X)。复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶 (C)、腺嘌呤 (A)和胞嘧啶
(C)配对，见图 5
图 5 亚硝酸引起碱基氧化脱氨基效应
1.腺嘌呤氧化脱氨基成为次黄嘌呤，与胞嘧啶配对； 2,胞嘧啶氧化脱氨基成为尿嘧啶，
与腺嘌呤配对； 3,鸟嘌呤氧化脱氨基成为黄嘌呤，仍与胞嘧啶配对，不能引起碱基转换
(2)碱基类似物这些化合物有 5-溴尿嘧啶 (5-BU),5-氟尿嘧啶 (5-FU),8氮鸟嘌呤 (8-NG)和 2-氨基嘌呤
(2-AP)等。它们与碱基的结构类似，在 DNA
复制时,它们可以被错误地掺入 DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。
(3)移码突变的诱变剂移码突变是指由一种诱变剂引起 DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，
从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。 由移码突变产生的突变体称为移码突变体。
吖啶类染料 (原黄素、吖啶黄、吖啶橙及 α
-氨基吖啶等 )和一系列称为 ICR类的化合物
(它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物 )都是移码突变的有效诱变剂
3.2.3 诱变育种方法中应注意的问题
1.出发菌株的选择用来育种处理的起始菌株或称为出发菌株，合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。首先应考虑出发菌株是否具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源主要有三方面：
(1)自然界直接分离到的野生型菌株 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或 DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差 (这正是它们能在大自然中生存的原因 )。通过诱变育种，它们正突变 (即产量或质量性状向好的方向改变 )的可能性大。
(2)经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状，对生产环境有较好的适应性，正突变的可能性也很大。
3)已经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤，某些生理功能或酶系统有缺损，产量性状已经达到了一定水平。它们负突变 (即产量或质量性状向差的方向改变 )的可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，
继续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
一般可选择 (1)或 (2)类菌株，第 (2)类较佳，
因为已证明它可以向好的方向发展。在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌株。
出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。
2.制备菌悬液待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、
悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期。
悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后续的筛选工作造成困难。为避免细胞团出现，可用玻璃珠振荡打散细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤，得到分散的菌体。对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。将经过一定时期培养的斜面上的孢子洗下，用多层擦镜纸过滤。
利用孢子进行诱变处理的优点是能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂，更重要的是它尽可能地避免了出现 表型延迟现象 。
所谓的表型延迟 (phenotypic lag)就是指某一突变在 DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变，若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分离现象，
造成生产性状衰退。 所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变对象。
另外，还有一种 生理性延迟现象,就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。
这可以用营养缺陷型来说明。
一个发生营养缺陷型突变的菌株，产某种酶的基因已发生突变，但是由于突变前菌体内所含的酶系仍然存在，仍具有野生型表型。
只有通过数次细胞分裂，细胞内正常的酶得以稀释或被分解，营养缺陷型突变的性状才会表现出来。
3.诱变处理仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。例如，同样功率的紫外线照射诱变效应还受到紫外灯质量及其预热时间、灯与被照射物的距离、照射时间、菌悬液的浓度、厚度及其均匀程度等诸多因素的影响。另外，不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，
选择合适的处理剂量。致死率表示诱变剂造成菌悬液中死亡菌体数占菌体总数的比率。
要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在 90-99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，
并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量 (致死率在
70%-80%),甚至更低剂量 (致死率在 30-70%)，
他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。
诱变育种中还常常采取 诱变剂复合处理,使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性,复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大,因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理,
诱变剂复合处理及其协同效应菌种 单独处理 复合处理诱变剂 突变率
(%)
诱变剂 突变率
(%)
土曲霉 紫外线
X射线
21.3
19.7
紫外线 + X射线 42.8
土曲霉 氮芥 (0.1%)
紫外线不明显
4.7
紫外线 +氮芥 11.0
链霉菌 紫外线
γ射线
31.0
35.0
紫外线 +γ射线 43.6
金色链霉菌
(2U-84)
二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线
6.06
1.78
12.5
紫外线 +二乙烯三胺紫外线 +硫酸二乙酯
26.6
35.86
灰色链霉菌
(JIC-1)
紫外线 9.8 紫外线 +可见光照射 1次紫外线 +可见光照射 6次
9.7
16.6
3.3 抗噬菌体菌株的选育在工业微生物发酵过程中，不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。
消灭噬菌体选育抗噬菌体菌株；噬菌体易变异，
要不断的选育抗噬菌体菌株。
3.3.1 抗噬菌体菌株选育的方法
（ 1）自然选育：以噬菌体为筛子，敏感的菌株不经任何诱变自然突变获得的抗性菌株。抗性突变频率低。
（ 2）诱变选育：敏感菌株经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，
经处理后的存活的孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。
3.3.1 抗噬菌体菌株选育的方法
(3) 将 敏感菌株经诱变因素处理后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天；再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取出菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株 。
抗噬菌体菌株的特性试验
（ 1）抗噬菌体性状的稳定性试验：抗性菌株分别在孢子培养、种子培养、发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。
多次传代考擦稳定性
（ 2）抗性菌株的产量试验：抗性菌株与原敏感菌株在发酵特性上有所改变，因此，
有考擦碳源、氮源、通气量等发酵条件对产量的影响。
（ 3）真正抗性与溶源性的区别试验：
3.4 杂交育种杂交育种 (Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，
或原核微生物的接合,F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。
3.4 杂交育种有杂交现象的微生物为数不多，在有工业价值的微生物中更少，而且即使发生杂交，遗传重组的频率亦不高，
这影响了基因重组在微生物中的应用。
3.5 原生质体融合技术原生质体融合是通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦可称为“细胞融合” (cell fusion)。
原生质体融合技术始于 1976年,最早是在动物细胞实验中发展起来的，后来，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及细菌和放线菌中也得到了应用。
原生质体融合技术是继转化、转导和接合等微生物基因重组方式之后，又一个极其重要的基因重组技术。应用原生质体融合技术后，细胞间基因重组的频率大大提高了，在某些例子中，原生质体的重组频率已大于 10-1(而诱变育种一般仅为 10-8)。
如今，能借助原生质体融合技术进行基因重组的细胞极其广泛，包括原核微生物、
真核微生物以及动植物和人体的细胞。
原生质体融合技术示意图主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生及筛选优良性状的融合子。
3,5,1 选择亲株为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株。同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，
如营养缺陷型或抗药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。
在进行原生质体融合前，应先测定菌株各遗传标记的稳定性，如果自发回复突变的频率过高，应考虑该菌株是否适用。
3,5,2 原生质体制备去除细胞壁是制备原生质体的关键 。 一般都采用酶解法去壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不同，需分别采用不同的酶，
如溶菌酶，纤维素酶，蜗牛酶等。有时需结合其它一些措施，如在生长培养基中添加甘氨酸、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性。
一些微生物的去壁方法微生物 细胞壁主要成分去壁方法革兰氏阳性菌芽孢杆菌葡萄球菌链霉菌小单胞菌肽聚糖 溶菌酶处理溶葡萄球菌素处理溶菌酶处理 (菌丝生长时补充 0.5～
5.0%甘氨酸 或 10～ 34%蔗糖 )
溶菌酶处理 (菌丝生长时补充 0.2～
0.5%甘氨酸 )
革兰氏阴性菌大肠杆菌碱性普罗委登斯菌黄色短杆菌肽聚糖和脂多糖溶菌酶和 EDTA处理溶菌酶和 EDTA处理溶菌酶处理 (生长时补充 0.41M蔗糖及
0.3u/ml青霉素 )
霉菌 纤维素和几丁质纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶酵母菌 葡聚糖和几丁质蜗牛酶在菌体生长的培养基中添加 甘氨酸,可以使菌体较容易被酶解。甘氨酸的作用机理并不十分清楚，
有人认为甘氨酸渗入细胞壁肽聚糖中代替 D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组分间的交联度。
不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相同。在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性。 蔗糖 的作用可能是扰乱了菌体的代谢，最适的蔗糖添加浓度随不同菌种而变化。
青霉素 能干扰肽聚糖合成中的转肽作用，使多糖部分不能交联，从而影响肽聚糖的网状结构的形成，
所以，在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感。
菌龄也是影响溶壁的因素之一。一般处于对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。
原生质体对渗透压极其敏感，低渗将引起细胞破裂。一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性。
对于不同微生物，原生质体的高渗稳定液组成也是不同的。
如细菌的稳定液常用 SMM液 (用于芽孢杆菌原生质体制备和融合，其主要成分是蔗糖 0.5M,顺丁烯二酸 0.02M,MgCl20.02M)和 DF液 (用于棒状杆菌原生质体制备和融合，主要成分是蔗糖 0.25M,琥珀酸 0.25M,EDTA0.001M,K2HPO40.02M,
KH2PO40.11M,MgCl2 0.01M)。
在链霉菌中用得较多的是 P液 (主要成分蔗糖
0.3M,MgCl20.01M,CaCl20.25M及少量磷酸盐和无机离子 )。
真菌中广为使用的是 0.7M NaCl或 0.6M MgSO4
溶液，
高渗稳定液使原生质体内空泡增大，浮力增加，
易与菌丝碎片分开。
3,5,3 原生质体融合聚乙二醇 (PEG)能有效地促进原生质体融合。 PEG促进原生质体融合的机理并不清楚，有人推测助融作用可能与下列过程有关：开始由于强烈的脱水而使原生质体粘在一起，并形成聚合体。原生质体收缩并高度变形，使原生质体之间的接触面增大，细胞膜结构发生紊乱，从而加大了细胞膜的流动性，膜内的蛋白质和糖蛋白相互作用和混合，使紧密接触的原生质体相互融合。但是,PEG对细胞尤其是原生质体有一定的毒害作用，
因此作用的时间一般不宜过长。 微生物的原生质体只需要与
PEG接触一分钟，就应尽快加入缓冲液进行稀释。 PEG有不同的聚合度，在细菌原生质体融合中，多采用高分子量的 PEG(如
PEG6000),对放线菌则可采用各种分子量的 PEG。一般 PEG的使用浓度范围在 25-40%。另外，紫外线照射或脉冲电场等物理因素处理也能促进原生质体融合。
3,5,4 原生质体再生原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁,恢复完整的细胞形态结构。不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，甚至一些非常接近的种，最适再生条件也往往有所差别，如再生培养基成分及培养温度等。但最重要的一个共同点是都需要 高渗透压 。
能再生细胞壁的原生质体只占总量的一部分。
细菌一般再生率为 3-10%。但有资料报道，在再生培养基中添加牛血清白蛋白，可使枯草杆菌原生质体的再生率达 100%。真菌再生率一般在 20-80%。
链霉菌再生率最高可达 50%。
3,5,4 原生质体再生为获得较高的再生率，在实验过程中应避免因强力使原生质体破裂。
涂布时，原生质体悬液的浓度不宜过高。
因为若有残存的菌体存在，它们将会率先在再生培养基中长成菌落，并抑制周围原生质体的再生。
另外，菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影响原生质体的再生。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代称为融合重组子。这种重组子通过两亲株遗传标记的互补而得以识别。如两亲株的遗传标记分别为营养缺陷型 A+B-和 A-B+，融合重组子应是 A+B+或 A-B-。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子重组子的检出方法有两种：直接法和间接法。
直接法将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子；
间接法把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落,然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。
从实际效果来看，直接法虽然方便，但由于选择条件的限制，对某些重组子的生长有影响。虽然间接法操作上要多一步，但不会因营养关系限制某些重组子的再生。特别是对一些有表型延迟现象的遗传标记，
宜用间接法。若原生质体融合的两亲株带有抗药性遗传标记，可以用类似的方法筛选重组子。
3,5,5 筛选优良性状融合重组子原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生多种多样的基因组合，从而得到多种类型的重组子，而且参与融合的亲株数不限于两个，可以多至三、四个。这些都是常规杂交育种不可能达到的。
以上获得的还仅仅是融合重组子，还需要对它们进行生理生化测定及生产性能的测定，以确定它是否是符合育种要求的优良菌株。
3,6 基因工程 (gene engineering)
基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质 DNA分子提取出来，
在离体条件下切割后，把它与作为载体的
DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
图 基因工程的主要过程
3,6 基因工程 (gene engineering)
目标基因可以从酶切的供体细胞染色体碎片中获得，或首先提取目标产物的
mRNA，然后将其反转录合成 cDNA而获得，或从目标蛋白的氨基酸顺序推测出基因的碱基顺序，人工合成 DNA片段。
将目标基因的两端和载体 DNA的两端用特定的核酸内切酶酶切后，让它们连接成环状的重组 DNA。因为这是在细胞外进行的基因重组过程，所以，有人将基因工程又称为体外重组 DNA技术。
3,6 基因工程 (gene engineering)
以质粒为载体的重组体 DNA可以通过转化进入受体细胞，而用噬菌体为载体的重组 DNA可以通过转导或转染进入受体细胞。
重组 DNA在受体细胞中将自主复制扩增。多拷贝的重组 DNA将有利于积累更多的目标产物。
3,6 基因工程 (gene engineering)
基因工程的操作有着非常强的方向性，但是，最终获得的并非是目标重组体的纯培养物，因为还有许多其它的细胞存在，如：目标基因可能没有被重组、重组的目标基因可能是反向的、重组 DNA无法稳定存在于受体细胞中等。所以，筛选仍然是基因工程育种工作中的重要内容。因为在载体 DNA中可以较容易地设置多种特定遗传标记 (如药物抗性标记 )，因此筛选工作的目标性和有效性很高，
是其它育种工作所无法比拟的。
3,7 菌种筛选方法所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后，
突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的少数。要在大量的细胞中寻找真正需要的细胞，
就象是大海捞针，工作量很大。简洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的关键。
菌种筛选方案在实际工作中，为了提高筛选效率，
往往将筛选工作分为 初筛 和 复筛 两步进行。
初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，应精确测定每个菌株的生产指标。
筛选方案：
第三轮、第四轮 …( 操作同上 )
初筛和复筛工作可以连续进行多轮，
直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选方案，不仅能以较少的工作量获得良好的效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。
筛选获得的优良菌株还将进一步做工业生产试验，考察它们对工艺条件和原料等的适应性及遗传稳定性。
3,8 抗性筛选抗性突变株的筛选相对比较容易，只要有 10–6频率的突变体存在，就容易筛选出来。
抗性突变株的筛选常用的有一次性筛选法 和 阶梯性筛选 法两种手段。
1.一次性筛选法一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。
抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异株。
耐高温菌株在工业发酵中的应用意义在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特殊的工艺过程。耐高温菌株也常采用此法筛选。将处理过的菌悬液在一定高温下处理一段时间后再分离。对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的细胞则对高温有较好的耐受性。
耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提高醪液酒精浓度。
而耐高渗透压的酵母菌株具有积累甘油的性能，可用于甘油发酵。
耐高酒精度、高渗透压的菌株也可分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高渗环境下一次性筛选获得。
2.阶梯性筛选法药物抗性即抗药性突变株可在培养基中加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作用的 代谢物结构类似物 来筛选，大量细胞中 少数抗性菌 在这种培养基平板上能长出菌落。但是在相当多的情况下，无法知道微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯性筛选法。
因为药物抗性常受多位点基因的控制，
所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物，
而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。
阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被遗漏,
所以说，阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以接受的药物浓度情况下。
(1)梯度平板法 (Gradient plate) 先将 10ml左右的一般固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结成斜面，然后将皿底放平，再倒入 7-10ml含适当浓度的药物的培养基，凝固后放置过夜。由于药物的扩散，上层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上，
药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会形成的明显界线。
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选，
以提高相应代谢产物的产量。如异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产吡哆醇的高产菌株。
图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构表 梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌代谢产物 生产菌 代谢拮抗物肌苷肌苷腺嘌呤烟碱酸色氨酸甲硫氨酸酪氨酸亮氨酸吡咯叠氮短小芽孢杆菌棒杆菌鼠伤寒沙门氏杆菌衣藻伤寒沙门氏杆菌大肠杆菌大肠杆菌伤寒沙门氏杆菌金色假单胞菌
8-氮鸟嘌呤
6-巯鸟嘌呤
2,6-二氨基嘌呤
3-乙酰吡啶
6-甲基色氨酸乙硫氨酸对氟苯丙氨酸三氯 -DL-亮氨酸
6-氟色氨酸阶梯性筛选法也有一定的缺点，
它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌，而低浓度区域面积较大，优良的抗性突变株若被分散在低浓度区域或远离纸片的区域，则可能没有被检出，因此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法纸片扩散法与梯度平板法的原理类似，
用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，
放入涂布了菌悬液的平板上，一般 9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。
3,9 推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗生素 生物合成机制 已知或较清楚的基础上按需要定向选育的一种方法。近几年研究较多,应用较广,成效亦较为显著。
就一些抗生素而言,经过多年的研究,其代谢机理已较清楚。实践证明,推理选育在抗生素育种上的应用其效果远比传统的随机筛选优越得多,只需适量筛选,
即可达到所期望的目的。
替考拉宁产生菌 TA2-2组分高含量菌种的推理选育替考拉宁 (teicoplanin)系替考游动放线菌 (Acti-noplanesteichomyceticus)发酵产生的一糖肽类抗生素,是 5个化学结构十分相似化合物 (TA2-1,TA2-2,TA2-3,TA2-4,TA2-5)
的混合物。 5个组分的差异仅在于酰基侧链的不同。 5个组分中 TA2-2为主要有效成份。
替考拉宁化学结构
L-缬氨酸是 TA2-2组分的酰基侧链的生物合成前体。在 L-缬氨酸代谢途径中,L-缬氨酸是该分枝代谢途径的第一个酶 ——乙酰乙酸合酶的反馈抑制剂,因此如果能够解除反馈抑制,就能增加 L-缬氨酸的浓度,有利于 TA2-2组分的生物合成。缬氨酸氧肟酸
(valinehydroxamate,VH)为 L-缬氨酸的结构类似物,如果能够诱变得到缬氨酸氧肟酸的抗性突变株,就有可能选育出 TA2-2组分含量高的替考拉宁高产菌株。
替考拉宁推理选育方法：
1 诱变处理：
将替考游动放线菌 97-5-74的新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液,吸取 5ml于无菌双蝶中,置 254nm,功率 30W紫外灯下
30cm处,振荡照射 100s。
替考拉宁推理选育方法：
2 菌株对缬氨酸氧肟酸敏感性的考察：
将未处理的单孢子悬浮液涂布于含不同浓度的缬氨酸氧肟酸的平板培养基中,培养后观察菌落的生长情况。
3 缬氨酸氧肟酸抗性菌株的选育：
将诱变后的存活孢子涂布在含 0.3%的缬氨酸氧肟酸平板分离培养基中,筛选缬氨酸氧肟酸抗性 (VHr)突变株。
表 缬氨酸氧肟酸对产生菌生长的影响
VH浓度 (%) 生长情况 *
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
++++
++++
+++
++
++
++
+
-
++++:极好 ; +++:好 ; ++:中等 ; +:差 ;-:不生长替考拉宁推理选育结果（ 1）：
替考拉宁推理选育结果（ 2）：
相对生产能力 TA2-2
平均 最高 平均 (%) 最高 (%)
NS
UV
UV+VHr
100
102
127
100
107
135
34
38
47
39.16
41.69
60.09
表 2 自然分离株,UV诱变株及 VHr拮抗株总产量及
TA2-2含量比较替考拉宁推理选育结果（ 3）：
表 3 菌株 98-1-227传代后的生产能力和 TA2-2组分含量传代 相对活力 TA2-2(%)
1
2
3
4
100
102
98
85
56.21
59.99
55.54
48.38
Avermectin产生菌诱导推理选育
avermectin(AVM)系一簇十六元大环内酯类抗生素,它含有 8个结构相似的组份,A1a、
A1b,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a,B2b。
Avermectin化学结构
Avermectins结构每个组份的生物合成途径如下,AVM
内酯环由 5个乙酸,7个丙酸和 1个支链脂肪酸通过 1
个聚酮体的中间体合成。
Figure Biosynthesis of the averectin
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of
SU1 and SU2 on avermectin PKS and milbemycin PKS
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU10,
SU11,and SU12 on avermectin PKS and milbemycin PKS
Averectin用亮氨酸推理选育方法：
1 诱变处理将 S.avermitilisXC1-25新鲜斜面培养物制成单孢子悬浮液,吸取 5ml放入无菌平板中,并置于波长 253.7nm、功率 30W紫外灯下 30cm处开盖、振荡照射 60s备用。
2 含有 L-Ile平板的制备,将不含 L-Ile培养基 20ml
倒入培养皿内,平放,待凝后再倒入 5ml含有
0.1%L-Ile的培养基,平放。
3 Ilei变株的分离,将经 UV处理过的存活孢子,以适当浓度涂布于含有 0.1%L-Ile的平板培养基上培养,Ilei变株系从这种培养基上生长的菌落中分离得到。
Averectin用亮氨酸推理选育结果：
Tab.1 Comparison of AVMB1 productivity among
the natural isolates,UV mutants and the I-lei mutants
B1 (%)
average The highest
NS
UV
UV+I-lei
100
109
114
100
118
122
Structure of the spinosad
spinosad的生物合成多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能基因 大小
（氨基酸）
推定功能 基因 大小
（氨基酸）
推定功能
spnA 2596 PKS spnM 321 聚酮交链桥形成
spnB 2153 PKS spnN 333 福乐糖胺,3-酮基还原酶
spnC 3171 PKS spnO 487 福乐糖胺,2,3-脱氢酶
spnD 4929 PKS spnP 456 福乐糖胺转移酶
spnE 5589 PKS spnQ 463 福乐糖胺,3,4-脱氢酶
spnF 276 聚酮交链桥形成 spnR 386 福乐糖胺：转胺酶
spnG 391 鼠李糖转移酶 spnS 250 福乐糖胺：二甲基转移酶
spnH 251 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-R1 199 未知
spnI 396 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-R2 282 外切脱氧核糖核酸酶
spnJ 540 聚酮交链桥形成 ORF-
L15
256 氧化还原酶
spnK 396 鼠李糖,O-甲基转移酶 ORF-
L16
282 lysR调节因子
spnL 284 聚酮交链桥形成顺序推理选育
思考题：根据你学的选育知识，设计
spinosad的 选育？
推理选育步骤
1 培养基的调整
2 自然选育
3.10 培养基的调整一个突变株由于基因突变，失去生理特性的平衡，同时也因此降低了与原来环境条件的适应能力。由于这种环境因素的选择作用，不适应的突变株优良性状不能表达，甚至被淘汰。
在实际选育中，当选育到一个优良变株时，要改变环境条件，即调整培养基配方和培养条件，使变株处于一个适应的环境中得到充分表达的机会，使高产性状及其他优良特性完全发挥出来，这就是 表达型＝基因型＋环境的作用 。
3.10 培养基的调整基于上述道理，对诱变 1～ 2代 后的优良菌株，要进行培养基和培养条件的调整，使它在短时间内的群体遗传结构占优势，从而表现出更高的生产性能，发酵单位达到最佳水平。
表 抗霉素 A生产菌在不同环境条件下的生产能力选育菌株号培养基和培养条件组和编号
1 2 3 4 5 6 7
M101 65 120 204 316
M106 240 530 646 1938
M206 690 856 3164
M306 870 1260 1960 4492
M406 1672 2070 4952
M506 5512 7180 7500
M606 7800 9500
图 盐霉素生产菌育种过程产量提高情况
C
A C
B C
D
E
F
A 营养改良
B 培养基调整
C 选育新菌种
D 菌种改良
E 调整营养，
增加种量
F 培养基调整相对效价
1
600
3.10 培养基的调整培养基调整方法：
正交设计相应面方法
