11.酶与细胞的固定化技术及其应用游离酶使用中的局限性,
1.提取纯化繁琐,价格昂贵
2.难以重复使用
3.稳定性差克服游离酶缺点的方法,
1.人工合成酶使用有机合成以及聚合物化学中的最新技术来合成具有像酶那样活性的催化剂
P450化学酶化学合成氯合 5,10,15,20-四取代苯基卟吩和铁 Fe（ Ⅲ ）等化合物,以亚碘酰苯（ PhIO）为电子供体，可模拟
P450的催化反应。
2,酶的改性、修饰酶的固定化是其中一个重要方面凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶都称为固定化酶,通过适当方法制成的不溶于水的酶都能满足这一定义,
固定化酶的优点,
可连续重复使用稳定性高
11.1 酶的固定化方法酶的催化活性主要依赖于它的特殊的高级结构 -
---活性中心,因此在制备固定化酶时必需严格操作条件,尽可能避免酶的高级结构受损,
酶的固定化方法
1,吸附法
2,包埋法
3,交联法
4,化学共价法
5,酶的逆胶束包囊法
11.1.1 吸附法吸附法是将酶溶液与吸附剂表面接触就能达到吸附结合蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附,因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的,
酶的吸附剂各种矿物质以及无机载体 (氧化铝,氧化铁,氧化钛 ),纤维素粉最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素,DEAE----纤维素,DEAE----
葡萄糖,合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引,缺点是当离子强度增加或介质的 pH、温度变化时,
这种结合发生分解,
11.1.2 包埋法将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法为包埋法,
优点,普适性常用的格子型包埋法载体有,海藻酸盐,K-角叉菜,琼脂,三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶,聚乙烯醇 (PVA)等一,海藻酸盐包埋法海藻酸钠与 Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺点,
在高浓度电介质（ K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定,
Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,
固定化颗粒溶解优点,
海藻酸盐价格便宜包埋条件温和二,角叉菜糖包埋法
K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物,在 K+离子存在下，它能立即生成凝胶,
缺点,
对高浓度的 Na+离子敏感固定化温度高,需要在 37℃ ~55℃
三,聚丙烯酰胺凝胶在含酶 (或细胞 )的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂 N,N’-甲撑双丙烯酰胺,然后在催化剂 (二甲氨基丙腈 )和引发剂 (过硫酸钾 )的作用下低温 (冰浴 )聚合,形成凝胶缺点,
丙烯酰胺对酶具有变性作用四,聚乙烯醇包埋法磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法硼酸硬化法,
将聚乙烯醇在 70℃ ~ 80℃ 进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至 35℃,与酶溶液 (细胞悬浮液 )混匀,滴加到饱和硼酸溶液中优点,
原材料价格便宜条件温和无毒害作用循环冷冻法硼酸硬化法
11.1.3 交联法交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶分子间交联因而得到固定的方法,
交联剂,戊二醛,己撑二异醛,双重氮联苯胺和乙烯 -马来酸酐共聚物等戊二醛可直接参与酶蛋白的交联或者酶蛋白分子与其它惰性蛋白分子的交联,使形成酶的蛋白质聚结态,
缺点,
双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，
常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。
为了避免或减少酶在交联过程中失活，
可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白。
11.1.4 化学共价法共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合,
优点,
载体与酶结合牢固,半衰期较长缺点,
化学共价法结合时反应剧烈,引起酶蛋白高级结构发生变化,回收率较低用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团,
1.氨基 -赖氨酸上的 ε -氨基以及多肽链 N末端氨基酸上的 α - 氨基 ;
2.羧基 -双羧基氨基酸,门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的 α - 羧基 ;
3.酪氨酸上的苯酚环 ;
4.半胱氨酸上的巯基 ;
5.羟基 -丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基
6.组氨酸上的咪唑基 ;
7.色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基为最常用对于共价偶联反应的选择一般应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性共价法的主要方法,
酰化反应芳化反应烷基化反应溴化氰法重氮化反应硅烷基化法
P450的固定化：
① 载体的制备：在分散剂的明胶悬浮体系中加入一定量的甲基丙烯酸羟乙酯、苯乙烯、二乙烯基苯和一定量的致孔剂进行悬浮聚合，用 ABIN做引发剂,70 ℃ 聚合数小时,80 ℃ 固化，
控制获得 0.05 mm~0.08mm的白色珠状球体，大量的蒸馏水洗涤，丙酮浸泡过夜，
然后用无水乙醇和去离子水洗涤烘干，
备用。
② 载体的活化：称取经蒸馏水充分洗涤过的载体，加入到 1.2 mol/L的 NaOH溶液中，浸泡 1 hr,然后加入一定量的环氧氯丙烷，
30 ℃ 下活化若干小时后取出，用大量的无菌水洗涤，真空泵抽出残存的环氧氯丙烷。活化反应原理如下：
③ 固定 P450：称取活化载体，加到含有纯化 P450
的 pH 7.5磷酸缓冲溶液中，将反应系统置于摇床上，
于 25 ℃ 和 80 rpm震荡条件下固定 P450一定时间时间取出后，用 pH 7.5的磷酸缓冲液充分洗涤载体，测定固定化 P450的稳定性。固定化反应原理如下,
分子自组装 (Molecular self- assembly)固定化分子自组装研究已取得了迅猛的发展，其利用活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成了稳定和有序的超分子体系，在该体系中，分子的组成、排列、取向和功能化等都以可控方式进行改变和操纵研究分子自组装是十分活跃的学科交叉研究领域,不仅可以提高酶活力与催化效率，而且有助于生物体组装与自组装行为的认识,也将推动分子生物学和酶工程进一步研究,
1.提取纯化繁琐,价格昂贵
2.难以重复使用
3.稳定性差克服游离酶缺点的方法,
1.人工合成酶使用有机合成以及聚合物化学中的最新技术来合成具有像酶那样活性的催化剂
P450化学酶化学合成氯合 5,10,15,20-四取代苯基卟吩和铁 Fe（ Ⅲ ）等化合物,以亚碘酰苯（ PhIO）为电子供体，可模拟
P450的催化反应。
2,酶的改性、修饰酶的固定化是其中一个重要方面凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶都称为固定化酶,通过适当方法制成的不溶于水的酶都能满足这一定义,
固定化酶的优点,
可连续重复使用稳定性高
11.1 酶的固定化方法酶的催化活性主要依赖于它的特殊的高级结构 -
---活性中心,因此在制备固定化酶时必需严格操作条件,尽可能避免酶的高级结构受损,
酶的固定化方法
1,吸附法
2,包埋法
3,交联法
4,化学共价法
5,酶的逆胶束包囊法
11.1.1 吸附法吸附法是将酶溶液与吸附剂表面接触就能达到吸附结合蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附,因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的,
酶的吸附剂各种矿物质以及无机载体 (氧化铝,氧化铁,氧化钛 ),纤维素粉最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素,DEAE----纤维素,DEAE----
葡萄糖,合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引,缺点是当离子强度增加或介质的 pH、温度变化时,
这种结合发生分解,
11.1.2 包埋法将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法为包埋法,
优点,普适性常用的格子型包埋法载体有,海藻酸盐,K-角叉菜,琼脂,三醋酸纤维素和聚丙烯酰胺凝胶,聚乙烯醇 (PVA)等一,海藻酸盐包埋法海藻酸钠与 Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒缺点,
在高浓度电介质（ K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定,
Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,
固定化颗粒溶解优点,
海藻酸盐价格便宜包埋条件温和二,角叉菜糖包埋法
K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物,在 K+离子存在下，它能立即生成凝胶,
缺点,
对高浓度的 Na+离子敏感固定化温度高,需要在 37℃ ~55℃
三,聚丙烯酰胺凝胶在含酶 (或细胞 )的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂 N,N’-甲撑双丙烯酰胺,然后在催化剂 (二甲氨基丙腈 )和引发剂 (过硫酸钾 )的作用下低温 (冰浴 )聚合,形成凝胶缺点,
丙烯酰胺对酶具有变性作用四,聚乙烯醇包埋法磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法硼酸硬化法,
将聚乙烯醇在 70℃ ~ 80℃ 进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至 35℃,与酶溶液 (细胞悬浮液 )混匀,滴加到饱和硼酸溶液中优点,
原材料价格便宜条件温和无毒害作用循环冷冻法硼酸硬化法
11.1.3 交联法交联法是利用双功能基团试剂或多功能基团试剂使酶分子间交联因而得到固定的方法,
交联剂,戊二醛,己撑二异醛,双重氮联苯胺和乙烯 -马来酸酐共聚物等戊二醛可直接参与酶蛋白的交联或者酶蛋白分子与其它惰性蛋白分子的交联,使形成酶的蛋白质聚结态,
缺点,
双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，
常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。
为了避免或减少酶在交联过程中失活，
可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白。
11.1.4 化学共价法共价法就是使非水溶性载体与酶以共价键的形式结合,
优点,
载体与酶结合牢固,半衰期较长缺点,
化学共价法结合时反应剧烈,引起酶蛋白高级结构发生变化,回收率较低用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团,
1.氨基 -赖氨酸上的 ε -氨基以及多肽链 N末端氨基酸上的 α - 氨基 ;
2.羧基 -双羧基氨基酸,门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的 α - 羧基 ;
3.酪氨酸上的苯酚环 ;
4.半胱氨酸上的巯基 ;
5.羟基 -丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基
6.组氨酸上的咪唑基 ;
7.色氨酸上的吲哚基其中以氨基和羧基为最常用对于共价偶联反应的选择一般应考虑到酶蛋白上供共价结合的功能基团必须不影响酶的催化活性共价法的主要方法,
酰化反应芳化反应烷基化反应溴化氰法重氮化反应硅烷基化法
P450的固定化：
① 载体的制备：在分散剂的明胶悬浮体系中加入一定量的甲基丙烯酸羟乙酯、苯乙烯、二乙烯基苯和一定量的致孔剂进行悬浮聚合，用 ABIN做引发剂,70 ℃ 聚合数小时,80 ℃ 固化，
控制获得 0.05 mm~0.08mm的白色珠状球体，大量的蒸馏水洗涤，丙酮浸泡过夜，
然后用无水乙醇和去离子水洗涤烘干，
备用。
② 载体的活化：称取经蒸馏水充分洗涤过的载体，加入到 1.2 mol/L的 NaOH溶液中，浸泡 1 hr,然后加入一定量的环氧氯丙烷，
30 ℃ 下活化若干小时后取出，用大量的无菌水洗涤，真空泵抽出残存的环氧氯丙烷。活化反应原理如下：
③ 固定 P450：称取活化载体，加到含有纯化 P450
的 pH 7.5磷酸缓冲溶液中，将反应系统置于摇床上，
于 25 ℃ 和 80 rpm震荡条件下固定 P450一定时间时间取出后，用 pH 7.5的磷酸缓冲液充分洗涤载体，测定固定化 P450的稳定性。固定化反应原理如下,
分子自组装 (Molecular self- assembly)固定化分子自组装研究已取得了迅猛的发展，其利用活性分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成了稳定和有序的超分子体系，在该体系中，分子的组成、排列、取向和功能化等都以可控方式进行改变和操纵研究分子自组装是十分活跃的学科交叉研究领域,不仅可以提高酶活力与催化效率，而且有助于生物体组装与自组装行为的认识,也将推动分子生物学和酶工程进一步研究,
