第一节 遗传变异的物质基础第二节 基因突变和诱变育种第三节 基因重组和杂交育种第四节 基因工程第五节 菌种的衰退、复壮和保藏第七章 微生物的遗传变异和育种几个概念
遗传 (heredity)
变异 (variation)
遗传型 (genotype)
表型 (phenotype)
饰变 (modification)
第一节 遗传变异的物质基础三个经典实验
转化实验
噬菌体的感染实验
病毒的拆开和重建实验
（一）转化实验
实验材料,Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae 的 几种形态
S型和 R型转化实验转化实验
从活的 S菌中抽提各种细胞成分（ DNA，蛋白质，
荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验
（二）噬菌体感染实验实验材料,E.coli噬菌体
（三）病毒的拆开和重建实验 (TMV和 HRV)
结 论
核酸是负载遗传信息的真正物质基础二、遗传物质在细胞中的存在方式
(一 ) 细胞水平
(二 ) 细胞核水平
(三 ) 染色体水平
(四 ) 核酸水平
(五 ) 基因水平
(六 ) 密码子水平
(七 ) 核苷酸水平核酸的七个水平遗传物质类型核基因组真核生物的原核生物的核外染色体真核生物的原核生物的细胞质基因线粒体叶绿体等共生生物
2um质粒等
F因子 (F质粒 )
R因子 (R质粒 )
Col质粒
Ti质粒巨大质粒降解性质粒等有核膜包裹的真核
(DNA+组蛋白 )
无核膜包裹的核区
(环状双链 DNA)
(二 ) 细胞核水平原核生物的质粒
1,质粒的定义
指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的 dsDNA分子，即
cccDNA(circular covalently closed DNA)。
2,特点
超螺旋结构；
携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；
某些质粒可与核染色体发生整合或脱离 — 附加体；
当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除，
如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；
具有重组的功能 — 质粒与质粒间、质粒与染色体之间；
有些质粒不表现任何功能 — 隐蔽性质粒；
3.质粒的种类按其复制与核染色体的复制是否同步严紧型质粒 (stringent replication plasmid)
松弛型复制控制质粒 (relaxed replication plasmid)
按其功能接合性质粒：如 F质粒抗药性质粒：如 R质粒产细菌素的质粒：如 Col质粒具有生理功能的质粒：如固氮的 mega质粒、降解质粒等产毒质粒：如 Ti质粒
4,典型质粒简介
1） F质粒 ( F plasmid )
是 E.coli 等细菌决定性别并有转移功能的质粒。
2） R质粒 ( R plasmid,resistance plasmid)
3） Col质粒 (col plasmid)
大肠杆菌素是一类由 E.coli某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由 Col质粒编码；
4） Ti质粒 (tumor inducing plasmid)
Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出 Ti质粒，其上的 T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。
致癌区
冠婴碱合成区
冠婴碱分解区
Ti质粒接合转移区 (tra)
毒性区 (vir)
DNA复制区 (rep)
6个功能区：
可遗传变异不可遗传变异 -----饰变基因突变染色体畸变生物的变异突变基因重组第二节 基因突变和诱变育种一、基因突变（ gene mutation）
（一）定义核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。
（二）基因突变的类型
基因突变的类型有哪些？
哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？
举例说明如何筛选抗性突变株？
突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型
（三）突变率
每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；
自发突变几率
一般在 10-6~10-9范围内；
突变率为 10-9的含义
抗性突变是最常见的突变类型；
细菌产生抗药性的途径
基因突变
抗药性质粒的转移
生理适应
由基因突变引起的抗药性的原因？
两种观点：
突变的性状与引起突变的原因间呈对应性 — 抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；
突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。
1.变量试验（ fluctuation test）
实验设计者
美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；
时间,1943年
实验材料：
对 T1噬菌体敏感的大肠杆菌
实验目的
验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系
实验过程
103/mL
24-36h
如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？
如何解释得到的实验结果？
噬菌体的作用？
实验结果讨论突变的发生在时间上是随机的
2.涂布试验（ Newcombe experiment）
实验设计者
1949年纽康布
实验材料
对 T1噬菌体敏感的大肠杆菌
采用固体平板培养
实验过程突变率的计算接种时每一平皿的细胞数,5× 104
培养 5h后每一平皿的细胞数：
5× 104 × 212.3（ 5100） = 2.6 × 108
6个平皿上共发现 28个突变菌落突变率 =突变的细胞数 /增加的细胞总数
=28/ 6 × （ 2.6 × 108 -5× 104） =1.8× 10-8
3.平板影印试验 （ replica plating）
实验设计者
1952年，美国的莱德伯格夫妇
实验材料
E.coli K12
实验过程
Lederberg 的平板培养法
（四）突变的特点
不对应性
自发性
稀有性
独立性
诱变性
稳定性
可逆性
(五 )基因突变及其机制突变诱变自发突变基因突变染色体畸变,缺失、添加、易位、倒位碱基置换移码突变转换颠换缺失添加
诱变剂,凡能显著提高突变频率的理化因子；
1） 碱基置换
转换（ transition）
嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换
颠换（ transversion）
嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换
1.诱发突变
直接引起置换的诱变剂
直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。
如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；
间接引起置换的诱变剂
通过活细胞的代谢活动掺入到 DNA分子中后引起的变化。
如：碱基类似物；
诱变剂种类
2）移码突变
DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；
诱变剂种类：
丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙,?-氨基丫啶等 ）
和 ICR类化合物；
3）染色体畸变
某些强烈理化因子，如电离辐射（ X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起 DNA分子的大片段损伤；
染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；
染色体数目的变化；
染色体的易位
转座
DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。
转座 (因 )子
IS 插入序列 (insertion sequence)
Tn 转座子 (transposon)
Mu 噬菌体 (mutator phage)
a b
a b
a b
2.自发突变 (spontaneous mutation)
1、由背景辐射和环境因素引起；
2、由微生物自身有害代谢物引起；
3、由 DNA复制过程中碱基配对错误引起等。
（六）紫外线对 DNA的损伤及其修复胞嘧啶水合物 胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶 胸腺嘧啶 -胞嘧啶二聚体
1,光复活作用
PRE
A-A
T=T
PRE
A-A
T=T
A-A
T-T
PRE
UV
可见光二聚体解离
PRE 光激活酶 (photoreactivating enzyme)
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T=T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T=T
5‘ 3‘
5‘3‘ OHP
A-A5‘ 3‘
5‘3‘ OHP
T=T
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
UV
酶 I
酶 II
酶 III
酶 IV
2,暗修复（切除修复）
酶 I—— 核酸内切酶酶 II—— 核酸外切酶酶 III—— DNA聚合酶酶 IV—— DNA连接酶
（一）自发突变与育种从生产中育种定向培育优良菌株
（二）诱变育种二、突变与育种指 利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，
以供科学试验或生产实践使用。
诱变育种的基本环节诱变育种的原则突变株的筛选方法产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选春日霉素产生菌的孢子悬液
诱变
涂布平板
培养 2天（ 29℃ ）
培养 4-5天 (29℃ )
生物鉴定板上含供试菌种
培养 17-18小时 (29℃ ）? 检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度产量突变株的筛选
抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选
(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基
基本培养基 (minimal midium,MM) — [-]
完全培养基 (complete medium,CM) — [+]
补充培养基 (supplemental medium,SM) — [A]
（ 2） 与营养缺陷型突变有关的菌体
野生型 (wild type) — 能在 [-]中生长
营养缺陷型 (auxotroph)— 能在 [+]或 [A]生长
原养型 (prototroph)— 能在 [-]中生长抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株 (出发菌株 )
诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿 逐个检出法影印接种法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法夹层培养法影印接种法营养缺陷型突变株的筛选方法
a b
c
[-]
[+]
(4)营养缺陷型的筛选举例 —— 枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出
（使细胞处于对数生长期）
（ UV照射 60s）
（调整细胞浓度为 108个 /ml）
（ 30度 CM中振荡过夜培养）
（青霉素法）
（生长谱法）
营养缺陷型突变株的筛选方法无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液（ 107-108/ml）
0.1ml
[— ]
.
[+]上生长的营养缺陷型培养营养缺陷型的鉴定 —— 生长谱法
作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；
作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；
用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；；
营养缺陷型突变株的应用
Ames test测定潜在化学治癌物理论依据
一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是 DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。
生物化学统一性法则
生物的,三致” （致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。
基本原理
Salmonella typhimurium 的 his-菌株在 [-]的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。
试验步骤：
可疑“三致”试样
+
鼠肝匀浆
S.t his- [-]
吸入滤纸片保温
S.t his+ [-]
阳性 阴性培养
1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了 0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。
2、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计一个具体实验方案。
3、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？
作业题
(gene recombination)
基因重组的定义
两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。
重组和杂交的关系
重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别
杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。
一、原核生物的基因重组
（一）转化（ transformation）
1,定义：
受体菌直接吸收供体菌的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。
2,能进行转化的微生物种类
Streptococcus pneumoniae ； Bacillus ；
Rhizobium ； Pseudomonas； Staphylococcus；
Saccharomyces cerevisiae； Neurospora
crassa； Aspergillus niger等。但肠道菌科的细菌如 E.coli等很难进行转化。
3.影响菌株间发生转化的因素
与它们在进化过程中的亲缘关系有关；
最易与细胞表面结合的是 dsDNA；
发生转化的细胞必须处于 感受态 ;
转化的频率低（ 0.1-1%，最高为 20%） ;
转化需要的 DNA浓度极低 ;
4.感受态（ competence）
指受体细胞最易接受外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态。
不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同
外界环境因子如环腺苷酸（ cAMP）和 Ca2+等可提高受体细胞的感受态水平。
调节感受态的是一类特异蛋白 — 感受态因子
dsDNA
供体（ strR） 感受态受体（ str
S）
同源区段配对单链整合，形成一小段杂合 DNA区段转化子（ strR） 非转化子（ strS）
复制与分离
5.转化过程
6.转染 (transfection)
用提纯的病毒核酸（ DNA或 RNA）去感染其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为 转染 。
1.定义
通过 完全缺陷 或 部分缺陷噬菌体 的媒介，把供体细胞的小片段 DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。
2.转导的种类
普遍转导
局限转导
（二）转导 (transduction)
通过极少数 完全缺陷噬菌体 对供体菌基因组上任何
DNA小片段的,误包”,而将其遗传性状传递给受体菌的现象；
一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；
可分为 完全普遍转导 和 流产普遍转导；
普遍转导 (generalized transduction)
完全普遍转导 ( generalized transduction)
供体受体
（ 2）流产普遍转导
外源 DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、
整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。
通过 部分缺陷的温和噬菌体 把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；
特点：
只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；
该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；
缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率（ -10-5）的误切；
需要通过 UV等因素对溶源菌的诱导；
分为低频转导和高频转导局限转导 (restricted transduction)
gal
dgal
1) 低频转导（ LFT）
部分缺陷噬菌体
以大肠杆菌?噬菌体为例
gal bio
正常切割不正常切割
bio
dbio
其频率为 10-4— 10-6
（ LFT裂解物）
E.coli K12gal -
少数 稳定的 gal+转导子低 m.o.i.
2) 高频转导（ HFT）
双重溶源菌（ double lysogen）
同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；
被紫外线等诱导时，正常的?噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如? dgal）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；
存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；
双重溶源菌产生的裂解物中含有 等量 的?和? dgal
粒子?HFT裂解物?低 m.o.i,? Ecoli,K12gal-
高频地把它转化成 稳定的 gal+转导子；
高 m.o.i,的 LFT裂解物?感染 Ecoli,K12gal-
低频转导和高频转导的异同点
相同点
只能转导供体菌的个别特定基因
该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带
不同点
低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子
高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染宿主，可获得较多的转导子。
当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因 噬菌体基因整合到宿主基因上，
而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称 溶源转变 。
溶源转变
（三）接合（ conjugation）
供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把 F质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。
能进行结合的微生物种类
主要在细菌和放线菌中存在；
研究得最清楚的是 E.coli；
E.coli有性别分化，决定 性别 的是一种质粒，
即 F因子 —— 是属于 附加体 的质粒。
根据 F因子 在细胞内的存在方式，将 E.coli分为四种类型：
F+ 菌株
含有游离的 F因子，在细胞表面还有性菌毛
F-菌株
不含 F因子,细胞表面没有性菌毛。
Hfr（高频重组）菌株
F因子整合在核染色体组特定位点上
F’菌株
Hfr菌株内的 F因子因不正常切离而脱离核染色体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基因的特殊 F因子?初生的 F’菌株大肠杆菌的四种类型
F质粒的 4种存在方式及相互关系大肠杆菌的接合方式
F+ × F-? F+ + F+
Hfr × F-? Hfr + F- （多数情况下）
Hfr × F-? Hfr + Hfr （少数情况下）
F’× F-? F’+ F’
F因子转导
以 F’质粒通过接合来传递供体基因的方式中断实验
（四）原生质体融合 (protoplast fusion)
通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。
能进行原生质体融合的细胞极其广泛
原核生物、真核生物、高等动植物、人体原生质体融合的主要步骤：
1 选择亲本
有特殊价值
有选择性遗传标记
2 获得原生质体
脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌）
3 原生质体融合
促融合剂 PEG(聚乙二醇 )或电脉冲
4 筛选稳定的融合子原生质体融合的主要步骤：
各种融合子长成菌落影印接种
[-]
检出 [A+B+] 筛选优良性状的融合子筛 选
[+]
原生质体融合的 特点
1.重组频率高
2.不受亲缘关系的影响
3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种
4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）
原生质体融合二、真核微生物的基因重组
基因重组的方式：有性杂交,准性杂交、原生质体融合和遗传转化；
（一）有性杂交
指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。
举例 — 酿酒酵母
酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱
面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强比较项目 双倍体 单倍体细胞菌落液体培养在产孢培养基上大，椭圆形大，形态均一繁殖较快，细胞较分散会形成子囊小，球形小，形态变化多繁殖较慢，细胞常聚集成团不形成子囊
S.cerevisiae的双倍体和单倍体的比较
准性生殖
是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且 不以减数分裂 的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。
准性生殖过程
菌丝联结 —— 频率低
形成异核体 —— 质配后两个单倍体核集中到同一细胞。
核融合 —— 异核体中的两个细胞核，低频率产生双倍体杂合子
体细胞染色体交换和单倍体化 — 双倍体杂合子不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核内的染色体会发生交换和单倍体化，从而形成具有新性状的单倍体杂合子。
（二）准性杂交比较项目 准性生殖 有性生殖参与接合的亲本细胞独立生活的异核体阶段接合后双倍体的细胞形态双倍体变为单倍体的途径接合发生的几率形态相同的体细胞有与单倍体基本相同有丝分裂偶然发现，几率低形态或生理上有分化的性细胞无与单倍体明显不同减数分裂正常出现，几率高准性生殖和有性生殖的比较准性杂交育种
选择亲本：营养缺陷型
强制异合：分生孢子相互混匀?[-]
移单菌落：长出的菌落接种到 [-]斜面
检验稳定性：夹层法
促进变异：诱变处理?增加新性状第四节 基因工程
一、基因工程的基本操作
目的基因的获得
载体的选择
目的基因与载体 DNA 的体外重组
重组载体导入受体细胞
重组受体细胞的筛选和鉴定
,工程菌,的大规模培养
二、基因工程的应用第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种保藏的原理
根据微生物的菌种生理、生化特性，在 人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。
复壮
狭义：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。
广义：在菌种衰退前，有意识地选择到自发的正变个体
衰退
菌种经过长期传代培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
二、菌种衰退与复壮三、防止菌种衰退的方法
控制传代次数
创造良好的培养条件
利用不易衰退的细胞传代
采用有效的菌种保藏方法四、菌种复壮的方法
纯种分离法
通过宿主体复壮
淘汰已衰退的个体
理化因素诱变
五、菌种的保藏方法
低温斜面保藏
液体石蜡保藏
砂土管保藏
真空冷冻干燥保藏中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM
普通微生物菌种保藏管理中心
中科院北微所（ AS）：真菌、细菌
武汉病毒所（ AS-IV）：病毒
农业微生物菌种
农科院土肥所（ ISF）
工业微生物菌种
食品发酵所（ IFFI）
抗生素菌种
医科院医药生物技术所（ IA）
四川抗研所（ SIA）：新抗菌种
遗传 (heredity)
变异 (variation)
遗传型 (genotype)
表型 (phenotype)
饰变 (modification)
第一节 遗传变异的物质基础三个经典实验
转化实验
噬菌体的感染实验
病毒的拆开和重建实验
（一）转化实验
实验材料,Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae 的 几种形态
S型和 R型转化实验转化实验
从活的 S菌中抽提各种细胞成分（ DNA，蛋白质，
荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验
（二）噬菌体感染实验实验材料,E.coli噬菌体
（三）病毒的拆开和重建实验 (TMV和 HRV)
结 论
核酸是负载遗传信息的真正物质基础二、遗传物质在细胞中的存在方式
(一 ) 细胞水平
(二 ) 细胞核水平
(三 ) 染色体水平
(四 ) 核酸水平
(五 ) 基因水平
(六 ) 密码子水平
(七 ) 核苷酸水平核酸的七个水平遗传物质类型核基因组真核生物的原核生物的核外染色体真核生物的原核生物的细胞质基因线粒体叶绿体等共生生物
2um质粒等
F因子 (F质粒 )
R因子 (R质粒 )
Col质粒
Ti质粒巨大质粒降解性质粒等有核膜包裹的真核
(DNA+组蛋白 )
无核膜包裹的核区
(环状双链 DNA)
(二 ) 细胞核水平原核生物的质粒
1,质粒的定义
指游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的 dsDNA分子，即
cccDNA(circular covalently closed DNA)。
2,特点
超螺旋结构；
携带某些特殊功能的基因（核基因组上所缺少），如具有接合、产毒、抗药、固氮或降解环境毒物功能的基因；
某些质粒可与核染色体发生整合或脱离 — 附加体；
当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除，
如丫啶类染料、丝裂霉素、紫外线或高温等因素；
具有重组的功能 — 质粒与质粒间、质粒与染色体之间；
有些质粒不表现任何功能 — 隐蔽性质粒；
3.质粒的种类按其复制与核染色体的复制是否同步严紧型质粒 (stringent replication plasmid)
松弛型复制控制质粒 (relaxed replication plasmid)
按其功能接合性质粒：如 F质粒抗药性质粒：如 R质粒产细菌素的质粒：如 Col质粒具有生理功能的质粒：如固氮的 mega质粒、降解质粒等产毒质粒：如 Ti质粒
4,典型质粒简介
1） F质粒 ( F plasmid )
是 E.coli 等细菌决定性别并有转移功能的质粒。
2） R质粒 ( R plasmid,resistance plasmid)
3） Col质粒 (col plasmid)
大肠杆菌素是一类由 E.coli某些菌株所产生的细菌素，具有通过复制、转录、转译或能量代谢等方式而专一性地杀死它种肠道菌或同种其他菌株的能力，由 Col质粒编码；
4） Ti质粒 (tumor inducing plasmid)
Agrobacterium tumefaciens（根癌土壤杆菌）从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出 Ti质粒，其上的 T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。
致癌区
冠婴碱合成区
冠婴碱分解区
Ti质粒接合转移区 (tra)
毒性区 (vir)
DNA复制区 (rep)
6个功能区：
可遗传变异不可遗传变异 -----饰变基因突变染色体畸变生物的变异突变基因重组第二节 基因突变和诱变育种一、基因突变（ gene mutation）
（一）定义核酸上一对或几对碱基突然发生的可遗传的变化。
（二）基因突变的类型
基因突变的类型有哪些？
哪些突变型是选择性突变株？哪些是非选择性突变株？为什么？
举例说明如何筛选抗性突变株？
突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型
（三）突变率
每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；
自发突变几率
一般在 10-6~10-9范围内；
突变率为 10-9的含义
抗性突变是最常见的突变类型；
细菌产生抗药性的途径
基因突变
抗药性质粒的转移
生理适应
由基因突变引起的抗药性的原因？
两种观点：
突变的性状与引起突变的原因间呈对应性 — 抗性突变株的产生是由环境因素诱发出来的，属定向变异；
突变是自发产生的，与环境是否存在该物质无关。
1.变量试验（ fluctuation test）
实验设计者
美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；
时间,1943年
实验材料：
对 T1噬菌体敏感的大肠杆菌
实验目的
验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系
实验过程
103/mL
24-36h
如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？
如何解释得到的实验结果？
噬菌体的作用？
实验结果讨论突变的发生在时间上是随机的
2.涂布试验（ Newcombe experiment）
实验设计者
1949年纽康布
实验材料
对 T1噬菌体敏感的大肠杆菌
采用固体平板培养
实验过程突变率的计算接种时每一平皿的细胞数,5× 104
培养 5h后每一平皿的细胞数：
5× 104 × 212.3（ 5100） = 2.6 × 108
6个平皿上共发现 28个突变菌落突变率 =突变的细胞数 /增加的细胞总数
=28/ 6 × （ 2.6 × 108 -5× 104） =1.8× 10-8
3.平板影印试验 （ replica plating）
实验设计者
1952年，美国的莱德伯格夫妇
实验材料
E.coli K12
实验过程
Lederberg 的平板培养法
（四）突变的特点
不对应性
自发性
稀有性
独立性
诱变性
稳定性
可逆性
(五 )基因突变及其机制突变诱变自发突变基因突变染色体畸变,缺失、添加、易位、倒位碱基置换移码突变转换颠换缺失添加
诱变剂,凡能显著提高突变频率的理化因子；
1） 碱基置换
转换（ transition）
嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换
颠换（ transversion）
嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换
1.诱发突变
直接引起置换的诱变剂
直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。
如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；
间接引起置换的诱变剂
通过活细胞的代谢活动掺入到 DNA分子中后引起的变化。
如：碱基类似物；
诱变剂种类
2）移码突变
DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；
诱变剂种类：
丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙,?-氨基丫啶等 ）
和 ICR类化合物；
3）染色体畸变
某些强烈理化因子，如电离辐射（ X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起 DNA分子的大片段损伤；
染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；
染色体数目的变化；
染色体的易位
转座
DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。
转座 (因 )子
IS 插入序列 (insertion sequence)
Tn 转座子 (transposon)
Mu 噬菌体 (mutator phage)
a b
a b
a b
2.自发突变 (spontaneous mutation)
1、由背景辐射和环境因素引起；
2、由微生物自身有害代谢物引起；
3、由 DNA复制过程中碱基配对错误引起等。
（六）紫外线对 DNA的损伤及其修复胞嘧啶水合物 胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶 胸腺嘧啶 -胞嘧啶二聚体
1,光复活作用
PRE
A-A
T=T
PRE
A-A
T=T
A-A
T-T
PRE
UV
可见光二聚体解离
PRE 光激活酶 (photoreactivating enzyme)
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T=T
5‘ 3‘
5‘3‘
A-A
T=T
5‘ 3‘
5‘3‘ OHP
A-A5‘ 3‘
5‘3‘ OHP
T=T
A-A
T-T
5‘ 3‘
5‘3‘
UV
酶 I
酶 II
酶 III
酶 IV
2,暗修复（切除修复）
酶 I—— 核酸内切酶酶 II—— 核酸外切酶酶 III—— DNA聚合酶酶 IV—— DNA连接酶
（一）自发突变与育种从生产中育种定向培育优良菌株
（二）诱变育种二、突变与育种指 利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，
以供科学试验或生产实践使用。
诱变育种的基本环节诱变育种的原则突变株的筛选方法产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选春日霉素产生菌的孢子悬液
诱变
涂布平板
培养 2天（ 29℃ ）
培养 4-5天 (29℃ )
生物鉴定板上含供试菌种
培养 17-18小时 (29℃ ）? 检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度产量突变株的筛选
抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选
(1)与筛选营养缺陷型有关的三类培养基
基本培养基 (minimal midium,MM) — [-]
完全培养基 (complete medium,CM) — [+]
补充培养基 (supplemental medium,SM) — [A]
（ 2） 与营养缺陷型突变有关的菌体
野生型 (wild type) — 能在 [-]中生长
营养缺陷型 (auxotroph)— 能在 [+]或 [A]生长
原养型 (prototroph)— 能在 [-]中生长抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株 (出发菌株 )
诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿 逐个检出法影印接种法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法夹层培养法影印接种法营养缺陷型突变株的筛选方法
a b
c
[-]
[+]
(4)营养缺陷型的筛选举例 —— 枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出
（使细胞处于对数生长期）
（ UV照射 60s）
（调整细胞浓度为 108个 /ml）
（ 30度 CM中振荡过夜培养）
（青霉素法）
（生长谱法）
营养缺陷型突变株的筛选方法无菌水洗下离心清洗后配成菌悬液（ 107-108/ml）
0.1ml
[— ]
.
[+]上生长的营养缺陷型培养营养缺陷型的鉴定 —— 生长谱法
作为研究代谢途径和基因重组等遗传规律的标记菌种；
作为氨基酸、维生素或碱基等物质生物测定的试验菌种；
用作发酵生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株；；
营养缺陷型突变株的应用
Ames test测定潜在化学治癌物理论依据
一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是 DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。
生物化学统一性法则
生物的,三致” （致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。
基本原理
Salmonella typhimurium 的 his-菌株在 [-]的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。
试验步骤：
可疑“三致”试样
+
鼠肝匀浆
S.t his- [-]
吸入滤纸片保温
S.t his+ [-]
阳性 阴性培养
1、某突变菌株在基本培养基上无法生长，而在添加了 0.1%碱水解酵母核酸后，该菌株能生长。请设计一实验方案以进一步确定该菌株的生长必需物。
2、什么叫做营养缺陷型菌株?在实验室中如何从原养型菌株获得营养缺陷型菌株?请设计一个具体实验方案。
3、怎样用实验证明突变是自发产生的，而不是受环境诱导产生的？
作业题
(gene recombination)
基因重组的定义
两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。
重组和杂交的关系
重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别
杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。
一、原核生物的基因重组
（一）转化（ transformation）
1,定义：
受体菌直接吸收供体菌的 DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。
2,能进行转化的微生物种类
Streptococcus pneumoniae ； Bacillus ；
Rhizobium ； Pseudomonas； Staphylococcus；
Saccharomyces cerevisiae； Neurospora
crassa； Aspergillus niger等。但肠道菌科的细菌如 E.coli等很难进行转化。
3.影响菌株间发生转化的因素
与它们在进化过程中的亲缘关系有关；
最易与细胞表面结合的是 dsDNA；
发生转化的细胞必须处于 感受态 ;
转化的频率低（ 0.1-1%，最高为 20%） ;
转化需要的 DNA浓度极低 ;
4.感受态（ competence）
指受体细胞最易接受外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态。
不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同
外界环境因子如环腺苷酸（ cAMP）和 Ca2+等可提高受体细胞的感受态水平。
调节感受态的是一类特异蛋白 — 感受态因子
dsDNA
供体（ strR） 感受态受体（ str
S）
同源区段配对单链整合，形成一小段杂合 DNA区段转化子（ strR） 非转化子（ strS）
复制与分离
5.转化过程
6.转染 (transfection)
用提纯的病毒核酸（ DNA或 RNA）去感染其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为 转染 。
1.定义
通过 完全缺陷 或 部分缺陷噬菌体 的媒介，把供体细胞的小片段 DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。
2.转导的种类
普遍转导
局限转导
（二）转导 (transduction)
通过极少数 完全缺陷噬菌体 对供体菌基因组上任何
DNA小片段的,误包”,而将其遗传性状传递给受体菌的现象；
一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；
可分为 完全普遍转导 和 流产普遍转导；
普遍转导 (generalized transduction)
完全普遍转导 ( generalized transduction)
供体受体
（ 2）流产普遍转导
外源 DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、
整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。
通过 部分缺陷的温和噬菌体 把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；
特点：
只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；
该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；
缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率（ -10-5）的误切；
需要通过 UV等因素对溶源菌的诱导；
分为低频转导和高频转导局限转导 (restricted transduction)
gal
dgal
1) 低频转导（ LFT）
部分缺陷噬菌体
以大肠杆菌?噬菌体为例
gal bio
正常切割不正常切割
bio
dbio
其频率为 10-4— 10-6
（ LFT裂解物）
E.coli K12gal -
少数 稳定的 gal+转导子低 m.o.i.
2) 高频转导（ HFT）
双重溶源菌（ double lysogen）
同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；
被紫外线等诱导时，正常的?噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如? dgal）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；
存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；
双重溶源菌产生的裂解物中含有 等量 的?和? dgal
粒子?HFT裂解物?低 m.o.i,? Ecoli,K12gal-
高频地把它转化成 稳定的 gal+转导子；
高 m.o.i,的 LFT裂解物?感染 Ecoli,K12gal-
低频转导和高频转导的异同点
相同点
只能转导供体菌的个别特定基因
该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带
不同点
低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子
高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染宿主，可获得较多的转导子。
当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因 噬菌体基因整合到宿主基因上，
而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称 溶源转变 。
溶源转变
（三）接合（ conjugation）
供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把 F质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。
能进行结合的微生物种类
主要在细菌和放线菌中存在；
研究得最清楚的是 E.coli；
E.coli有性别分化，决定 性别 的是一种质粒，
即 F因子 —— 是属于 附加体 的质粒。
根据 F因子 在细胞内的存在方式，将 E.coli分为四种类型：
F+ 菌株
含有游离的 F因子，在细胞表面还有性菌毛
F-菌株
不含 F因子,细胞表面没有性菌毛。
Hfr（高频重组）菌株
F因子整合在核染色体组特定位点上
F’菌株
Hfr菌株内的 F因子因不正常切离而脱离核染色体组时形成的游离的但携带一小段核染色体基因的特殊 F因子?初生的 F’菌株大肠杆菌的四种类型
F质粒的 4种存在方式及相互关系大肠杆菌的接合方式
F+ × F-? F+ + F+
Hfr × F-? Hfr + F- （多数情况下）
Hfr × F-? Hfr + Hfr （少数情况下）
F’× F-? F’+ F’
F因子转导
以 F’质粒通过接合来传递供体基因的方式中断实验
（四）原生质体融合 (protoplast fusion)
通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。
能进行原生质体融合的细胞极其广泛
原核生物、真核生物、高等动植物、人体原生质体融合的主要步骤：
1 选择亲本
有特殊价值
有选择性遗传标记
2 获得原生质体
脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌）
3 原生质体融合
促融合剂 PEG(聚乙二醇 )或电脉冲
4 筛选稳定的融合子原生质体融合的主要步骤：
各种融合子长成菌落影印接种
[-]
检出 [A+B+] 筛选优良性状的融合子筛 选
[+]
原生质体融合的 特点
1.重组频率高
2.不受亲缘关系的影响
3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种
4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）
原生质体融合二、真核微生物的基因重组
基因重组的方式：有性杂交,准性杂交、原生质体融合和遗传转化；
（一）有性杂交
指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。
举例 — 酿酒酵母
酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱
面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强比较项目 双倍体 单倍体细胞菌落液体培养在产孢培养基上大，椭圆形大，形态均一繁殖较快，细胞较分散会形成子囊小，球形小，形态变化多繁殖较慢，细胞常聚集成团不形成子囊
S.cerevisiae的双倍体和单倍体的比较
准性生殖
是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且 不以减数分裂 的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。
准性生殖过程
菌丝联结 —— 频率低
形成异核体 —— 质配后两个单倍体核集中到同一细胞。
核融合 —— 异核体中的两个细胞核，低频率产生双倍体杂合子
体细胞染色体交换和单倍体化 — 双倍体杂合子不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核内的染色体会发生交换和单倍体化，从而形成具有新性状的单倍体杂合子。
（二）准性杂交比较项目 准性生殖 有性生殖参与接合的亲本细胞独立生活的异核体阶段接合后双倍体的细胞形态双倍体变为单倍体的途径接合发生的几率形态相同的体细胞有与单倍体基本相同有丝分裂偶然发现，几率低形态或生理上有分化的性细胞无与单倍体明显不同减数分裂正常出现，几率高准性生殖和有性生殖的比较准性杂交育种
选择亲本：营养缺陷型
强制异合：分生孢子相互混匀?[-]
移单菌落：长出的菌落接种到 [-]斜面
检验稳定性：夹层法
促进变异：诱变处理?增加新性状第四节 基因工程
一、基因工程的基本操作
目的基因的获得
载体的选择
目的基因与载体 DNA 的体外重组
重组载体导入受体细胞
重组受体细胞的筛选和鉴定
,工程菌,的大规模培养
二、基因工程的应用第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种保藏的原理
根据微生物的菌种生理、生化特性，在 人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。
复壮
狭义：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。
广义：在菌种衰退前，有意识地选择到自发的正变个体
衰退
菌种经过长期传代培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。
二、菌种衰退与复壮三、防止菌种衰退的方法
控制传代次数
创造良好的培养条件
利用不易衰退的细胞传代
采用有效的菌种保藏方法四、菌种复壮的方法
纯种分离法
通过宿主体复壮
淘汰已衰退的个体
理化因素诱变
五、菌种的保藏方法
低温斜面保藏
液体石蜡保藏
砂土管保藏
真空冷冻干燥保藏中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM
普通微生物菌种保藏管理中心
中科院北微所（ AS）：真菌、细菌
武汉病毒所（ AS-IV）：病毒
农业微生物菌种
农科院土肥所（ ISF）
工业微生物菌种
食品发酵所（ IFFI）
抗生素菌种
医科院医药生物技术所（ IA）
四川抗研所（ SIA）：新抗菌种
