第一节 测定生长繁殖的方法第二节 微生物的生长规律第三节 影响微生物生长的主要因素第四节 微生物培养法概论第五节 有害微生物的控制第六章 微生物的生长及其控制
Microbial Growth and Control
第一节 测定生长繁殖的方法一,测生长量二,计繁殖数
1,直接法 测体积法 (粗放 )称干重法 (精确 )
2,间接法 比浊法：分光光度法 (OD)生理指标法：测含氮量
1,直接法,用血球计数板在显微镜下进行计数二,计繁殖数
2,间接法,用平板菌落进行的活菌计数菌数 /mL = cfu X 稀释度 X 10
第二节 微生物的生长规律一,微生物的个体生长和同步生长三,微生物的连续培养方法二,微生物的典型生长曲线一,微生物的个体生长和同步生长
同步生长
通过 同步培养 的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；
获得同步生长的方法
环境条件诱导法
机械筛选法二、微生物的典型生长曲线 (growth curve)
生长曲线：
当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，
在适宜的温度、通气等体积下，
该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如果以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标就可画出一条曲线 —— 微生物的典型生长曲线。
培养时间 (h)
I 延滞期 II 指数期 III 稳定期 IV 衰亡期
0
生长速度总菌数活菌数
I II III IV
lg细胞数
(个 /ml)
二、微生物的典型生长曲线 (growth curve)
Ⅰ 延滞期 (lag phase)
⑤ 对外界不良条件例如 NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。
指少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。
① 生长速率常数 R等于零。
② 细胞形态变大或增长。
③ 细胞内 RNA尤其是 rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。
④ 合成代谢活跃，核糖体、酶类和 ATP的合成加快，易产生诱导酶。
影响延滞期长短的因素
（ 1）接种龄
（ 2）接种量
（ 3）培养基成分
Ⅰ 延滞期 (lag phase)
出现延滞期的原因？
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的 时期。
① 生长速率常数 R最大，代时 G最短；
② 整个群体的生理特性较一致；
④ 酶系活跃，代谢旺盛。
③ 细胞各成分平衡增长，生长速率恒定；
三个重要参数
（ 1）繁殖代数 (n)
（ 2）生长速率常数 (R)
（ 3）代时 (G)
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
G = (t2-t1) / n
= (t2-t1) / 3.322(lgX2-lgX1)
R = 1 /G
= 3.322 (lgX2-lgX1) / (t2-t1)
X2 = X1 ·2n 两边取对数：
lgX2 = lgX1 + nlg2 （ lg2 =0.301）
n = 3.322 ( lgX2 - lgX1)
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
x2
x1
t1 t2
影响代时长短的因素
（ 1）菌种
（ 2）营养成分
（ 3）营养物浓度
（ 4）培养温度 时间
8.0mg/ml
6.0mg/ml
4.0mg/ml
2.0mg/ml
1.0mg/ml
0.5mg/ml
0.2mg/ml
营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
Ⅲ 稳定期 (stationary phase)
① 生长速率常数 R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；
② 菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数 Y表示；
Y = (X-X0) / C0-C
= (X-X0) / C0
X,稳定期的细胞干重 (g/ml培养液）
X0,刚接种时的细胞干重
C0,限制性营养物的最初浓度 (g/ml)
C,稳定时期限制性营养物的浓度
③ 通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；
① 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物 (SCP、乳酸 )等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：
② 是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；
稳定期的实践意义
IV 衰亡期 (death phase)
微生物个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态；
细胞形态发生变化，出现畸形；
有的发生自溶；
有的合成或释放次生代谢产物；
芽孢此期释放；
三,微生物的连续培养方法稳定期到来的主要原因？
营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
有害代谢产物的累计；
理化条件的不适宜等；
是一种根据培养器内 微生物的生长密度,并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；
主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。
1,恒浊器 (turbidostat)
2、恒化器 (chemostat)
是一种设法使 培养液的流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；
主要获得不同生长速率的菌体；
恒浊与恒化培养控制装置装置 恒浊器 恒化器控制对象 菌体密度 (内控制 ) 培养基流速 (外控制 )
培养基 无限制生长因子 有限制生长因子培养基流速 不恒定 恒定生长速率 最高速率 低于最高速率产物 大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围 生产为主 实验室为主
Turbidostat & chemostat的比较分批培养与连续培养的比较连续培养的优缺点
优点
高效
自控
产品质量稳定
节约动力、人力、水和蒸汽等
缺点
菌种容易退化
容易污染杂菌
营养物的利用率低于单批培养微生物的高密度培养
指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养 10倍以上的生长状态或培养技术；
目前由于研究的微生物种类主要局限于
E.coli and S.cerevisiae 等兼性厌氧菌；
第三节 影响微生物生长的主要因素一,温度二,氧气三,pH值一,温度 (temperature)
嗜冷菌 (<20oC)
嗜温菌 (20-45oC)
嗜热菌 (50-60oC)
嗜高温菌 (80-95oC)
极端高温菌 (105-150oC)
根据温度对微生物的影响分类
Thermophile and Biotechnology
来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应；
其中由 Thermus aquaticus 中分离出来的 DNA 聚合酶，
Taq polymerase,已广泛应用于 PCR反应；
分离自 Pyrocuccus furiosus 的 pfu polymerase应用于
PCR反应更加稳定，而且错误率更低；
二,氧气 (oxygen)
好氧菌
(Aerobes)
1.专性好氧菌 (obligate aerobes)
必须有氧存在
2.兼性好氧菌 (facultative aerobes)
有氧无氧均可，但有氧更好
3.微好氧菌 (microaerophilic aerobes)
只在较低的氧分压下生长厌氧菌
(anaerobes)
4,耐氧菌 (aerotolerant anaerobes)
不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害
5,专性厌氧菌 (obligate/strict anaerobes)
氧有毒害，甚至致死微生物与氧的关系厌氧菌的氧毒害机制厌氧菌体内无 SOD(超氧化物歧化酶 )，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。
去除 ·O2-等有害活性氧分子的机制
H2O+1/2O2
2H2O
2·O2-+2H+ H2O2+O2SOD
一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物
NADH2 NAD
过氧化物酶耐氧菌三,pH值嗜碱微生物（ basophile）
多数放线菌、硝化细菌、根瘤菌等耐碱微生物（ basotolerant microorganism）
若干链霉菌
嗜酸微生物（ acidophile）
多数真菌
耐酸微生物 (acidotolerant microorganism)
乳酸杆菌、醋酸杆菌，许多肠杆菌等第四节 微生物培养方法概论微生物培养方法生产实践实验室培养法固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养
1、好氧菌的实验室培养固体培养试管斜面培养皿琼脂平板液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养（振荡培养）
台式发酵罐培养
2、厌氧菌的实验室培养高层琼脂柱
Hungate 滚管厌氧罐技术厌氧手套箱第五节 有害微生物的控制一,几个基本概念
1、灭菌 (sterilization)
采用 强烈的理化因素 使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。
总菌数活菌数细胞数的对数细胞数的对数时间 时间杀菌 溶菌
2、消毒 (disinfection)
消毒是一种采用 较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。
举例：
一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；
对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法等；
3、防腐 (antisepsis)
防腐就是利用某种理化因素完全 抑制 霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。
防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂
4、化学治疗 (chemotherapy)
它是利用具有高度选择毒力（ selective toxicity，
即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来 抑制 宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。
用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂；
一些重要的化学治疗剂种类：
各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等比较项目 灭菌 消毒 防腐 化疗处理因素 强理、化因素 理、化因素 理、化因素 化学治疗剂处理对象 任何物体内外的一切微生物物体表面的病原菌物体内外的一切微生物宿主体内的病原菌作用效果 彻底杀灭 杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，
辐射灭菌，杀菌剂
70%酒精消毒，
巴氏消毒法冷藏、干燥、
糖渍、盐腌、
缺氧、防腐剂抗生素、磺胺药、生物药物素灭菌、消毒、防腐和化疗的比较
（一）物理方法 ——高温杀菌高温灭菌干热灭菌法 火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法湿热灭菌
(消毒 )法常压下加压下巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法常规加压灭菌法连续加压灭菌法
LTH法
HTST法烘箱内热空气灭菌法
150~170℃ 1~2h 彻底杀灭细菌；
适用于金属和玻璃器皿的灭菌；
火焰灼烧法
仅适用于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、
动物尸体的烧毁等。
干热灭菌法
1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；
2、热蒸汽比热空气穿透力更强；
3、蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；
4、可迅速提高灭菌物体的温度。
相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好；
湿热灭菌法比较项目 干热 90 ℃ 90 ℃ 相对湿度
20% 80%
白喉棒杆菌 24 h 2 h 2 min
痢疾杆菌 3 h 2 h 2 min
伤寒杆菌 3 h 2 h 2 min
葡萄球菌 8 h 3 h 2 min
干热与湿热空气对不同细胞的致死时间巴氏消毒法一种低温湿热消毒法。
低温维持法 (Low temperature holding method,LTH)
63℃ 30min
高温瞬时法 (High temperature short time,HTST)
72℃ 15s
巴氏消毒法间歇灭菌法 (fractional sterilization)
80~100℃ 15~60 min 杀灭所有微生物的营养体；
37℃ 或室温保温过夜，诱发芽孢萌发为营养体；
重复上述步骤三次，在较低的灭菌温度下彻底灭菌；
适用于不耐热培养基的灭菌。
高压蒸汽灭菌法
121℃ ； 15-20 min； 1kg/cm2
是被广泛使用的方法；
高压蒸汽灭菌锅构造
1、压力表
2、安全阀
3、放气阀
4、软管
5、紧固螺栓
6、灭菌桶
7、筛架
8、水手提式高压蒸汽灭菌锅
1、加水至止水线；
2、灭菌物品包裹好；
3、开启放气阀；
4、加热排气；
5、达到预定表压，开始计时；
6、关闭热源，当压力降至
0.05MPa时，缓慢开启放气阀。
高压蒸汽灭菌锅使用方法
4、过滤
1、低温冷藏法冷冻法
2、辐射：紫外线、电离辐射和强可见光等
3、干燥和渗透压（高渗）
其他物理控制方法过滤除菌
（二） 化学方法杀菌
1,表面消毒剂 (surface disinfactant)
是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。
类型 名称及使用浓度 作用机制 应用范围醇类 70-75%乙醇 使膜损伤、蛋白质变性皮肤、器械醛类 0.5-10%甲醛 破坏蛋白质氢键或氨基物品消毒，接种箱、
接种室的熏蒸酚类 3-5%石炭酸 蛋白质变性，损伤细胞膜地面、家具、器皿表面活性剂类
0.05-0.1%新洁而灭 蛋白质变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、手术器械染料 2-4%龙胆紫 与蛋白质羧基结合 皮肤、伤口氧化剂类 0.1%高锰酸钾 氧化蛋白质的活性基团皮肤、尿道
3%双氧水 污染物件表面重金属类 2%红汞 与蛋白质的巯基结合使失活皮肤、伤口
0.1-0.5%硫酸铜 植物病原菌酸碱类 5-10%醋酸 破坏细胞膜和蛋白质房间消毒常用表面消毒剂及应用影响消毒剂作用的因素消毒剂 种类浓度作用时间细菌菌龄种类环境有机物温度酸碱度
是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性的化学药剂；
根据来源分为两类：
人工合成 (主要是一些生长因子类似物 )
磺胺类药物 ；
微生物产生
抗生素
2,化学治疗剂 (chemotherapeutant)
（ 1）磺胺类药物 — 生长因子类似物是第一个发现的生长因子类似物药物；
也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂。
对氨基苯甲酸（ PABA）
(正常代谢物）
磺胺
(代谢物拮抗物）
磺胺类药物的杀菌机制 — PABA代谢类似物二氢叶酸二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶 F
核酸合成细菌体内合成叶酸二氢蝶啶 二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶
PABA Glu
二氢叶酸二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶 F
核酸合成磺胺药
TMP
TMP(三甲基苄二氨嘧啶 )
——磺胺增效剂细菌体内叶酸合成受阻二氢蝶啶 二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶
PABA 假二氢叶酸
（ 2）抗生素 (antibiotics)
一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰他种生物（包括病原菌、病毒和癌细胞等 )的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂；
目前在临床上应用的抗生素仅五六十种。
抗生素的抗菌谱由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，
抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱。
抗生素的作用机制
抑制细胞壁合成；
干扰细胞膜的功能；
抑制蛋白质的合成；
抑制核酸的合成；
1.抑制细胞壁合成青霉素万古霉素杆菌肽头孢菌素环丝氨酸
TMP
磺胺药
PAPB
细胞膜多粘菌素短杆菌肽链霉素卡那霉素四环素
3.抑制蛋白质合成红霉素氯霉素
2,抑制 RNA合成
2.抑制 DNA解旋酶诺氟沙星新生霉素主要抗生素和化学治疗剂的作用模型利福霉素利福平
3.抑制蛋白质合成
4,干扰细胞膜合成
5.抑制细胞代谢微生物的抗药性抗药性主要通过遗传途径产生，如基因突变、遗传重组或质粒转移等。
1、产生一种能使药物失去活性的酶；
2、把药物作用的靶位加以修饰；
3、形成“救护途径”；
4、使药物不能透过细胞膜；
5、通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。
微生物产生抗药性的原因如何解决微生物的抗药性问题？
筛选新的抗生素；
对天然抗生素的结构进行改造；
寻找比抗生素疗效更为广泛的生理活性产物；
生物药物素,具有多种生理活性的微生物次生代谢物；
酶抑制剂免疫调节剂受体拮抗剂抗氧化剂解决方法
在微生物的培养过程中，如果要缩短其生长的延迟期，可以在菌种、培养基和其它方面采取哪些措施?
细菌生长曲线分哪几个时期？各时期有何特征及在工业发酵中的应用。
单细胞微生物的群体生长规律常分为哪四个时期？各有何特点？
辨析题：分批培养时，细菌首先经历一个适应期，此期间细胞处于代谢活动的低潮，所以细胞数目并不增加。
思考题
在微生物培养过程中，引起 pH改变的原因有哪些？在实践中如何保证微生物处于较稳定和合适的 pH环境中？
根据下图中五类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态，分别写出它们的名称思考题思考题
推导在细胞的指数增长阶段细胞的传代时间 G可由下式计算：
G=t·lg2/(lgXt-lgX0) ； t为时间,Xt为 t时刻的细胞数,X0为初始细胞数。
好氧微生物液体培养主要有哪些形式？它们各自有哪些用途和特点？
消毒和灭菌的概念有何不同？实验室常用消毒和灭菌的方法有那些？分别指出灭菌原理、优缺点、涉及仪器的简述操作步骤及注意事项。
请比较青霉素和溶菌酶在制备细菌原生质体中的作用原理。
思考题
Microbial Growth and Control
第一节 测定生长繁殖的方法一,测生长量二,计繁殖数
1,直接法 测体积法 (粗放 )称干重法 (精确 )
2,间接法 比浊法：分光光度法 (OD)生理指标法：测含氮量
1,直接法,用血球计数板在显微镜下进行计数二,计繁殖数
2,间接法,用平板菌落进行的活菌计数菌数 /mL = cfu X 稀释度 X 10
第二节 微生物的生长规律一,微生物的个体生长和同步生长三,微生物的连续培养方法二,微生物的典型生长曲线一,微生物的个体生长和同步生长
同步生长
通过 同步培养 的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态；
获得同步生长的方法
环境条件诱导法
机械筛选法二、微生物的典型生长曲线 (growth curve)
生长曲线：
当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中后，
在适宜的温度、通气等体积下，
该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如果以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标就可画出一条曲线 —— 微生物的典型生长曲线。
培养时间 (h)
I 延滞期 II 指数期 III 稳定期 IV 衰亡期
0
生长速度总菌数活菌数
I II III IV
lg细胞数
(个 /ml)
二、微生物的典型生长曲线 (growth curve)
Ⅰ 延滞期 (lag phase)
⑤ 对外界不良条件例如 NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学药物的反应敏感。
指少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。
① 生长速率常数 R等于零。
② 细胞形态变大或增长。
③ 细胞内 RNA尤其是 rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。
④ 合成代谢活跃，核糖体、酶类和 ATP的合成加快，易产生诱导酶。
影响延滞期长短的因素
（ 1）接种龄
（ 2）接种量
（ 3）培养基成分
Ⅰ 延滞期 (lag phase)
出现延滞期的原因？
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的 时期。
① 生长速率常数 R最大，代时 G最短；
② 整个群体的生理特性较一致；
④ 酶系活跃，代谢旺盛。
③ 细胞各成分平衡增长，生长速率恒定；
三个重要参数
（ 1）繁殖代数 (n)
（ 2）生长速率常数 (R)
（ 3）代时 (G)
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
G = (t2-t1) / n
= (t2-t1) / 3.322(lgX2-lgX1)
R = 1 /G
= 3.322 (lgX2-lgX1) / (t2-t1)
X2 = X1 ·2n 两边取对数：
lgX2 = lgX1 + nlg2 （ lg2 =0.301）
n = 3.322 ( lgX2 - lgX1)
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
x2
x1
t1 t2
影响代时长短的因素
（ 1）菌种
（ 2）营养成分
（ 3）营养物浓度
（ 4）培养温度 时间
8.0mg/ml
6.0mg/ml
4.0mg/ml
2.0mg/ml
1.0mg/ml
0.5mg/ml
0.2mg/ml
营养物浓度对生长速度和菌体产量的影响
Ⅱ 指数期 (exponential phase)
Ⅲ 稳定期 (stationary phase)
① 生长速率常数 R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等；
② 菌体产量达到最高点，且产量与营养物质的消耗出现有规律的比例关系，用生长产量常数 Y表示；
Y = (X-X0) / C0-C
= (X-X0) / C0
X,稳定期的细胞干重 (g/ml培养液）
X0,刚接种时的细胞干重
C0,限制性营养物的最初浓度 (g/ml)
C,稳定时期限制性营养物的浓度
③ 通过对稳定期到来原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建；
① 对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物 (SCP、乳酸 )等为目的的一些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期：
② 是对维生素、碱基和氨基酸等生长因子进行生物测定的最佳测定时期；
稳定期的实践意义
IV 衰亡期 (death phase)
微生物个体死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态；
细胞形态发生变化，出现畸形；
有的发生自溶；
有的合成或释放次生代谢产物；
芽孢此期释放；
三,微生物的连续培养方法稳定期到来的主要原因？
营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
有害代谢产物的累计；
理化条件的不适宜等；
是一种根据培养器内 微生物的生长密度,并借光电控制系统来控制培养液流速，使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；
主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。
1,恒浊器 (turbidostat)
2、恒化器 (chemostat)
是一种设法使 培养液的流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行繁殖的连续培养装置；
主要获得不同生长速率的菌体；
恒浊与恒化培养控制装置装置 恒浊器 恒化器控制对象 菌体密度 (内控制 ) 培养基流速 (外控制 )
培养基 无限制生长因子 有限制生长因子培养基流速 不恒定 恒定生长速率 最高速率 低于最高速率产物 大量菌体或与菌体相平行的代谢产物不同生长速率的菌体应用范围 生产为主 实验室为主
Turbidostat & chemostat的比较分批培养与连续培养的比较连续培养的优缺点
优点
高效
自控
产品质量稳定
节约动力、人力、水和蒸汽等
缺点
菌种容易退化
容易污染杂菌
营养物的利用率低于单批培养微生物的高密度培养
指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养 10倍以上的生长状态或培养技术；
目前由于研究的微生物种类主要局限于
E.coli and S.cerevisiae 等兼性厌氧菌；
第三节 影响微生物生长的主要因素一,温度二,氧气三,pH值一,温度 (temperature)
嗜冷菌 (<20oC)
嗜温菌 (20-45oC)
嗜热菌 (50-60oC)
嗜高温菌 (80-95oC)
极端高温菌 (105-150oC)
根据温度对微生物的影响分类
Thermophile and Biotechnology
来自嗜热菌的酶可在高温下稳定的催化生物化学反应；
其中由 Thermus aquaticus 中分离出来的 DNA 聚合酶，
Taq polymerase,已广泛应用于 PCR反应；
分离自 Pyrocuccus furiosus 的 pfu polymerase应用于
PCR反应更加稳定，而且错误率更低；
二,氧气 (oxygen)
好氧菌
(Aerobes)
1.专性好氧菌 (obligate aerobes)
必须有氧存在
2.兼性好氧菌 (facultative aerobes)
有氧无氧均可，但有氧更好
3.微好氧菌 (microaerophilic aerobes)
只在较低的氧分压下生长厌氧菌
(anaerobes)
4,耐氧菌 (aerotolerant anaerobes)
不需氧，但有氧也能生存，氧无毒害
5,专性厌氧菌 (obligate/strict anaerobes)
氧有毒害，甚至致死微生物与氧的关系厌氧菌的氧毒害机制厌氧菌体内无 SOD(超氧化物歧化酶 )，因此受生物体内普遍存在的超氧阴离子自由基的毒害作用。
去除 ·O2-等有害活性氧分子的机制
H2O+1/2O2
2H2O
2·O2-+2H+ H2O2+O2SOD
一切好氧生物及耐氧菌过氧化氢酶一切好氧生物
NADH2 NAD
过氧化物酶耐氧菌三,pH值嗜碱微生物（ basophile）
多数放线菌、硝化细菌、根瘤菌等耐碱微生物（ basotolerant microorganism）
若干链霉菌
嗜酸微生物（ acidophile）
多数真菌
耐酸微生物 (acidotolerant microorganism)
乳酸杆菌、醋酸杆菌，许多肠杆菌等第四节 微生物培养方法概论微生物培养方法生产实践实验室培养法固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养固体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养液体培养好氧菌的培养厌氧菌的培养
1、好氧菌的实验室培养固体培养试管斜面培养皿琼脂平板液体培养试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶培养（振荡培养）
台式发酵罐培养
2、厌氧菌的实验室培养高层琼脂柱
Hungate 滚管厌氧罐技术厌氧手套箱第五节 有害微生物的控制一,几个基本概念
1、灭菌 (sterilization)
采用 强烈的理化因素 使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。例如各种高温灭菌措施等。
总菌数活菌数细胞数的对数细胞数的对数时间 时间杀菌 溶菌
2、消毒 (disinfection)
消毒是一种采用 较温和的理化因素,仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。
举例：
一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；
对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法等；
3、防腐 (antisepsis)
防腐就是利用某种理化因素完全 抑制 霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。
防腐的常用措施低温缺氧干燥高渗高酸度防腐剂
4、化学治疗 (chemotherapy)
它是利用具有高度选择毒力（ selective toxicity，
即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来 抑制 宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。
用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂；
一些重要的化学治疗剂种类：
各种抗生素磺胺类药物中草药中的有效成分等比较项目 灭菌 消毒 防腐 化疗处理因素 强理、化因素 理、化因素 理、化因素 化学治疗剂处理对象 任何物体内外的一切微生物物体表面的病原菌物体内外的一切微生物宿主体内的病原菌作用效果 彻底杀灭 杀死或抑制 抑制或杀死 抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，
辐射灭菌，杀菌剂
70%酒精消毒，
巴氏消毒法冷藏、干燥、
糖渍、盐腌、
缺氧、防腐剂抗生素、磺胺药、生物药物素灭菌、消毒、防腐和化疗的比较
（一）物理方法 ——高温杀菌高温灭菌干热灭菌法 火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法湿热灭菌
(消毒 )法常压下加压下巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法常规加压灭菌法连续加压灭菌法
LTH法
HTST法烘箱内热空气灭菌法
150~170℃ 1~2h 彻底杀灭细菌；
适用于金属和玻璃器皿的灭菌；
火焰灼烧法
仅适用于接种环、接种针的灭菌或带病原菌的材料、
动物尸体的烧毁等。
干热灭菌法
1、热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强；
2、热蒸汽比热空气穿透力更强；
3、蒸汽存在潜热，当气体转变成液体时可放出大量热量；
4、可迅速提高灭菌物体的温度。
相同温度下，湿热灭菌比干热灭菌好；
湿热灭菌法比较项目 干热 90 ℃ 90 ℃ 相对湿度
20% 80%
白喉棒杆菌 24 h 2 h 2 min
痢疾杆菌 3 h 2 h 2 min
伤寒杆菌 3 h 2 h 2 min
葡萄球菌 8 h 3 h 2 min
干热与湿热空气对不同细胞的致死时间巴氏消毒法一种低温湿热消毒法。
低温维持法 (Low temperature holding method,LTH)
63℃ 30min
高温瞬时法 (High temperature short time,HTST)
72℃ 15s
巴氏消毒法间歇灭菌法 (fractional sterilization)
80~100℃ 15~60 min 杀灭所有微生物的营养体；
37℃ 或室温保温过夜，诱发芽孢萌发为营养体；
重复上述步骤三次，在较低的灭菌温度下彻底灭菌；
适用于不耐热培养基的灭菌。
高压蒸汽灭菌法
121℃ ； 15-20 min； 1kg/cm2
是被广泛使用的方法；
高压蒸汽灭菌锅构造
1、压力表
2、安全阀
3、放气阀
4、软管
5、紧固螺栓
6、灭菌桶
7、筛架
8、水手提式高压蒸汽灭菌锅
1、加水至止水线；
2、灭菌物品包裹好；
3、开启放气阀；
4、加热排气；
5、达到预定表压，开始计时；
6、关闭热源，当压力降至
0.05MPa时，缓慢开启放气阀。
高压蒸汽灭菌锅使用方法
4、过滤
1、低温冷藏法冷冻法
2、辐射：紫外线、电离辐射和强可见光等
3、干燥和渗透压（高渗）
其他物理控制方法过滤除菌
（二） 化学方法杀菌
1,表面消毒剂 (surface disinfactant)
是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂。
类型 名称及使用浓度 作用机制 应用范围醇类 70-75%乙醇 使膜损伤、蛋白质变性皮肤、器械醛类 0.5-10%甲醛 破坏蛋白质氢键或氨基物品消毒，接种箱、
接种室的熏蒸酚类 3-5%石炭酸 蛋白质变性，损伤细胞膜地面、家具、器皿表面活性剂类
0.05-0.1%新洁而灭 蛋白质变性、破坏细胞膜皮肤、粘膜、手术器械染料 2-4%龙胆紫 与蛋白质羧基结合 皮肤、伤口氧化剂类 0.1%高锰酸钾 氧化蛋白质的活性基团皮肤、尿道
3%双氧水 污染物件表面重金属类 2%红汞 与蛋白质的巯基结合使失活皮肤、伤口
0.1-0.5%硫酸铜 植物病原菌酸碱类 5-10%醋酸 破坏细胞膜和蛋白质房间消毒常用表面消毒剂及应用影响消毒剂作用的因素消毒剂 种类浓度作用时间细菌菌龄种类环境有机物温度酸碱度
是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性毒性的化学药剂；
根据来源分为两类：
人工合成 (主要是一些生长因子类似物 )
磺胺类药物 ；
微生物产生
抗生素
2,化学治疗剂 (chemotherapeutant)
（ 1）磺胺类药物 — 生长因子类似物是第一个发现的生长因子类似物药物；
也是人类第一个成功地用于特异性抑制某种微生物的生长来治疗疾病的化学治疗剂。
对氨基苯甲酸（ PABA）
(正常代谢物）
磺胺
(代谢物拮抗物）
磺胺类药物的杀菌机制 — PABA代谢类似物二氢叶酸二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶 F
核酸合成细菌体内合成叶酸二氢蝶啶 二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶
PABA Glu
二氢叶酸二氢叶酸合成酶 二氢叶酸还原酶四氢叶酸辅酶 F
核酸合成磺胺药
TMP
TMP(三甲基苄二氨嘧啶 )
——磺胺增效剂细菌体内叶酸合成受阻二氢蝶啶 二氢蝶酸二氢蝶酸合成酶
PABA 假二氢叶酸
（ 2）抗生素 (antibiotics)
一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰他种生物（包括病原菌、病毒和癌细胞等 )的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂；
目前在临床上应用的抗生素仅五六十种。
抗生素的抗菌谱由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，
抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱。
抗生素的作用机制
抑制细胞壁合成；
干扰细胞膜的功能；
抑制蛋白质的合成；
抑制核酸的合成；
1.抑制细胞壁合成青霉素万古霉素杆菌肽头孢菌素环丝氨酸
TMP
磺胺药
PAPB
细胞膜多粘菌素短杆菌肽链霉素卡那霉素四环素
3.抑制蛋白质合成红霉素氯霉素
2,抑制 RNA合成
2.抑制 DNA解旋酶诺氟沙星新生霉素主要抗生素和化学治疗剂的作用模型利福霉素利福平
3.抑制蛋白质合成
4,干扰细胞膜合成
5.抑制细胞代谢微生物的抗药性抗药性主要通过遗传途径产生，如基因突变、遗传重组或质粒转移等。
1、产生一种能使药物失去活性的酶；
2、把药物作用的靶位加以修饰；
3、形成“救护途径”；
4、使药物不能透过细胞膜；
5、通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外。
微生物产生抗药性的原因如何解决微生物的抗药性问题？
筛选新的抗生素；
对天然抗生素的结构进行改造；
寻找比抗生素疗效更为广泛的生理活性产物；
生物药物素,具有多种生理活性的微生物次生代谢物；
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思考题
