四,主要组织相容性复合体
Major Histocompatibility Complex （ MHC）
1948 George Snell
从小鼠器官移植排斥相关遗传基因研究中发现。
1957年,Payne,在研究输血时,发现血型相同有发热反应 现象,且被输血者血清中有针对供体淋巴细胞的抗体,由此开始了对白细胞抗原的分析。
1958年,Dausset(法 )发现 Mac-A2。
鼠,位于 17号染色体,编码 H2基因人,位于 6号染色体,编码 HLA基因
1964年,第一次” MHC”会议确认人组织相容性抗原由才
HLA基因编码。
1,HLA基因的结构和表达产物位于 6号染色体短臂 21.3处,分为三类,
I,II,III 类；
I 类 --------通过血清学方法分型为 A,B,C.
检测,待检淋巴细胞加上抗血清加上补体,使淋巴细胞被打洞 ----淋巴细胞致死 --
--用台盼兰等专一性对死细胞染色染料加以检测 (死细胞被染成蓝色,染料进入细胞 )
单克隆抗体方法,检测发现 E,F,G位点,
标准血清的获得：一般来源于经产妇血液,
孕妇会产生针对胎儿的 HLA抗原的抗体。
I 类分子表达于所有有核细胞的表面,
HLA的共显性表达,
A,B,C等多位点共同表达,细胞表面同时出现 A,B,C抗原,当涉及两个人时,则讨论等位因,
A,B,C三位点可同时有 6种表型,同一群体中,A可能有多种等位基因,A1,A2,A3.....同一个人只能最多有两种等位基因 A1,A2A1,A3.....,
II类分子,血清学方法分为 DQ,DR位点；
细胞学方法分为 DP位点,
各位点有几十个以上等位基因
II 类分子表达于 APC细胞及活化的 T Cell
表面,
细胞学方法,混合淋巴细胞培养法（ MLC）
两种洗净的淋巴细胞 ----混合 ----培养 ----某些发生反应,某些不发生反应,某些相互刺激,分裂增殖很快 (说明表型不相容 )。
定量指标,细胞培养中加入 3H-TdR(代替 dT),
检测淋巴细胞培养中组织型是否匹配。
MHC分子结构,
I 类,?链?链异二聚体。
链 367氨基酸?链 100氨基酸
1?2
2m?3
重链（?链）,(1)具三个结构域 (2)穿膜区
(3)包浆内区,含氨基酸磷酸化位点,通过受体作用,产生不同信号,传至细胞内,影响细胞增殖等,(4)整个分子为异二聚体。
轻链?链,可能出现不匹配现象。
由于?链不是膜镶嵌结构,靠次级键连接,
可能出现,(1)表达系统不好 (2)不匹配,过量,
造成血液中含量升高,可通过肾脏排出,进行辅助诊断,(1)血液中含量过高 (2)肾脏通透性增加。
II 类,?链?链异二聚体两个?1?2 ；?1?2结构域,每个结构域 ~90个氨基酸,
具 Ig结构特征,同源性较高。
1?1
2? 2
MHC 的空间结构：
1987年,哈佛大学 wiley,用 X线晶体衍射,得 HLA-
A2图,用蛋白酶切下膜外部分,纯化,结晶,发现一个异源性肽段,8-12个氨基酸,证实 MHC有一个抗原结合槽,
1993年,Brown得到 DR1的 X射线晶体衍射图,发现 9-15个氨基酸或更长的抗原结合槽,相对较为松散,可以伸到外部,同时分析对应配体是 TCR及 CD4
分子,
2,MHC的功能递呈抗原,与抗原肽结合,形成复合表位,
并将表位信号传递给 T细胞受体 (TCR).
MHC限制性识别 的概念：
a,I类,II类的 T细胞限制性
MHC-I可与 T细胞受体的共受体 CD8分子形成特殊的匹配结构,----内源性 Ag----Tc
MHC- II可与 T细胞受体的共受体 CD4分子形成特殊的复合受体分子 -----外 源性 Ag----Th。
b,MHC- Ag复合表位被抗原特异性 TCR限制性 识别
C,MHC- Ag与 TCR分子 有种属性 TCR限制性 识别抗体识别与 MHC的不同：
MHC-----顺序识别抗体 ------空间构象识别
MHC限制性肿瘤抗原肽疫苗概念：
肿瘤细胞中抗原大都为点突变,MHC的顺序识别,可准确识别点突变的肿瘤抗原,例如,黑色素瘤细胞,顺序中一个突变,可刺激很强免疫反应,介导 Tc
对肿瘤细胞产生很强杀伤作用,用于肽疫苗的研究,
最近发现 APC上光有 MHC信号还不足以刺激 T
细胞增生,还必须有第二信号系统 (B7-CD28)，
与 MHC-Ag-TCR(CD4/CD3)系统配合,才有信号传递。
B7 CD28
APC CD4/8 T Cell
MHC Ag TCR
转基因实验,
(1) 转基因 B7 肿瘤细胞 ----高表达复合刺激信号 ----增强抗原性 抑癌。
(2) MHC转基因 /刺激其表达,使抗原更有效递呈 ----T细胞特异性增殖 ------针对抗原的免疫功能提高。
(3) 分别封闭 MHC和 CD28信号的实验：
仅有 MHC信号系统,T细胞凋亡 ;
仅有 B7信号系统,出现无反应性 。
3.MHC的多态性及其意义多态性,
----------人与人之间等位基因的差异。
MHC是人类基因中最具多态性的,1999年已发现
400多个等位基因。
I 类,A,39个 ; B,64个 ; C,24个。
II类,DRA------2个 ;
DRB----91（ 434个 /2004年 ）个 ;
DQA1---13个 ; DQB1---19个 ;
DPA1-----8个 ; DPB1----32个。
多蛋白酶体基因（ proteasome)LMP
(Low molecular mass polypeptide),夹在
II类 DP,DQ,DR中,分解内源性抗原。
抗原运载体基因,称 TAP(transporter
of antigen peptide)，递呈内源性抗原。
I类分子：内源性抗原
1.免疫监视,
2.清除自身内部不正常细胞,
TAP(异二聚体 ),LMP---内源性抗原肽的加工 -----
-----TAP---------MHC-I-------TCR (多蛋白酶体途径 )
II类分子,外源性抗原外源蛋白 ----通过表面 Ig系统引导,吞噬 ----形成内吞小泡 ----在酶作用下,与溶酶体融合,形成内粒体
（ endosome） ----抗 原肽被酶切成肽段 ----在内质网表面与 MHC-II结合 ----表达于细胞表面 (内粒体途径 )
HLA多态性（ polymorphism）
意义,
(1),HLA与人体免疫应答有关,免疫水平与群体进化,种的生存有关，产生多种适应性。
(2).与疾病的易感相关,
相关系数 (relative risk) RR=P+/P-
P+:带有 HLA基因个体的发病率
P-:不带 HLA基因个体的发病率举例,relative risk
相关的 HLA (RR)
多发性硬化症 DR2 4.1
重症肌无力 DR3 2.5
红斑狼疮 DR3 5.8
类风湿性关节炎 DR4 4.2
恶性贫血 DR5 5.4
强直性脊椎炎 B27 9-10
类风湿性关节炎,在白种人中 RR高,黄种人次之,
犹太人几乎无相关性,
1987年,提出共表位假说,共表位假说,所有与疾病相关的 HLA基因具共同的表位结构域,
经研究发现 DR4有 14种亚型,且 14种亚型的表位不同,发现与疾病易感相关性不同。
白种人,DR4-1型 DW1
黄种人,DR4-5型 DW15
犹太人,DR4-3型 DW10
原因,所有与疾病有关类型的第二个外显子的第三个高变区,第 71-74位氨基酸密码子都是 RRAA.
(3).与器官移植配型有关
HLA基因型很多,复等位基因,位点多。
A B C DR DQ DP
A1 B27 C3 DR1 DQ1 DP28
A2 B9 C5 DR4 DQ3 DP32
各种基因型排列组合,几乎没有人能配型完全相同,所以器官移植存在很大的困难,器官移植通常寻找近亲进行配型,例如,儿子 ----母亲,有一半基因型可以相同,相容性提高,排异性降低。
(4).法医学个体识别例如,亲子鉴定。
4,HLA定型
(1)血清学方法,
----常用。通过补体依赖的细胞毒方法,可确定
SD抗原 (serologically defined Ag)
过程,待定型淋巴细胞 +已知血清 +补体 -----补体可对抗原 -抗体复合物产生穿孔作用,杀死细胞 ----特异性染色 。
血清来源,1.经产妇血清
2.移植受体者
3.志愿免疫者
4.单克隆抗体检测内容,
1.总淋巴细胞 ----检测 I类原抗为主 (A,B,C)
2.B淋巴细胞 ----检测 II类抗原为主 (DR,DQ)
(2)混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte
reaction,MLR)
检测,LD抗原（ lymphocyte defined antigen）
原理,通过 B细胞表面的抗原刺激 T细胞增殖反应,
是一种功能性检测,
分为,
(a)单向,
把标准已知型的淋巴细胞杀死 (X射线,丝裂霉素 ),此时细胞表面形态未改变,保留了抗原性,抑制了分裂能力。利用 3H-TdR掺入作为指标进行检测,若增殖刺激,则 3H-TdR掺入多 ;若无增殖刺激,则 3H-
TdR掺入少。
(b)双向,将两种不同淋巴细胞混合反应。
可分为,
(1)阴性分型法,
型相同,则反应为阴性；型不同,则反应为阳性
(2)阳性分型法 (预致敏淋巴细胞分型法 primed
lymphocyte typing,PLT):
型相同,则反应为阳性；型不同,则反应为阴性过程,淋巴细胞预致敏 ------加入死的待检测细胞 ----如果在短期内高效刺激致敏淋巴细胞,发生二次反应 (阳性 ),
说明死细胞和标准细胞的 HLA一致 ;若经过 5-6天发生反应,
说明是一次反应,为阴性,
作用,用于 DP基因分型,
(3)基因组 DNA-RFLP法 （ restriction
fragment length polymorphism）,
限制性内切酶对 DNA的剪切位点不同,而产生不同的酶切片断长度,然后走电泳转移硝酸纤维膜后用探针杂交观察（ Southern blot hybridization）。
(4)PCR-SSOP法 (sequence specific
oligonucleotide probe):
特异性放大 HLA基因后用,
正向杂交法 --------用探针找样品反向杂交法 -------即用样品找探针,
过程,探针合成 20bp,固定于杂交膜上,将 PCR产物加入,则样品可在对应点与探针发生特异性同源配对,
(5)PCR-RFLP法
PCR扩增 DNA片断后,用限制性内切酶分解。
存在的问题是,某些等位基因间不存在相差异的限制性内切酶识别位点。
(6)PCR-DNA sequencing法
(7)PCR –SSP,常用 。
----sequence specific primer(SSP)
Major Histocompatibility Complex （ MHC）
1948 George Snell
从小鼠器官移植排斥相关遗传基因研究中发现。
1957年,Payne,在研究输血时,发现血型相同有发热反应 现象,且被输血者血清中有针对供体淋巴细胞的抗体,由此开始了对白细胞抗原的分析。
1958年,Dausset(法 )发现 Mac-A2。
鼠,位于 17号染色体,编码 H2基因人,位于 6号染色体,编码 HLA基因
1964年,第一次” MHC”会议确认人组织相容性抗原由才
HLA基因编码。
1,HLA基因的结构和表达产物位于 6号染色体短臂 21.3处,分为三类,
I,II,III 类；
I 类 --------通过血清学方法分型为 A,B,C.
检测,待检淋巴细胞加上抗血清加上补体,使淋巴细胞被打洞 ----淋巴细胞致死 --
--用台盼兰等专一性对死细胞染色染料加以检测 (死细胞被染成蓝色,染料进入细胞 )
单克隆抗体方法,检测发现 E,F,G位点,
标准血清的获得：一般来源于经产妇血液,
孕妇会产生针对胎儿的 HLA抗原的抗体。
I 类分子表达于所有有核细胞的表面,
HLA的共显性表达,
A,B,C等多位点共同表达,细胞表面同时出现 A,B,C抗原,当涉及两个人时,则讨论等位因,
A,B,C三位点可同时有 6种表型,同一群体中,A可能有多种等位基因,A1,A2,A3.....同一个人只能最多有两种等位基因 A1,A2A1,A3.....,
II类分子,血清学方法分为 DQ,DR位点；
细胞学方法分为 DP位点,
各位点有几十个以上等位基因
II 类分子表达于 APC细胞及活化的 T Cell
表面,
细胞学方法,混合淋巴细胞培养法（ MLC）
两种洗净的淋巴细胞 ----混合 ----培养 ----某些发生反应,某些不发生反应,某些相互刺激,分裂增殖很快 (说明表型不相容 )。
定量指标,细胞培养中加入 3H-TdR(代替 dT),
检测淋巴细胞培养中组织型是否匹配。
MHC分子结构,
I 类,?链?链异二聚体。
链 367氨基酸?链 100氨基酸
1?2
2m?3
重链（?链）,(1)具三个结构域 (2)穿膜区
(3)包浆内区,含氨基酸磷酸化位点,通过受体作用,产生不同信号,传至细胞内,影响细胞增殖等,(4)整个分子为异二聚体。
轻链?链,可能出现不匹配现象。
由于?链不是膜镶嵌结构,靠次级键连接,
可能出现,(1)表达系统不好 (2)不匹配,过量,
造成血液中含量升高,可通过肾脏排出,进行辅助诊断,(1)血液中含量过高 (2)肾脏通透性增加。
II 类,?链?链异二聚体两个?1?2 ；?1?2结构域,每个结构域 ~90个氨基酸,
具 Ig结构特征,同源性较高。
1?1
2? 2
MHC 的空间结构：
1987年,哈佛大学 wiley,用 X线晶体衍射,得 HLA-
A2图,用蛋白酶切下膜外部分,纯化,结晶,发现一个异源性肽段,8-12个氨基酸,证实 MHC有一个抗原结合槽,
1993年,Brown得到 DR1的 X射线晶体衍射图,发现 9-15个氨基酸或更长的抗原结合槽,相对较为松散,可以伸到外部,同时分析对应配体是 TCR及 CD4
分子,
2,MHC的功能递呈抗原,与抗原肽结合,形成复合表位,
并将表位信号传递给 T细胞受体 (TCR).
MHC限制性识别 的概念：
a,I类,II类的 T细胞限制性
MHC-I可与 T细胞受体的共受体 CD8分子形成特殊的匹配结构,----内源性 Ag----Tc
MHC- II可与 T细胞受体的共受体 CD4分子形成特殊的复合受体分子 -----外 源性 Ag----Th。
b,MHC- Ag复合表位被抗原特异性 TCR限制性 识别
C,MHC- Ag与 TCR分子 有种属性 TCR限制性 识别抗体识别与 MHC的不同：
MHC-----顺序识别抗体 ------空间构象识别
MHC限制性肿瘤抗原肽疫苗概念：
肿瘤细胞中抗原大都为点突变,MHC的顺序识别,可准确识别点突变的肿瘤抗原,例如,黑色素瘤细胞,顺序中一个突变,可刺激很强免疫反应,介导 Tc
对肿瘤细胞产生很强杀伤作用,用于肽疫苗的研究,
最近发现 APC上光有 MHC信号还不足以刺激 T
细胞增生,还必须有第二信号系统 (B7-CD28)，
与 MHC-Ag-TCR(CD4/CD3)系统配合,才有信号传递。
B7 CD28
APC CD4/8 T Cell
MHC Ag TCR
转基因实验,
(1) 转基因 B7 肿瘤细胞 ----高表达复合刺激信号 ----增强抗原性 抑癌。
(2) MHC转基因 /刺激其表达,使抗原更有效递呈 ----T细胞特异性增殖 ------针对抗原的免疫功能提高。
(3) 分别封闭 MHC和 CD28信号的实验：
仅有 MHC信号系统,T细胞凋亡 ;
仅有 B7信号系统,出现无反应性 。
3.MHC的多态性及其意义多态性,
----------人与人之间等位基因的差异。
MHC是人类基因中最具多态性的,1999年已发现
400多个等位基因。
I 类,A,39个 ; B,64个 ; C,24个。
II类,DRA------2个 ;
DRB----91（ 434个 /2004年 ）个 ;
DQA1---13个 ; DQB1---19个 ;
DPA1-----8个 ; DPB1----32个。
多蛋白酶体基因（ proteasome)LMP
(Low molecular mass polypeptide),夹在
II类 DP,DQ,DR中,分解内源性抗原。
抗原运载体基因,称 TAP(transporter
of antigen peptide)，递呈内源性抗原。
I类分子：内源性抗原
1.免疫监视,
2.清除自身内部不正常细胞,
TAP(异二聚体 ),LMP---内源性抗原肽的加工 -----
-----TAP---------MHC-I-------TCR (多蛋白酶体途径 )
II类分子,外源性抗原外源蛋白 ----通过表面 Ig系统引导,吞噬 ----形成内吞小泡 ----在酶作用下,与溶酶体融合,形成内粒体
（ endosome） ----抗 原肽被酶切成肽段 ----在内质网表面与 MHC-II结合 ----表达于细胞表面 (内粒体途径 )
HLA多态性（ polymorphism）
意义,
(1),HLA与人体免疫应答有关,免疫水平与群体进化,种的生存有关，产生多种适应性。
(2).与疾病的易感相关,
相关系数 (relative risk) RR=P+/P-
P+:带有 HLA基因个体的发病率
P-:不带 HLA基因个体的发病率举例,relative risk
相关的 HLA (RR)
多发性硬化症 DR2 4.1
重症肌无力 DR3 2.5
红斑狼疮 DR3 5.8
类风湿性关节炎 DR4 4.2
恶性贫血 DR5 5.4
强直性脊椎炎 B27 9-10
类风湿性关节炎,在白种人中 RR高,黄种人次之,
犹太人几乎无相关性,
1987年,提出共表位假说,共表位假说,所有与疾病相关的 HLA基因具共同的表位结构域,
经研究发现 DR4有 14种亚型,且 14种亚型的表位不同,发现与疾病易感相关性不同。
白种人,DR4-1型 DW1
黄种人,DR4-5型 DW15
犹太人,DR4-3型 DW10
原因,所有与疾病有关类型的第二个外显子的第三个高变区,第 71-74位氨基酸密码子都是 RRAA.
(3).与器官移植配型有关
HLA基因型很多,复等位基因,位点多。
A B C DR DQ DP
A1 B27 C3 DR1 DQ1 DP28
A2 B9 C5 DR4 DQ3 DP32
各种基因型排列组合,几乎没有人能配型完全相同,所以器官移植存在很大的困难,器官移植通常寻找近亲进行配型,例如,儿子 ----母亲,有一半基因型可以相同,相容性提高,排异性降低。
(4).法医学个体识别例如,亲子鉴定。
4,HLA定型
(1)血清学方法,
----常用。通过补体依赖的细胞毒方法,可确定
SD抗原 (serologically defined Ag)
过程,待定型淋巴细胞 +已知血清 +补体 -----补体可对抗原 -抗体复合物产生穿孔作用,杀死细胞 ----特异性染色 。
血清来源,1.经产妇血清
2.移植受体者
3.志愿免疫者
4.单克隆抗体检测内容,
1.总淋巴细胞 ----检测 I类原抗为主 (A,B,C)
2.B淋巴细胞 ----检测 II类抗原为主 (DR,DQ)
(2)混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte
reaction,MLR)
检测,LD抗原（ lymphocyte defined antigen）
原理,通过 B细胞表面的抗原刺激 T细胞增殖反应,
是一种功能性检测,
分为,
(a)单向,
把标准已知型的淋巴细胞杀死 (X射线,丝裂霉素 ),此时细胞表面形态未改变,保留了抗原性,抑制了分裂能力。利用 3H-TdR掺入作为指标进行检测,若增殖刺激,则 3H-TdR掺入多 ;若无增殖刺激,则 3H-
TdR掺入少。
(b)双向,将两种不同淋巴细胞混合反应。
可分为,
(1)阴性分型法,
型相同,则反应为阴性；型不同,则反应为阳性
(2)阳性分型法 (预致敏淋巴细胞分型法 primed
lymphocyte typing,PLT):
型相同,则反应为阳性；型不同,则反应为阴性过程,淋巴细胞预致敏 ------加入死的待检测细胞 ----如果在短期内高效刺激致敏淋巴细胞,发生二次反应 (阳性 ),
说明死细胞和标准细胞的 HLA一致 ;若经过 5-6天发生反应,
说明是一次反应,为阴性,
作用,用于 DP基因分型,
(3)基因组 DNA-RFLP法 （ restriction
fragment length polymorphism）,
限制性内切酶对 DNA的剪切位点不同,而产生不同的酶切片断长度,然后走电泳转移硝酸纤维膜后用探针杂交观察（ Southern blot hybridization）。
(4)PCR-SSOP法 (sequence specific
oligonucleotide probe):
特异性放大 HLA基因后用,
正向杂交法 --------用探针找样品反向杂交法 -------即用样品找探针,
过程,探针合成 20bp,固定于杂交膜上,将 PCR产物加入,则样品可在对应点与探针发生特异性同源配对,
(5)PCR-RFLP法
PCR扩增 DNA片断后,用限制性内切酶分解。
存在的问题是,某些等位基因间不存在相差异的限制性内切酶识别位点。
(6)PCR-DNA sequencing法
(7)PCR –SSP,常用 。
----sequence specific primer(SSP)
