植物组织培养技术
Plant tissue culture
植物组织培养简介定义：离体（ in vitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、
发育再生出完整植株的过程。
植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。
发展简史
1838-1839年，德国科学家 Schleide 和 Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。
1902年，德国植物学家 Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（ totipotency）理论。
1904年,Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。
1922年,Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。
1934年,White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。
1958年，英国科学家 Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。
1962年,Murashinge 和 Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的 MS培养基。
1964-1966年，印度科学家 Guha 和 Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。
1972年,Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。 ……
应用领域
1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到 3万多株，一株兰花一年繁殖到 400万株。
2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。
3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。
4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、
抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。
5、基因工程 基因工程主要研究 DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物 --紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达 0.49gFW/（ gFW·d）的细胞系，
每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达 0.25mg。
植物组织培养的分类
外植体（ explant)：由活体（ in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。
广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（ organ culture）、茎尖分生组织培养
(shoot tip culture,shoot apex culture,apical
meristem culture),愈伤组织培养 (calluse
cultrue)、细胞培养 (cell culture)、原生质体培养
(protoplast culture)
愈伤组织（ callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
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植物细胞的全能性
植物细胞的全能性（ totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
原理,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个 活细胞 都应该具有全能性。
差异,（ 1） 受精卵的全能性 最高 （ 2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的 低 。
潜在全能性的原因,基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
植物细胞全能性的表达
脱分化（ dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。
再分化（ redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
离体的植物器官、组织、
细胞脱分化 愈伤组织再分化 根芽植物体植物组织培养过程植物组织培养条件,
含有全部营养成分的培养基、一定的温度、
空气、无菌环境、适合的 PH、适时光照等。
植物组织培养特点
① 培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，
且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
② 生长周期短,繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往 20—
30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
③ 管理方便,利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、
营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
第二章 组织培养实验技术第一节 实 验 室在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，
避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，
需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
1 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。
2 实验室组成：
化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室
（接种室）、培养室、细胞学实验室。
化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、
培养基分装等。
主要设备,药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器,
洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、
干燥、保存、培养基的灭菌等。
主要设备：水池、操作台,高压灭菌锅、
干燥灭菌器（如烘箱） 等。
无菌操作室（接种室）,主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源,超净工作台,消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。
接种室宜小不宜大，一般 7～ 8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。
接种室要求干爽安静,清洁明亮 。 在适当位置吊装 1～ 2
盏紫外线灭菌灯,用以照射灭菌 。 最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外界空气对流 。
接种室应设有缓冲问，面积 1m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
培养室,培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设 5层，最低一层离地高约 lOcm，其他每层间隔 30cm左右，培养架即高 1,7m左右。
培养架长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用 40W日光灯，则长
I,3m,30W的长 lm，宽度一般为 60cm。
培养室最重要的因子是温度,一般保持在 20— 27℃ 左右,具备产热装置,
并安装窗式或立式空调机 。 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度,最好不同种类有不同的培养室 。
室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在 70%～ 80%为好,可安装加湿器 。
控制光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照 10-16h,也有的需要连续照明 。 短日照植物需要短日照条件,长日照植物需要长日照条件 。 现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活 。 在阴雨天可用灯光作补充 。
主要设备,培养架（控温控光控湿）,摇床、培养箱、紫外光源等。
细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。
主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、
倒置显微镜等。
其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。
第二节 植物组织培养的培养条件一、营养条件 —— 培养基 (culture medium)
培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。
培养基的种类
培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基 。
培养基的产生最早是 Sacks(1680)和 Knop(1681),他们对绿色植物的成分进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐组成的 Sacks和 Knop溶液,
至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用 。 以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基,White培养基在 40年代用得较多,现在还常用 。 而到 60和 70年代则大多采用 MS
等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生长快,分化快,且由于浓度高,在配制,消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡 。
培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如 White培养基,Murashige和 Skoog培养基 (简称 MS
培养基 )，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。
目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下：
(1)MS培养基 它是 1962年由 Murashige和 Skoog为培养烟草细胞而设计的 。
特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液 。 其养分的数量和比例较合适,可满足植物的营养和生理需要 。 它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官,花药,细胞和原生质体培养,效果良好 。
有些培养基是由它演变而来的 。
(2)B5培养基 是 1968年由 Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的 。 其主要特点是含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用 。 从实践得知有些植物在 B5培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物 。
(3)White培养基 是 1943年由 White为培养番茄根尖而设计的 。 1963年又作了改良,称作 White改良培养基,提高了 MsSO4的浓度和增加了硼素 。 其特点是无机机盐数量较低,适于生根培养 。
（ 4） N6培养基 是 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 。
其特点是成分较简单,KNO3和 （ NH4） 2SO4含量高 。 在国内已广泛应用于小麦,水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养 。
(5)KM— 8P培养基 它是 1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。
培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、
有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
水 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
无机元素 (inorganic element)
大量元素,指浓度大于 0.5mmol／ L的元素等 。 其作用是：
(1)N 是蛋白质,酶,叶绿素,维生素,核酸,磷脂,生物碱等的组成成分,
是生命不可缺少的物质 。 在制备培养基时以 NO3— N和 NH4— N两种形式供应 。
大多数培养基既含有 N03— N又含 NH4— N。 NH4— N对植物生长较为有利 。 供应的物质有 KNO3,NH4NO3等 。 有时,也添加氨基酸来补充氮素 。
(2)P 是磷脂的主要成分 。 而磷脂又是原生质,细胞核的重要组成部分 。 磷也是 ATP,ADP等的组成成分 。 在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分,提供能量,而且也促进对 N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累 。 常用的物质有 KH2P04或 NaH2P04等 。
(3)K 对碳水化合物合成,转移,以及氮素代谢等有密切关系 。 K增加时,蛋白质合成增加,维管束,纤维组织发达,对胚的分化有促进作用 。 但浓度不易过大,一般为 1— 3mg／ L为好 。 制备培养基时,常以 KCI,KN03等盐类提供 。
(4)Mg,S和 Ca,Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂； S是含 S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgSO4·7H20提供。用量为 1— 3mg／ l较为适宜； Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以 CaCl2·2H2O提供。
微量元素 指小于 0.5mmol／ L的元素,Fe,B，
Mn,Cu,Mo,Co等 。
铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用 Fe2SO4，和 FeCl3(因其在 pH值 5,2以上，易形成 Fe(OH)3的不溶性沉淀 )，而用 FeSO4·7H20
和 Na2— EDTA结合成合物使用。 B,Mn,Zn，
Cu,Mo,Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。
有机化合物 (organic compound)
培养基中若只含有大量元素与微量元素，
常称为 基本培养基（ basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：
碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生长 。 麦芽糖,半乳糖,甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用 。 蔗糖使用浓度在 2%— 3%,常用 3%,即配制一升培养基称取 30g蔗糖,有时可用 2.5%,但在胚培养时采用 4%-15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用 。
不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，
一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。
在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。
维生素 (vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，
但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有
VBl(盐酸硫胺素 ),VB6(盐酸吡哆醇 ),Vpp(烟酸 ),Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、
叶酸,VB12等。一般用量为 0,1— 1,0mg／ L。
有时用量较高。 VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。 Vc有防止组织变褐的作用。
肌醇 (myo— inosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与 6
分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。
使用浓度一般为 lOOmg／ L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。
氨基酸 (almino acide) 是很好的有机氮源，
可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、
谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、
丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约 20种氨基酸的混合物，用量在 10-1000mg／ L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。
天然复合物
其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、
酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。
1)椰乳 是椰子的液体胚乳 。 它是使用最多,效果最大的一种天然复合物 。 一般使用浓度在 10%— 20%,与其果实成熟度及产地关系也很大 。 它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用 。 在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过 1nun时,椰乳就不发生作用 。
2)香蕉 用量为 150-200ml／ L。 用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色 。 对 pH值的缓冲作用大 。 主要在兰花的组织培养中应用,
对发育有促进作用 。
3)马铃薯 (potato) 去掉皮和芽后,加水煮 30min,再经过过滤,取其滤液使用 。 用量为 150— 200g／ L。 对 pH值缓冲作用也大 。 添加后可得到健壮的植株 。
4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为 100— 200mg／ L。 受酸和酶的作用易分解,使用时要注意 。
5)其他 酵母提取液 (YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液 (0.01%～ 0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，
有时有效。
植物生长调节物 (hormone)
植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、
衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。
生长素类 (auxin) 在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,
诱导根的分化和促进细胞分裂,伸长生长 。 在促进生长方面,根对生长素最敏感 。 在极低的浓度下,(10-5— 10-8rng／ L)就可促进生长,其次是茎和芽 。 天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏 。 在植物体内也易受到体内酶的分解 。 组织培养中常用人工合成的生长素类物质 。
IAA(indo acetic acid吲哚乙酸 )是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,,高温高压易被破坏,也易被细胞中的 1AA分解酶降解,受光也易分解 。
NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸 )在组织培养中的起动能力要比 IAA高出 3-4倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用较普遍 。 NAA和 IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 。
IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸 )是促进发根能力较强的生长调节物质 。
2,4— D(2,4— 二氯苯氧乙酸 )起动能力比 IAA高 10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育 。 适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应 。
细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生物,包括 6— BA(6— 苄基氨基嘌呤 ),Kt (kinetin 激动素 ),Zt (zeatin 玉米素 )等 。 其中 Zt活性最强,但非常昂贵,常用的是 6— BA。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用,① 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长 。 ② 促进细胞分裂与扩大 。 ③
抑制根的分化 。 因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎,苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低 。
GA ( gibberellic acid赤霉素 ) 有 20多种,生理活性及作用的种类,部位,效应等各有不同,培养基中添加的是 GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响,当生长素
／赤霉素比值高时有利于木质部分化,
比值低时有利于韧皮部分化；此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子,块茎,
鳞茎等提前萌发 。 一般在器官形成后,
添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长 。
激素配比模式
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织,长根还是长芽 。 如为了促进芽器官的分化,
应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例 。
高 有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素 /细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化低 有利于芽的形成
生长调节物质的使用甚微，一般用 mg／ L表示浓度。
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为 0.05-5mg／ L，细胞分裂素 0.05— 10mg
／ L。
Growth medium
is optimised for
regeneration of
plantlets
No sucrose
(0%)
Sucrose
reduced to
1%
Sucrose
increased to 5%
The explant is completely
covered with green shoots,
and roots are developing
on the lower surface
Very few shoots
have developed on
the explant,No
roots and no callus.
Shoots developed on
edges of upper surface,
and some root
development has
occured
Shoots have developed
over the surface of the
explant,along with roots
from the lower surface,
The result is comparable
with the control medium
tissue culture in the African Violet
No BAP BAP reduced to 0.1 mg,l-1
No NAA
Poor shoot
development
and no roots,
Extensive
callus
generation
Poor shoot
development and
no roots
NAA reduced
to 0.1 mg,l-1
More balanced
development of roots
and shoots,However,
undifferentiated
callus is developing
at the edges of the
explant
Profuse
development of
roots and a reduced
number of shoots,
Undifferentiated
callus is developing
at the edges of the
explant
NAA increased to 5.0
mg,l-1
Profuse development
of roots over the
explant upper and
lower surface,and few
shoots,Some callus
No MS salts
No sign of
regeneration
from explant
at all.
MS salts reduced
to 0.47 g,l-1
Some root growth
but reduced
development of
shoots
MS salts
increased to
9.52 g,l-1
Shoots
developed on
upper surface
of explant,
No roots or
callus.
培养材料的支持物
琼脂 (agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至 40~C即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于 90℃ 以上的热水。
琼脂的用量在 6— 10g／ L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间,pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触 (即吸收 )
面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是 Ca,Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，
然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。
其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
抗生物质 (antibiotic)
抗生物质有青霉素,链霉素,庆大霉素等,用量在 5—
20mg/L之间 。
添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,
尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力,物力和时间 。 尤其对大量通气长期培养,效果更好 。 对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入 5%— 10%的抗菌素 。 抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用 。
但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,
可能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应 。
值得提醒的是,在工作中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施 。 此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成 。
活性炭 (active carbon)
活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为
0.5— l0g／ L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的 5— 羟甲基糖醛及激素等。
活性炭的应用
茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于 Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阈值，一般为 0.1%— 0.2%，不能超过 0.2%。
活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，
可能是由于根顶端产生促进根生长的 IAA，但 IAA易受可见光的光氧化而破坏，
因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了 IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。
此外,在培养基中加入 0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻璃苗有良好作用 。
活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入 0.1%
的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。
但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附 l00ng左右的生长调节物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质 。 大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂 。 很细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶 。 总之,那种随意抓一撮活性炭放人培养基,会带来不良的后果 。 因此,在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用 。
Callus culture
- creation of genetic variants via somaclonal
variation
and/or in vitro selection
- elimination of pathogens esp,viruses
- gene transfer (eg via Agrobacterium,
microprojectiles
2,Meristem culture
- clonal propagation
- elimination of pathogens
- germplasm collection and long-term storage
(eg cryopreservation)
Virus e limina tion
wh y d o e s t h e m e r i st e m h a v e
l o w /n o v i r u s titre?
– v irus spre ads p rim arily throug h
v ascul ar sy stem - this is no t
dev elo ped in the m eristem
– m itosis an d chro m oso m e
repl icatio n com pete w ith v irus
repl icatio n
– high aux in in m eriste m inh ibits
v irus rep licatio n
– a v irus,ina cti v ating,sy stem ha s
grea test activ ity in m eriste m
T ob ac co m er i st e m
v i r u s - f r e e
t i ssu e
v i r u s p a r t i cl e s
f o u n d h e r e
Virus elimination
virus elimination most useful for vegetatively reproduced species -
banana,sugarcane,potato,strawberry,sweet potato
chemotherapy and/or thermotherapy may also be used
NB,disease-free planting material may be rapidly rapidly re-
infected by insect vectors,contaminated soil or implements
the only long-term solution is genetic resistance
3,Embryo culture
- shortening breeding cycles
- creating wide hybrids (interspecific/intergeneric)
- haploid production via chromosome elimination
4,Anther/pollen/ovule culture
- production of haploids for genetic analysis
and shortening breeding programmes
- creation of genetic variants via gametoclonal
variation
5,Protoplast culture
- gene transfer
- creating wide hybrids via somatic hybridization
Plant protoplasts
Plant tissue culture
植物组织培养简介定义：离体（ in vitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、
发育再生出完整植株的过程。
植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近三十年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展极为迅速，发表的文献浩如烟海，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组织培养。
发展简史
1838-1839年，德国科学家 Schleide 和 Schwann发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。
1902年，德国植物学家 Haberlandt 根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（ totipotency）理论。
1904年,Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。
1922年,Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。
1934年,White 用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。
1958年，英国科学家 Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。
1962年,Murashinge 和 Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的 MS培养基。
1964-1966年，印度科学家 Guha 和 Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。
1972年,Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。 ……
应用领域
1、快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年繁殖到 3万多株，一株兰花一年繁殖到 400万株。
2、种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。
3、远缘杂交 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。
4、突变育种 采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、
抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。
5、基因工程 基因工程主要研究 DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
6、生物制品 有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物 --紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达 0.49gFW/（ gFW·d）的细胞系，
每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达 0.25mg。
植物组织培养的分类
外植体（ explant)：由活体（ in vivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。
广义的组织培养依外植体不同，可分为：器官培养（ organ culture）、茎尖分生组织培养
(shoot tip culture,shoot apex culture,apical
meristem culture),愈伤组织培养 (calluse
cultrue)、细胞培养 (cell culture)、原生质体培养
(protoplast culture)
愈伤组织（ callus）在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。
返回返回植物组织培养的理论基础 ——
植物细胞的全能性
植物细胞的全能性（ totipotent)：植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。
原理,生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个 活细胞 都应该具有全能性。
差异,（ 1） 受精卵的全能性 最高 （ 2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的 低 。
潜在全能性的原因,基因表达的选择性
科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。
植物细胞全能性的表达
脱分化（ dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。
再分化（ redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。
离体的植物器官、组织、
细胞脱分化 愈伤组织再分化 根芽植物体植物组织培养过程植物组织培养条件,
含有全部营养成分的培养基、一定的温度、
空气、无菌环境、适合的 PH、适时光照等。
植物组织培养特点
① 培养条件可以人为控制组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，
且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
② 生长周期短,繁殖率高植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往 20—
30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。
③ 管理方便,利于工厂化生产和自动化控制植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、
营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
第二章 组织培养实验技术第一节 实 验 室在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，
避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，
需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
1 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。
2 实验室组成：
化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室
（接种室）、培养室、细胞学实验室。
化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、
培养基分装等。
主要设备,药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器,
洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、
干燥、保存、培养基的灭菌等。
主要设备：水池、操作台,高压灭菌锅、
干燥灭菌器（如烘箱） 等。
无菌操作室（接种室）,主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源,超净工作台,消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。
接种室宜小不宜大，一般 7～ 8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。
接种室要求干爽安静,清洁明亮 。 在适当位置吊装 1～ 2
盏紫外线灭菌灯,用以照射灭菌 。 最好安装一小型空调,使室温可控,这样可使门窗紧闭,减少与外界空气对流 。
接种室应设有缓冲问，面积 1m2为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。
培养室,培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设 5层，最低一层离地高约 lOcm，其他每层间隔 30cm左右，培养架即高 1,7m左右。
培养架长度都是根据日光灯的长度而设计,如采用 40W日光灯，则长
I,3m,30W的长 lm，宽度一般为 60cm。
培养室最重要的因子是温度,一般保持在 20— 27℃ 左右,具备产热装置,
并安装窗式或立式空调机 。 由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度,最好不同种类有不同的培养室 。
室内湿度也要求恒定,相对湿度以保持在 70%～ 80%为好,可安装加湿器 。
控制光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照 10-16h,也有的需要连续照明 。 短日照植物需要短日照条件,长日照植物需要长日照条件 。 现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,这样不但可以节省能源,而且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活 。 在阴雨天可用灯光作补充 。
主要设备,培养架（控温控光控湿）,摇床、培养箱、紫外光源等。
细胞学实验室：用于对培养物的观察分析与培养物的计数等。
主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、
倒置显微镜等。
其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液枪、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。
第二节 植物组织培养的培养条件一、营养条件 —— 培养基 (culture medium)
培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。
培养基的种类
培养基有许多种类,根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的需选用不同的培养基 。
培养基的产生最早是 Sacks(1680)和 Knop(1681),他们对绿色植物的成分进行了分析研究,根据植物从土中主要是吸收无机盐营养,设计出了由无机盐组成的 Sacks和 Knop溶液,
至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用 。 以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基,White培养基在 40年代用得较多,现在还常用 。 而到 60和 70年代则大多采用 MS
等高浓度培养基,可以保证培养材料对营养的需要,并能生长快,分化快,且由于浓度高,在配制,消毒过程中某些成分有些出入,也不致影响培养基的离子平衡 。
培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如 White培养基,Murashige和 Skoog培养基 (简称 MS
培养基 )，也有对某些成分进行改良称作改良培养基。
目前国际上流行的培养基有几十种,常用的培养基及特点如下：
(1)MS培养基 它是 1962年由 Murashige和 Skoog为培养烟草细胞而设计的 。
特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液 。 其养分的数量和比例较合适,可满足植物的营养和生理需要 。 它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官,花药,细胞和原生质体培养,效果良好 。
有些培养基是由它演变而来的 。
(2)B5培养基 是 1968年由 Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的 。 其主要特点是含有较低的铵,这可能对不少培养物的生长有抑制作用 。 从实践得知有些植物在 B5培养基上生长更适宜,如双子叶植物特别是木本植物 。
(3)White培养基 是 1943年由 White为培养番茄根尖而设计的 。 1963年又作了改良,称作 White改良培养基,提高了 MsSO4的浓度和增加了硼素 。 其特点是无机机盐数量较低,适于生根培养 。
（ 4） N6培养基 是 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 。
其特点是成分较简单,KNO3和 （ NH4） 2SO4含量高 。 在国内已广泛应用于小麦,水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养 。
(5)KM— 8P培养基 它是 1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。
培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、
有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
水 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
无机元素 (inorganic element)
大量元素,指浓度大于 0.5mmol／ L的元素等 。 其作用是：
(1)N 是蛋白质,酶,叶绿素,维生素,核酸,磷脂,生物碱等的组成成分,
是生命不可缺少的物质 。 在制备培养基时以 NO3— N和 NH4— N两种形式供应 。
大多数培养基既含有 N03— N又含 NH4— N。 NH4— N对植物生长较为有利 。 供应的物质有 KNO3,NH4NO3等 。 有时,也添加氨基酸来补充氮素 。
(2)P 是磷脂的主要成分 。 而磷脂又是原生质,细胞核的重要组成部分 。 磷也是 ATP,ADP等的组成成分 。 在植物组织培养过程中,向培养基内添加磷,不仅增加养分,提供能量,而且也促进对 N的吸收,增加蛋白质在植物体中的积累 。 常用的物质有 KH2P04或 NaH2P04等 。
(3)K 对碳水化合物合成,转移,以及氮素代谢等有密切关系 。 K增加时,蛋白质合成增加,维管束,纤维组织发达,对胚的分化有促进作用 。 但浓度不易过大,一般为 1— 3mg／ L为好 。 制备培养基时,常以 KCI,KN03等盐类提供 。
(4)Mg,S和 Ca,Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂； S是含 S氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以 MgSO4·7H20提供。用量为 1— 3mg／ l较为适宜； Ca是构成细胞壁的一种成分,Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以 CaCl2·2H2O提供。
微量元素 指小于 0.5mmol／ L的元素,Fe,B，
Mn,Cu,Mo,Co等 。
铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中的铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制做培养基时不用 Fe2SO4，和 FeCl3(因其在 pH值 5,2以上，易形成 Fe(OH)3的不溶性沉淀 )，而用 FeSO4·7H20
和 Na2— EDTA结合成合物使用。 B,Mn,Zn，
Cu,Mo,Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。
有机化合物 (organic compound)
培养基中若只含有大量元素与微量元素，
常称为 基本培养基（ basic medium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：
碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖,葡萄糖和果糖也是较好的碳源,可支持许多组织很好的生长 。 麦芽糖,半乳糖,甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用 。 蔗糖使用浓度在 2%— 3%,常用 3%,即配制一升培养基称取 30g蔗糖,有时可用 2.5%,但在胚培养时采用 4%-15%的高浓度,因蔗糖对胚状体的发育起重要作用 。
不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，
一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。
在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。
维生素 (vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，
但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有
VBl(盐酸硫胺素 ),VB6(盐酸吡哆醇 ),Vpp(烟酸 ),Vc（抗坏血酸）、有时还使用生物素、
叶酸,VB12等。一般用量为 0,1— 1,0mg／ L。
有时用量较高。 VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用,VB6能促进根的生长,Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。 Vc有防止组织变褐的作用。
肌醇 (myo— inosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与 6
分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。
使用浓度一般为 lOOmg／ L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。
氨基酸 (almino acide) 是很好的有机氮源，
可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、
谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、
丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约 20种氨基酸的混合物，用量在 10-1000mg／ L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。
天然复合物
其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、
酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。
1)椰乳 是椰子的液体胚乳 。 它是使用最多,效果最大的一种天然复合物 。 一般使用浓度在 10%— 20%,与其果实成熟度及产地关系也很大 。 它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用 。 在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用,但茎尖组织的大小若超过 1nun时,椰乳就不发生作用 。
2)香蕉 用量为 150-200ml／ L。 用黄熟的小香蕉,加入培养基后变为紫色 。 对 pH值的缓冲作用大 。 主要在兰花的组织培养中应用,
对发育有促进作用 。
3)马铃薯 (potato) 去掉皮和芽后,加水煮 30min,再经过过滤,取其滤液使用 。 用量为 150— 200g／ L。 对 pH值缓冲作用也大 。 添加后可得到健壮的植株 。
4)水解酪蛋白 为蛋白质的水解物,主要成分为氨基酸,使用浓度为 100— 200mg／ L。 受酸和酶的作用易分解,使用时要注意 。
5)其他 酵母提取液 (YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液 (0.01%～ 0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，
有时有效。
植物生长调节物 (hormone)
植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、
衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。
生长素类 (auxin) 在组织培养中,生长素主要被用于诱导愈伤组织形成,
诱导根的分化和促进细胞分裂,伸长生长 。 在促进生长方面,根对生长素最敏感 。 在极低的浓度下,(10-5— 10-8rng／ L)就可促进生长,其次是茎和芽 。 天然的生长素热稳定性差,高温高压或受光条件易被破坏 。 在植物体内也易受到体内酶的分解 。 组织培养中常用人工合成的生长素类物质 。
IAA(indo acetic acid吲哚乙酸 )是天然存在的生长素,亦可人工合成,其活力较低,是生长素中活力最弱的激素,对器官形成的副作用小,,高温高压易被破坏,也易被细胞中的 1AA分解酶降解,受光也易分解 。
NAA(naphthalene acetic acid萘乙酸 )在组织培养中的起动能力要比 IAA高出 3-4倍,且由于可大批量人工合成,耐高温高压,不易被分解破坏,所以应用较普遍 。 NAA和 IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 。
IBA(indolebutyri acid吲哚丁酸 )是促进发根能力较强的生长调节物质 。
2,4— D(2,4— 二氯苯氧乙酸 )起动能力比 IAA高 10倍,特别在促进愈伤组织的形成上活力最高,但它强烈抑制芽的形成,影响器官的发育 。 适宜的用量范围较狭窄,过量常有毒效应 。
细胞分裂素类 ( cytokinin ) 这类激素是腺嘌吟的衍生物,包括 6— BA(6— 苄基氨基嘌呤 ),Kt (kinetin 激动素 ),Zt (zeatin 玉米素 )等 。 其中 Zt活性最强,但非常昂贵,常用的是 6— BA。
在培养基中添加细胞分裂素有三个作用,① 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长 。 ② 促进细胞分裂与扩大 。 ③
抑制根的分化 。 因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎,苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低 。
GA ( gibberellic acid赤霉素 ) 有 20多种,生理活性及作用的种类,部位,效应等各有不同,培养基中添加的是 GA3,主要用于促进幼苗茎的伸长生长,促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用,对形成层的分化有影响,当生长素
／赤霉素比值高时有利于木质部分化,
比值低时有利于韧皮部分化；此外,赤霉素还用于打破休眠,促进种子,块茎,
鳞茎等提前萌发 。 一般在器官形成后,
添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长 。
激素配比模式
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织,长根还是长芽 。 如为了促进芽器官的分化,
应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例 。
高 有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素 /细胞分裂素 适中 有利于根芽的分化低 有利于芽的形成
生长调节物质的使用甚微，一般用 mg／ L表示浓度。
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为 0.05-5mg／ L，细胞分裂素 0.05— 10mg
／ L。
Growth medium
is optimised for
regeneration of
plantlets
No sucrose
(0%)
Sucrose
reduced to
1%
Sucrose
increased to 5%
The explant is completely
covered with green shoots,
and roots are developing
on the lower surface
Very few shoots
have developed on
the explant,No
roots and no callus.
Shoots developed on
edges of upper surface,
and some root
development has
occured
Shoots have developed
over the surface of the
explant,along with roots
from the lower surface,
The result is comparable
with the control medium
tissue culture in the African Violet
No BAP BAP reduced to 0.1 mg,l-1
No NAA
Poor shoot
development
and no roots,
Extensive
callus
generation
Poor shoot
development and
no roots
NAA reduced
to 0.1 mg,l-1
More balanced
development of roots
and shoots,However,
undifferentiated
callus is developing
at the edges of the
explant
Profuse
development of
roots and a reduced
number of shoots,
Undifferentiated
callus is developing
at the edges of the
explant
NAA increased to 5.0
mg,l-1
Profuse development
of roots over the
explant upper and
lower surface,and few
shoots,Some callus
No MS salts
No sign of
regeneration
from explant
at all.
MS salts reduced
to 0.47 g,l-1
Some root growth
but reduced
development of
shoots
MS salts
increased to
9.52 g,l-1
Shoots
developed on
upper surface
of explant,
No roots or
callus.
培养材料的支持物
琼脂 (agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至 40~C即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于 90℃ 以上的热水。
琼脂的用量在 6— 10g／ L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间,pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。
加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触 (即吸收 )
面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是 Ca,Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，
然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。
其他 有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。
抗生物质 (antibiotic)
抗生物质有青霉素,链霉素,庆大霉素等,用量在 5—
20mg/L之间 。
添加抗生物质可防止菌类污染,减少培养中材料的损失,
尤其是快速繁殖中,常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物,采用适当的抗生素便可节约人力,物力和时间 。 尤其对大量通气长期培养,效果更好 。 对于刚感染的组织材料,可向培养基中注入 5%— 10%的抗菌素 。 抗生素各有其抑菌谱,要加以选择试用,也可两种抗生素混用 。
但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用,
可能某些植物适宜用青霉素,而另一些植物却不大适应 。
值得提醒的是,在工作中不能以为有了抗菌素,而放松灭菌措施 。 此外,在停止抗生素使用后,往往污染率显著上升,这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成 。
活性炭 (active carbon)
活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为
0.5— l0g／ L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的 5— 羟甲基糖醛及激素等。
活性炭的应用
茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于 Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阈值，一般为 0.1%— 0.2%，不能超过 0.2%。
活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，
可能是由于根顶端产生促进根生长的 IAA，但 IAA易受可见光的光氧化而破坏，
因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了 IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。
此外,在培养基中加入 0.3%活性炭,还可降低玻璃苗的产生频率,对防止产生玻璃苗有良好作用 。
活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入 0.1%
的活性炭，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。
但是,活性炭具有副作用,研究表示,每毫克的活性炭能吸附 l00ng左右的生长调节物质,这说明只需要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基中的调节物质 。 大量的活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力,因此要多加一些琼脂 。 很细的活性炭也易沉淀,通常在琼脂凝固之前,要轻轻摇动培养瓶 。 总之,那种随意抓一撮活性炭放人培养基,会带来不良的后果 。 因此,在使用时要有其量的意识,使活性炭发挥其积极作用 。
Callus culture
- creation of genetic variants via somaclonal
variation
and/or in vitro selection
- elimination of pathogens esp,viruses
- gene transfer (eg via Agrobacterium,
microprojectiles
2,Meristem culture
- clonal propagation
- elimination of pathogens
- germplasm collection and long-term storage
(eg cryopreservation)
Virus e limina tion
wh y d o e s t h e m e r i st e m h a v e
l o w /n o v i r u s titre?
– v irus spre ads p rim arily throug h
v ascul ar sy stem - this is no t
dev elo ped in the m eristem
– m itosis an d chro m oso m e
repl icatio n com pete w ith v irus
repl icatio n
– high aux in in m eriste m inh ibits
v irus rep licatio n
– a v irus,ina cti v ating,sy stem ha s
grea test activ ity in m eriste m
T ob ac co m er i st e m
v i r u s - f r e e
t i ssu e
v i r u s p a r t i cl e s
f o u n d h e r e
Virus elimination
virus elimination most useful for vegetatively reproduced species -
banana,sugarcane,potato,strawberry,sweet potato
chemotherapy and/or thermotherapy may also be used
NB,disease-free planting material may be rapidly rapidly re-
infected by insect vectors,contaminated soil or implements
the only long-term solution is genetic resistance
3,Embryo culture
- shortening breeding cycles
- creating wide hybrids (interspecific/intergeneric)
- haploid production via chromosome elimination
4,Anther/pollen/ovule culture
- production of haploids for genetic analysis
and shortening breeding programmes
- creation of genetic variants via gametoclonal
variation
5,Protoplast culture
- gene transfer
- creating wide hybrids via somatic hybridization
Plant protoplasts
