第三章 病毒和亚病毒
病毒( Virus),是一类没有细胞结构,但有遗传复制等
生命特征,主要由核酸和蛋白质组成的大分子生物。
真病毒( Euvirus)和亚病毒( subvirus)
第一节 病毒
一、病毒的特点
二、病毒的形态
三、病毒的结构与化学组成
四、噬菌体( phage)
一、病毒的特点
1、个体极小,一般直径为 20~200nm。大病毒 250~350nm,小病
毒 15~30纳米,大多数 150nm。可以通过细菌过滤器。须用电
镜放大才能被观察。
2,无细胞结构,化学组成主要是蛋白质和核酸( DNA或 RNA)
组成。在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并
可形成结晶,保持其侵染活力。
3,专性寄生,没有产能酶系,也无蛋白质合成系统,本身不具
备独立的代谢能力,只能在活的宿主细胞内生长繁殖,离开宿
主细胞不具备任何生命特征。
4、增值方式,或说繁殖方式,较简单。病毒在体外具有一般大
分子的结构,在宿主体内又具生命特征,故也称 分子生物 。在
宿主细胞协助下,通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行
增殖。
5,抵抗力,在宿主细胞内的病毒对各种化学药剂和抗菌素不敏
感 ( 可能对干扰素敏感 ) 。
? 衡量病毒大小的单位是纳米 (nm)。
? 病毒没有生长过程,故装配成熟的病毒体大小恒定不变。
微生物
种类
在无生
命的培
养基中
生长
繁殖 核酸类型
有无自
己的核
糖体
敏感性
干扰素抗生素
抗真菌的 抗细菌的
真菌 + 有性无性 D+R + + - -
细菌 +
无性
二分
裂
D+R + - + -
病毒 - 复制 D或 R - - - +
三类生物特点的比较
? 人类传染病中,约 70~80%属于病毒病,每一种植物至少有一种
病毒引起的病害。引起人类的病毒相当多,如肝炎,胆囊炎,狂
犬病,爱滋病,风湿关节炎等,也有多种病毒可以致人癌症。
天花AIDS爱滋病病毒 狂犬病病毒电镜照片
二、病毒的形态
1.病毒粒子的形态
病毒粒子 ( virion,病毒体):也称 病毒颗粒 ( virus particle),
是指成熟的、结构完整的单个病毒,即病毒个体。
病毒 形态多样,球状、棒状、杆状、螺旋状、丝状等。
病毒主要有三种基本形态:
? 球 状,这类病毒是球形,严格地说接近球形的颗粒。
大多数动物 人、真菌 病毒呈球形。
? 杆 状,包括砖形、线形、子弹状等。大多数植物 昆
虫 病毒呈杆状。
? 蝌蚪状,由球状的头部和杆状的尾部结合而成的颗
粒。大多噬菌体,如大肠杆菌 T偶数 噬菌体。
2.病毒的群体形态:
( 1)包涵体 ( inclusion body),在某些感染病毒的宿主
细胞内,出现光学显微镜可见的大小、形态和数量不等
的小体,称为包涵体。
? 它们多数位于细胞质内,具嗜酸性;少数位于细胞核内,
具嗜碱性;也有在细胞质和细胞核内都存在的类型。
? 包涵体可分成四种类型,
包涵体可分成四种类型,
① 是病毒的聚集体,如多角体病毒,昆虫病毒在进入昆虫
细胞细胞质内,再集合起来,于外面包围一层蛋白质膜,
成为一种多面体包涵含体,称为多角体病毒。
? 例如昆虫的核型多角体病毒和质型多角体病毒。
? 此外,少数动物病毒如腺病毒和呼肠孤病毒引起的包涵
体;少数植物病毒如烟草花叶病毒引起的包涵体,都是
病毒粒子的聚集体。
② 是病毒的合成部位,大多数由动物病毒引起的包涵体。
③ 是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质,例如许多由植
物病毒引起的包涵体。
④ 非病毒性包涵体,某些化学因子甚至由于细菌感染也可
引起包涵体的形成,这就不是病毒的群体形态。
在实践上,病毒的包涵体主要有两类应用,
① 用于病毒病的诊断:由于包涵体具有其特定的形态构造
和特性,故可用作鉴定相应病毒的一种手段。 例如,同
属于马铃薯 Y族病毒的烟草蚀纹病毒和马铃薯 Y病毒,两
者虽在形态上极其相似,但它们所引起的包涵体的形态
却截然不同,前者为三角形,后者为矩形。由于不是所
有的病毒都能引起产生包涵体,加上若干非病毒的因子
也可形成包涵体状结构,所以,包涵体只能用于病毒病
的辅助诊断指标。
② 用于生物防治:由于在昆虫的包涵体内含有大量活性病
毒,因此可用于生产生物防治剂。
( 2)噬菌斑( plaque)
? 将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后,将此混合液与
45℃ 左右的琼脂培养基在培养皿中充分混匀,铺平后培
养。经数小时至 10余小时后,在平板表面布满宿主细胞
的菌苔上,由于噬菌体的侵入和增值,而呈现出肉眼可
见的一个个透亮不长菌的小圆斑,称之为噬菌斑。
? 噬菌斑的形成:
? 噬菌斑的形成:
? 当一个噬菌体侵染一个敏感细胞后,隔不久即释放出一群
子代噬菌体,它们通过琼脂层的扩散又侵染周围的宿主细
胞,并引起它们裂解,如此经过多次重复,就出现了一个
由无数噬菌体粒子构成的群体 — 噬菌斑。
? 由此可见,噬菌斑的形成与细菌菌落的形成有点相似,所
不同的只是噬菌斑甚像一个“负菌落”。噬菌斑的形成可
用以检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数,有关
内容详见本节中的”噬菌斑与噬菌体效价的测定”。
( 3)空 斑
? 在覆盖一薄层琼脂的一片单层细胞上,如某一细胞感
染有病毒,则增殖后的病毒粒子只能扩散至邻近的细
胞,最终形成一个与噬菌斑类似的空斑 。如果用中性
红等活性染料加以染色,不但可以区分活细胞和死细
胞,而且可使空斑更为清晰。
( 4)枯 斑
? 枯斑是植物叶片上的植物病毒群体 。可用枯斑法测定
烟草花叶病毒 (TMV)的数目。方法是把试样与少许
金刚砂相混,然后在烟叶子上轻轻摩擦,2~3天后,叶
子上出现的局部坏死灶即枯斑。
烟草花叶病( TMV)
烟草花叶病感染兰花
三、病毒的结构与化学组成
(一)病毒的结构
( 1) 病毒体 ( virion)
核心(基因组)
衣壳 由衣壳粒组成
? 核心的功能:遗传信息的载体。
? 衣壳的功能, ① 保护基因组(核酸)免受核酸酶或其它不利因素
的破坏; ② 决定病毒感染的特异性,并能介导病毒核酸进入宿主细胞;
③ 具有抗原性能刺激机体产生相应抗体。
核
衣
壳
( 2) 包膜, 某些病毒在核衣壳外面,包围着一层由 类
脂或脂蛋白组成 的结构比较复杂的包膜。 少数病毒的
包膜表面 还有针状突起,称为 刺突 。
? 包膜实际上是来自宿主细胞膜但被病毒改造成具有其
独特抗原特性的膜状结构,故易被乙醚等脂溶剂所破
坏。
烟
草
花
叶
病
毒
结
构
腺
病
毒
结
构
噬菌体
(二)对称型式主要有三种
螺旋对称型、二十面体对称型和复合对称型。
1,螺旋对称的代表 —— 烟草花叶病毒 (TMV)
? TMV呈直杆状,长 300nm,宽 15nm,中空(内径 4nm)。含 95%蛋白
质和 5%单链 RNA( ssRNA)。
? 它共有 2130个呈皮鞋状的蛋白质亚基 (衣壳粒 )组成。每个亚基由 158个
氨基酸组成,分子量为 17500。亚基以逆时针方向螺旋排列,共 130圈
(螺距 2.3nm,每圈有 16.33个亚基)。
? ssRNA由 6390个核苷酸单位组成,分子量为 2× 106。它位于距轴中心
4nm处以相等的螺距绕于蛋白质外壳内,每 3个核苷酸与一个蛋白亚基
相结合,圈为 49个核苷酸。
2.二十面体对称的代表 —— 腺病毒( Adenovirus)
? 这是一种动物病毒,它可侵染呼吸道、眼结膜和淋巴组织,
是急性咽类、咽结膜炎、流行性角膜结膜炎和病毒性肺炎
等的病原体。
? 腺病毒的种类很多( 80年代初已有 80多种 ),它们的自然
宿主有人、猴、牛、犬、鼠、鸟和蛙等 。
? 腺病毒的外形呈典型的二十面体,粗看像“球状”,没有
包膜,直径为 70~80nm。它有 12个角,20个面和 30条棱。
衣壳由 252个衣壳粒组成,内有称作 五邻
体 的衣壳粒 12个 (分子量各为 7× 104Da),
分布在 12个顶角上,还有称作 六邻体 的衣
壳粒 240个(分子量各为 1.2× 105Da),均
匀分布在 20个面上。每个五邻体上突出一
根末端带有顶球的蛋白纤维,称为 刺突 。
? 腺病毒的核心是由线状双链 DNA (dsDNA)构成的。其基因组
的大小都约为 36500个碱基对。
? 腺病毒只能培养在人的组织细胞上,尤其适合长在人胎肾
组织细胞上。不能在鸡胚上生长。腺病毒在宿主的细胞核
中进行增殖和装配,并能使宿主细胞形成包涵体。
3,复合对称的代表 --T偶数噬菌体
? 大肠杆菌的 T偶数噬菌体共有三种,即 T2,T4和 T6,在自
然界分布极广,它们是病毒学和分子遗传学研究中的极好
材料,因此对它们的了解极其深刻,尤其是 T4早已有了十
分清晰的电镜照片和最完整的基因组图。
? T4的模式结构见图。由图可知,T4由 头部、颈部和尾部 三
个部分构成。由于头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称,
故是一种复合对称结构。
T4由 头部、颈部和尾
部 三个部分构成
头部 在电镜下呈椭圆
形二十面体。 核心
dsDNA 。
颈部 是头部与尾部相
连处简单的构造,由
颈环和颈须构成。颈
环为一六角形的盘状
构造,有 6根颈须自颈
环上发出,其功能是
裹住吸附前的尾丝。
尾部,尾鞘、尾管、基板、刺突和尾丝。
尾鞘 长约 95nm,伸展时螺旋转数为 24,
收缩时尾鞘变得短而粗,螺旋转数减至
12。
尾管 在尾鞘内部,长 80~ 100nm,由两
种结构蛋白组成。尾管中空,感染时,
病毒 DNA由头部通过尾管进入细胞。与
尾鞘一样,也是有 24个螺转的螺旋结构。
因此是头部核酸注入宿主细胞时的必经
之路。
基板 连接在尾部末端,为六角形、结构
复杂的盘状物,中空;基板上长着 6根
尾丝和 6个刺突。刺突有吸附功能。
尾丝 共有 6根,直径约 2nm,长约 65nm。
折成等长的两段。尾丝是由 2种分子量
较大的蛋白质和 4种分子量较小的蛋白
质分子构成,它具有专一地吸附在敏感
宿主细胞表面的相应受体上的功能。
T偶数噬菌体虽呈蝌蚪状,
但吸附却是通过尾部的尾
丝。尾丝吸附后,会使基
板受到构型的刺激,接着
尾鞘蛋白发生收缩,使尾
管插入宿主细胞。尾鞘收
缩时,其 144个蛋白亚基发
生复杂的移位效应,使原
有尾鞘的长度缩成一半,
因此,与肌纤维蛋白的收
缩十分相似。
(三)病毒的化学组成
简单病毒的化学组成只含 核酸 和 蛋白质 。
复杂还含有脂质、碳水化合物、多糖(以糖脂、糖蛋白存在),以及有
机阳离子化合物如胺、无机阳离(铁、钙、镁、铜、铝离子等)。
1,病毒 核酸,每一种病毒只含单一类型的核酸。病毒核酸
储存着病毒的遗传信息,控制着病毒的遗传、变异和增
殖,以及对寄主的感染性等。
动植物病毒核酸类型,dsDNA,ssDNA,dsRNA, ss RNA。
病毒其核酸含量占 1~5%不等。
2.病毒 蛋白质,蛋白质是病毒的主要成分,占 95%左右,
蛋白质的主要作用:
①构成病毒粒子外壳,保护核酸;
②具有识别能力,一定的病毒只感染一定的对象;
③具有抗原性;
④构成病毒组成中的酶。
3,病毒的其他物质,如脂质,碳水化合物,多糖,以及
有机阳离子化合物如胺,无机阳离子等。
四,噬菌体( phage)
四类病毒:
原核生物的病毒 —— 噬菌体
植物病毒
人类和脊椎动物病毒
昆虫病毒
(一) 噬菌体
噬菌体( phage,bacteriomphage):是微生物病毒,是
侵染细菌、放线菌、真菌等细胞型微生物的病毒。
噬菌体的发现,Fredrick W,Twort(陶 ·尔特) 1915在英格
兰; Felix D Herell e(海迪来尔) 1917在巴黎,他们把
培养好的细菌培养物,加进某些污水样品后,经过一
定时间后会澄清,或者菌落上出现亮斑,后来证明是
细菌病毒。
一种噬菌体感染大肠杆菌
一组噬菌体
1、噬菌体的形态和结构
( 1)噬菌体的形状,蝌蚪形、球形、丝状。
根据形态的差异又可分为六群。
( 2)噬菌体的化学组成。
( 3)噬菌体的结构(以大肠杆菌 T偶数噬菌体为代表)
2、噬菌体的增殖 —— 烈性噬菌体
烈性噬菌体,噬菌体感染细菌细胞后,在细胞内增殖,凡导
致寄主细胞裂解的叫 烈性噬菌体 或 毒性噬菌体 。
温和噬菌体,而不使寄主细胞发生裂解,只是它们的核酸和
寄主细胞发生同步复制,这类噬菌体称为 温和噬菌体 。
? 通常把烈性噬菌体看作是噬菌体的正常表现。毒性噬菌
体入侵寄主的过程可以分为五个阶段。
噬菌体的增殖过程:
(1)吸附 (adsorption),噬菌体与敏感的寄主
细胞接触,在寄主细胞的特异性受点上结
合。 T2噬菌体是以尾部末端和寄主的受点
吸附的。一种细菌可以被多种噬菌体感染,
噬菌体在同一寄主细菌的不同受点上吸附。
(2)侵入 (penetration),噬菌体吸附在细菌细胞壁
的受点上以后,核酸注入细菌细胞中,蛋白质壳
体留在外面。从吸附到侵入,时间间隔很短,只
有几秒到几分钟。
(3)复制 (replication),噬菌体的 DNA进入
细胞后,寄主细胞产生一系列变化,细菌
的合成作用受到阻抑,噬菌体逐渐控制细
胞的代谢,由噬菌体 DNA 为模板,在寄主
细胞一系列酶的作用下,合成装配噬菌体
所需的 DNA或 RNA和蛋白质。
(4)装配 (assembly),实际上是其已合
成的各部件的装配过程。 DNA分子
的缩和、衣壳包裹 DNA而形成头部、
尾丝尾部的其他部件装配、头尾结合、
最后尾丝的装配。
(5)释放 (liberation),成熟的噬菌
体粒子诱导形成脂酶和溶菌酶裂
解寄主细胞,释放新的噬菌体。
噬菌体的装配 (assembly),实际上是其已合成的各部件的
装配过程。在 T2噬菌体的装配过程中,约有 30个不同的蛋
白质和至少 47个基因参与,主要步骤有,DNA分子缩合,
通过衣壳包裹 DNA而形成头部,尾丝和尾部的其他部件独
立装配完成,头部与尾部相结合,最后装上尾丝。
3、一步生长曲线:
定量描述烈性噬菌体
生长规律的实验曲线
称为一步生长曲线。
潜伏期,裂解期,平
稳期。
? 一步生长曲线实验最早由 Ellis和 Delbruck( 1939)所设计。
? 其基本步骤是:
1)用噬菌体的稀悬液去感染高浓度的宿主细胞,以保证每个细胞
至多不超过一个噬菌体吸附。
2)经数分钟吸附后,混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清,
借以中和尚未吸附的噬菌体。
3)然后用保温的培养液稀释此混合液,同时可中止抗血清的作用。
随即臵于该细菌最适生长温度下培养。
4)在一定的时间内,每隔数分钟从混合悬液中取出一份试样,并
作效价测定。
4、噬菌体效价的测定
效价( titre,tirer):表示每毫升试样中所含的具有侵染
性的噬菌体粒子数,又称噬菌斑形成单位数或感染中
心数。
根据测定,直径 2mm的噬菌斑,所含噬菌体粒子数达
107~ 109个。
方法:双层平板法( two layer plating method)
双层平板法:
? 预先分别配制含 2%和 1%琼脂的底层培养
基和上层培养基。先用前者在培养皿上浇
一层平板,再在后者中加入较浓的对数期
敏感菌和一定体积的待测噬菌体样品,于
试管中充分混匀后,立即倒在底层平板上
铺平待凝,然后保温。一般经十余小时后
即可进行噬菌斑计数。
? 双层平板法主要有以下几个优点;
? ①加了底层培养基,可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得以弥补;
? ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上,因此不仅每一噬菌
斑的大小接近、边缘清晰,且不致发生上下噬菌斑的重叠现象;
? ③因上层培养基中琼脂较稀,故形成的噬菌斑较大,有利于计数。
5、温和噬菌体
?温和噬菌体 不影响细菌的正常生命活动,而是将基因整合到细菌染
色体上,成为寄主细胞染色体的附加体,当细菌进行分裂时,与细
菌的染色体同步复制;分别进入两个子细胞的基因中。
?寄主细胞内温和噬菌体的 DNA称为原噬菌体。带有原噬菌体的寄主
细胞称为 溶源细胞(溶源菌) 。这种温和噬菌体侵入宿主细胞而不
引起宿主细胞裂解,即称 溶源性 或 溶源现象 。
概括地说,温和噬菌体的特点为:
① 具有整合能力,当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞
后,前者的核酸可整合到后者的核基因组上。
② 具有同步复制能力,原噬菌体在一般情况下不进行复
制和增殖,而是随宿主细胞的核基因组的复制而同步
复制,并平均分布到两个子代细胞中去,如此代代相
传。
由此可见,温和噬菌体的存在形式有三种:
① 游离态,指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子;
② 整合态,指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态
(一种潜伏的形式)
③ 营养态,指前噬菌体经外界理化因子诱导后,脱离宿主
核基因组而处于积极复制和装配的状态。
? 温和噬菌体的种类很多,常见的有 E.coli的 λ,Mu-1,P-
1和 P-2噬菌体等。其中,λ噬菌体是研究最为透彻的一
种温和噬菌体。
E,Coli K12(λ),表示一株带有 λ前噬菌体的大肠杆菌 K12溶源菌株。
检验溶源菌的方法,是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合,然
后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌落。由
于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解,其释放的噬菌体
可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔,所以会产生一个个中央有溶
源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。
(二)植物病毒
植物病毒大部分属于 ssRNA病毒,其基本形态有杆状、
丝状和等轴对称的近球状二十面体,一般没有包膜。
植物患病毒病后,主要出现三类症状:
①因叶绿体被破坏或不能合成新的叶绿素,而引起花叶、
黄化或红化等症状;
②植株发生矮化、丛枝或畸形等;
③形成枯斑或坏死等症状。
(三)人类和脊椎动物病毒
? 在人类、哺乳动物、禽类、两栖类、爬行类和鱼类等各种脊椎
动物中,广泛存在着相应的病毒。
? 常见的如流行性感冒、麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、肝炎、疱
疹、流行性乙型脑炎、爱滋病以及狂犬病等。
? 此外,据估计,在人类的恶性肿瘤中,约有 15%是由于病毒的
感染而诱发的。
? 家畜和其他哺乳动物中的病毒病也极为普遍,如猪瘟、牛瘟、
口蹄疫、马传染性病毒病和兔的乳头状瘤等。家禽中则有鸡新
城疫、鸡瘟和鸡的劳斯氏肉瘤等。
(四)昆虫病毒
大多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成包涵体。由于昆虫病毒的包涵
体在显微镜下一般均呈多角状,因此称为 多角体 。
多角体一般具有这样几个特点:
①外形呈多角、多面体;
②大小一般在 0.5~ 10μm间,多数约 3μm;
③成分为碱溶性结晶蛋白;
④其内包裹着数目不等的病毒粒子;
⑤具有保护病毒粒子抵御不良环境的功能;
⑥可在细胞核或细胞质内形成。
可把昆虫病毒分成以下几类:
1.核型多角体病毒( NPV,nuclear polyhedrosis virus)
? 是一类在昆虫细胞核内增殖的、具有蛋白质包涵体的杆状病毒。
它的数量在昆虫病毒中占首位。
2.质型多角体病毒( CPV,cytoplasmic polyhedrosis virus)
? 指一类在昆虫细胞质内增殖的、具有蛋白质包涵体的一种球状
病毒。
3.颗粒体病毒( GV,granulosisvirus)
? 这是一类具有蛋白质包涵体、每个包涵体内一般仅含一个病毒
粒子的昆虫杆状病毒。
病毒( Virus),是一类没有细胞结构,但有遗传复制等
生命特征,主要由核酸和蛋白质组成的大分子生物。
真病毒( Euvirus)和亚病毒( subvirus)
第一节 病毒
一、病毒的特点
二、病毒的形态
三、病毒的结构与化学组成
四、噬菌体( phage)
一、病毒的特点
1、个体极小,一般直径为 20~200nm。大病毒 250~350nm,小病
毒 15~30纳米,大多数 150nm。可以通过细菌过滤器。须用电
镜放大才能被观察。
2,无细胞结构,化学组成主要是蛋白质和核酸( DNA或 RNA)
组成。在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并
可形成结晶,保持其侵染活力。
3,专性寄生,没有产能酶系,也无蛋白质合成系统,本身不具
备独立的代谢能力,只能在活的宿主细胞内生长繁殖,离开宿
主细胞不具备任何生命特征。
4、增值方式,或说繁殖方式,较简单。病毒在体外具有一般大
分子的结构,在宿主体内又具生命特征,故也称 分子生物 。在
宿主细胞协助下,通过核酸的复制和核酸蛋白装配的形式进行
增殖。
5,抵抗力,在宿主细胞内的病毒对各种化学药剂和抗菌素不敏
感 ( 可能对干扰素敏感 ) 。
? 衡量病毒大小的单位是纳米 (nm)。
? 病毒没有生长过程,故装配成熟的病毒体大小恒定不变。
微生物
种类
在无生
命的培
养基中
生长
繁殖 核酸类型
有无自
己的核
糖体
敏感性
干扰素抗生素
抗真菌的 抗细菌的
真菌 + 有性无性 D+R + + - -
细菌 +
无性
二分
裂
D+R + - + -
病毒 - 复制 D或 R - - - +
三类生物特点的比较
? 人类传染病中,约 70~80%属于病毒病,每一种植物至少有一种
病毒引起的病害。引起人类的病毒相当多,如肝炎,胆囊炎,狂
犬病,爱滋病,风湿关节炎等,也有多种病毒可以致人癌症。
天花AIDS爱滋病病毒 狂犬病病毒电镜照片
二、病毒的形态
1.病毒粒子的形态
病毒粒子 ( virion,病毒体):也称 病毒颗粒 ( virus particle),
是指成熟的、结构完整的单个病毒,即病毒个体。
病毒 形态多样,球状、棒状、杆状、螺旋状、丝状等。
病毒主要有三种基本形态:
? 球 状,这类病毒是球形,严格地说接近球形的颗粒。
大多数动物 人、真菌 病毒呈球形。
? 杆 状,包括砖形、线形、子弹状等。大多数植物 昆
虫 病毒呈杆状。
? 蝌蚪状,由球状的头部和杆状的尾部结合而成的颗
粒。大多噬菌体,如大肠杆菌 T偶数 噬菌体。
2.病毒的群体形态:
( 1)包涵体 ( inclusion body),在某些感染病毒的宿主
细胞内,出现光学显微镜可见的大小、形态和数量不等
的小体,称为包涵体。
? 它们多数位于细胞质内,具嗜酸性;少数位于细胞核内,
具嗜碱性;也有在细胞质和细胞核内都存在的类型。
? 包涵体可分成四种类型,
包涵体可分成四种类型,
① 是病毒的聚集体,如多角体病毒,昆虫病毒在进入昆虫
细胞细胞质内,再集合起来,于外面包围一层蛋白质膜,
成为一种多面体包涵含体,称为多角体病毒。
? 例如昆虫的核型多角体病毒和质型多角体病毒。
? 此外,少数动物病毒如腺病毒和呼肠孤病毒引起的包涵
体;少数植物病毒如烟草花叶病毒引起的包涵体,都是
病毒粒子的聚集体。
② 是病毒的合成部位,大多数由动物病毒引起的包涵体。
③ 是病毒蛋白和与病毒感染有关的蛋白质,例如许多由植
物病毒引起的包涵体。
④ 非病毒性包涵体,某些化学因子甚至由于细菌感染也可
引起包涵体的形成,这就不是病毒的群体形态。
在实践上,病毒的包涵体主要有两类应用,
① 用于病毒病的诊断:由于包涵体具有其特定的形态构造
和特性,故可用作鉴定相应病毒的一种手段。 例如,同
属于马铃薯 Y族病毒的烟草蚀纹病毒和马铃薯 Y病毒,两
者虽在形态上极其相似,但它们所引起的包涵体的形态
却截然不同,前者为三角形,后者为矩形。由于不是所
有的病毒都能引起产生包涵体,加上若干非病毒的因子
也可形成包涵体状结构,所以,包涵体只能用于病毒病
的辅助诊断指标。
② 用于生物防治:由于在昆虫的包涵体内含有大量活性病
毒,因此可用于生产生物防治剂。
( 2)噬菌斑( plaque)
? 将少量噬菌体与大量宿主细胞混合后,将此混合液与
45℃ 左右的琼脂培养基在培养皿中充分混匀,铺平后培
养。经数小时至 10余小时后,在平板表面布满宿主细胞
的菌苔上,由于噬菌体的侵入和增值,而呈现出肉眼可
见的一个个透亮不长菌的小圆斑,称之为噬菌斑。
? 噬菌斑的形成:
? 噬菌斑的形成:
? 当一个噬菌体侵染一个敏感细胞后,隔不久即释放出一群
子代噬菌体,它们通过琼脂层的扩散又侵染周围的宿主细
胞,并引起它们裂解,如此经过多次重复,就出现了一个
由无数噬菌体粒子构成的群体 — 噬菌斑。
? 由此可见,噬菌斑的形成与细菌菌落的形成有点相似,所
不同的只是噬菌斑甚像一个“负菌落”。噬菌斑的形成可
用以检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数,有关
内容详见本节中的”噬菌斑与噬菌体效价的测定”。
( 3)空 斑
? 在覆盖一薄层琼脂的一片单层细胞上,如某一细胞感
染有病毒,则增殖后的病毒粒子只能扩散至邻近的细
胞,最终形成一个与噬菌斑类似的空斑 。如果用中性
红等活性染料加以染色,不但可以区分活细胞和死细
胞,而且可使空斑更为清晰。
( 4)枯 斑
? 枯斑是植物叶片上的植物病毒群体 。可用枯斑法测定
烟草花叶病毒 (TMV)的数目。方法是把试样与少许
金刚砂相混,然后在烟叶子上轻轻摩擦,2~3天后,叶
子上出现的局部坏死灶即枯斑。
烟草花叶病( TMV)
烟草花叶病感染兰花
三、病毒的结构与化学组成
(一)病毒的结构
( 1) 病毒体 ( virion)
核心(基因组)
衣壳 由衣壳粒组成
? 核心的功能:遗传信息的载体。
? 衣壳的功能, ① 保护基因组(核酸)免受核酸酶或其它不利因素
的破坏; ② 决定病毒感染的特异性,并能介导病毒核酸进入宿主细胞;
③ 具有抗原性能刺激机体产生相应抗体。
核
衣
壳
( 2) 包膜, 某些病毒在核衣壳外面,包围着一层由 类
脂或脂蛋白组成 的结构比较复杂的包膜。 少数病毒的
包膜表面 还有针状突起,称为 刺突 。
? 包膜实际上是来自宿主细胞膜但被病毒改造成具有其
独特抗原特性的膜状结构,故易被乙醚等脂溶剂所破
坏。
烟
草
花
叶
病
毒
结
构
腺
病
毒
结
构
噬菌体
(二)对称型式主要有三种
螺旋对称型、二十面体对称型和复合对称型。
1,螺旋对称的代表 —— 烟草花叶病毒 (TMV)
? TMV呈直杆状,长 300nm,宽 15nm,中空(内径 4nm)。含 95%蛋白
质和 5%单链 RNA( ssRNA)。
? 它共有 2130个呈皮鞋状的蛋白质亚基 (衣壳粒 )组成。每个亚基由 158个
氨基酸组成,分子量为 17500。亚基以逆时针方向螺旋排列,共 130圈
(螺距 2.3nm,每圈有 16.33个亚基)。
? ssRNA由 6390个核苷酸单位组成,分子量为 2× 106。它位于距轴中心
4nm处以相等的螺距绕于蛋白质外壳内,每 3个核苷酸与一个蛋白亚基
相结合,圈为 49个核苷酸。
2.二十面体对称的代表 —— 腺病毒( Adenovirus)
? 这是一种动物病毒,它可侵染呼吸道、眼结膜和淋巴组织,
是急性咽类、咽结膜炎、流行性角膜结膜炎和病毒性肺炎
等的病原体。
? 腺病毒的种类很多( 80年代初已有 80多种 ),它们的自然
宿主有人、猴、牛、犬、鼠、鸟和蛙等 。
? 腺病毒的外形呈典型的二十面体,粗看像“球状”,没有
包膜,直径为 70~80nm。它有 12个角,20个面和 30条棱。
衣壳由 252个衣壳粒组成,内有称作 五邻
体 的衣壳粒 12个 (分子量各为 7× 104Da),
分布在 12个顶角上,还有称作 六邻体 的衣
壳粒 240个(分子量各为 1.2× 105Da),均
匀分布在 20个面上。每个五邻体上突出一
根末端带有顶球的蛋白纤维,称为 刺突 。
? 腺病毒的核心是由线状双链 DNA (dsDNA)构成的。其基因组
的大小都约为 36500个碱基对。
? 腺病毒只能培养在人的组织细胞上,尤其适合长在人胎肾
组织细胞上。不能在鸡胚上生长。腺病毒在宿主的细胞核
中进行增殖和装配,并能使宿主细胞形成包涵体。
3,复合对称的代表 --T偶数噬菌体
? 大肠杆菌的 T偶数噬菌体共有三种,即 T2,T4和 T6,在自
然界分布极广,它们是病毒学和分子遗传学研究中的极好
材料,因此对它们的了解极其深刻,尤其是 T4早已有了十
分清晰的电镜照片和最完整的基因组图。
? T4的模式结构见图。由图可知,T4由 头部、颈部和尾部 三
个部分构成。由于头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称,
故是一种复合对称结构。
T4由 头部、颈部和尾
部 三个部分构成
头部 在电镜下呈椭圆
形二十面体。 核心
dsDNA 。
颈部 是头部与尾部相
连处简单的构造,由
颈环和颈须构成。颈
环为一六角形的盘状
构造,有 6根颈须自颈
环上发出,其功能是
裹住吸附前的尾丝。
尾部,尾鞘、尾管、基板、刺突和尾丝。
尾鞘 长约 95nm,伸展时螺旋转数为 24,
收缩时尾鞘变得短而粗,螺旋转数减至
12。
尾管 在尾鞘内部,长 80~ 100nm,由两
种结构蛋白组成。尾管中空,感染时,
病毒 DNA由头部通过尾管进入细胞。与
尾鞘一样,也是有 24个螺转的螺旋结构。
因此是头部核酸注入宿主细胞时的必经
之路。
基板 连接在尾部末端,为六角形、结构
复杂的盘状物,中空;基板上长着 6根
尾丝和 6个刺突。刺突有吸附功能。
尾丝 共有 6根,直径约 2nm,长约 65nm。
折成等长的两段。尾丝是由 2种分子量
较大的蛋白质和 4种分子量较小的蛋白
质分子构成,它具有专一地吸附在敏感
宿主细胞表面的相应受体上的功能。
T偶数噬菌体虽呈蝌蚪状,
但吸附却是通过尾部的尾
丝。尾丝吸附后,会使基
板受到构型的刺激,接着
尾鞘蛋白发生收缩,使尾
管插入宿主细胞。尾鞘收
缩时,其 144个蛋白亚基发
生复杂的移位效应,使原
有尾鞘的长度缩成一半,
因此,与肌纤维蛋白的收
缩十分相似。
(三)病毒的化学组成
简单病毒的化学组成只含 核酸 和 蛋白质 。
复杂还含有脂质、碳水化合物、多糖(以糖脂、糖蛋白存在),以及有
机阳离子化合物如胺、无机阳离(铁、钙、镁、铜、铝离子等)。
1,病毒 核酸,每一种病毒只含单一类型的核酸。病毒核酸
储存着病毒的遗传信息,控制着病毒的遗传、变异和增
殖,以及对寄主的感染性等。
动植物病毒核酸类型,dsDNA,ssDNA,dsRNA, ss RNA。
病毒其核酸含量占 1~5%不等。
2.病毒 蛋白质,蛋白质是病毒的主要成分,占 95%左右,
蛋白质的主要作用:
①构成病毒粒子外壳,保护核酸;
②具有识别能力,一定的病毒只感染一定的对象;
③具有抗原性;
④构成病毒组成中的酶。
3,病毒的其他物质,如脂质,碳水化合物,多糖,以及
有机阳离子化合物如胺,无机阳离子等。
四,噬菌体( phage)
四类病毒:
原核生物的病毒 —— 噬菌体
植物病毒
人类和脊椎动物病毒
昆虫病毒
(一) 噬菌体
噬菌体( phage,bacteriomphage):是微生物病毒,是
侵染细菌、放线菌、真菌等细胞型微生物的病毒。
噬菌体的发现,Fredrick W,Twort(陶 ·尔特) 1915在英格
兰; Felix D Herell e(海迪来尔) 1917在巴黎,他们把
培养好的细菌培养物,加进某些污水样品后,经过一
定时间后会澄清,或者菌落上出现亮斑,后来证明是
细菌病毒。
一种噬菌体感染大肠杆菌
一组噬菌体
1、噬菌体的形态和结构
( 1)噬菌体的形状,蝌蚪形、球形、丝状。
根据形态的差异又可分为六群。
( 2)噬菌体的化学组成。
( 3)噬菌体的结构(以大肠杆菌 T偶数噬菌体为代表)
2、噬菌体的增殖 —— 烈性噬菌体
烈性噬菌体,噬菌体感染细菌细胞后,在细胞内增殖,凡导
致寄主细胞裂解的叫 烈性噬菌体 或 毒性噬菌体 。
温和噬菌体,而不使寄主细胞发生裂解,只是它们的核酸和
寄主细胞发生同步复制,这类噬菌体称为 温和噬菌体 。
? 通常把烈性噬菌体看作是噬菌体的正常表现。毒性噬菌
体入侵寄主的过程可以分为五个阶段。
噬菌体的增殖过程:
(1)吸附 (adsorption),噬菌体与敏感的寄主
细胞接触,在寄主细胞的特异性受点上结
合。 T2噬菌体是以尾部末端和寄主的受点
吸附的。一种细菌可以被多种噬菌体感染,
噬菌体在同一寄主细菌的不同受点上吸附。
(2)侵入 (penetration),噬菌体吸附在细菌细胞壁
的受点上以后,核酸注入细菌细胞中,蛋白质壳
体留在外面。从吸附到侵入,时间间隔很短,只
有几秒到几分钟。
(3)复制 (replication),噬菌体的 DNA进入
细胞后,寄主细胞产生一系列变化,细菌
的合成作用受到阻抑,噬菌体逐渐控制细
胞的代谢,由噬菌体 DNA 为模板,在寄主
细胞一系列酶的作用下,合成装配噬菌体
所需的 DNA或 RNA和蛋白质。
(4)装配 (assembly),实际上是其已合
成的各部件的装配过程。 DNA分子
的缩和、衣壳包裹 DNA而形成头部、
尾丝尾部的其他部件装配、头尾结合、
最后尾丝的装配。
(5)释放 (liberation),成熟的噬菌
体粒子诱导形成脂酶和溶菌酶裂
解寄主细胞,释放新的噬菌体。
噬菌体的装配 (assembly),实际上是其已合成的各部件的
装配过程。在 T2噬菌体的装配过程中,约有 30个不同的蛋
白质和至少 47个基因参与,主要步骤有,DNA分子缩合,
通过衣壳包裹 DNA而形成头部,尾丝和尾部的其他部件独
立装配完成,头部与尾部相结合,最后装上尾丝。
3、一步生长曲线:
定量描述烈性噬菌体
生长规律的实验曲线
称为一步生长曲线。
潜伏期,裂解期,平
稳期。
? 一步生长曲线实验最早由 Ellis和 Delbruck( 1939)所设计。
? 其基本步骤是:
1)用噬菌体的稀悬液去感染高浓度的宿主细胞,以保证每个细胞
至多不超过一个噬菌体吸附。
2)经数分钟吸附后,混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清,
借以中和尚未吸附的噬菌体。
3)然后用保温的培养液稀释此混合液,同时可中止抗血清的作用。
随即臵于该细菌最适生长温度下培养。
4)在一定的时间内,每隔数分钟从混合悬液中取出一份试样,并
作效价测定。
4、噬菌体效价的测定
效价( titre,tirer):表示每毫升试样中所含的具有侵染
性的噬菌体粒子数,又称噬菌斑形成单位数或感染中
心数。
根据测定,直径 2mm的噬菌斑,所含噬菌体粒子数达
107~ 109个。
方法:双层平板法( two layer plating method)
双层平板法:
? 预先分别配制含 2%和 1%琼脂的底层培养
基和上层培养基。先用前者在培养皿上浇
一层平板,再在后者中加入较浓的对数期
敏感菌和一定体积的待测噬菌体样品,于
试管中充分混匀后,立即倒在底层平板上
铺平待凝,然后保温。一般经十余小时后
即可进行噬菌斑计数。
? 双层平板法主要有以下几个优点;
? ①加了底层培养基,可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得以弥补;
? ②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上,因此不仅每一噬菌
斑的大小接近、边缘清晰,且不致发生上下噬菌斑的重叠现象;
? ③因上层培养基中琼脂较稀,故形成的噬菌斑较大,有利于计数。
5、温和噬菌体
?温和噬菌体 不影响细菌的正常生命活动,而是将基因整合到细菌染
色体上,成为寄主细胞染色体的附加体,当细菌进行分裂时,与细
菌的染色体同步复制;分别进入两个子细胞的基因中。
?寄主细胞内温和噬菌体的 DNA称为原噬菌体。带有原噬菌体的寄主
细胞称为 溶源细胞(溶源菌) 。这种温和噬菌体侵入宿主细胞而不
引起宿主细胞裂解,即称 溶源性 或 溶源现象 。
概括地说,温和噬菌体的特点为:
① 具有整合能力,当温和噬菌体侵入其敏感宿主的细胞
后,前者的核酸可整合到后者的核基因组上。
② 具有同步复制能力,原噬菌体在一般情况下不进行复
制和增殖,而是随宿主细胞的核基因组的复制而同步
复制,并平均分布到两个子代细胞中去,如此代代相
传。
由此可见,温和噬菌体的存在形式有三种:
① 游离态,指已成熟释放并有侵染性的游离噬菌体粒子;
② 整合态,指整合在宿主核染色体上处于前噬菌体的状态
(一种潜伏的形式)
③ 营养态,指前噬菌体经外界理化因子诱导后,脱离宿主
核基因组而处于积极复制和装配的状态。
? 温和噬菌体的种类很多,常见的有 E.coli的 λ,Mu-1,P-
1和 P-2噬菌体等。其中,λ噬菌体是研究最为透彻的一
种温和噬菌体。
E,Coli K12(λ),表示一株带有 λ前噬菌体的大肠杆菌 K12溶源菌株。
检验溶源菌的方法,是将少量溶源菌与大量的敏感性指示菌相混合,然
后与琼脂培养基混匀后倒一平板。过一段时间后溶源菌就长成菌落。由
于在溶源菌分裂过程中有极少数个体会发生自发裂解,其释放的噬菌体
可不断侵染溶源菌菌落周围的指示菌菌苔,所以会产生一个个中央有溶
源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。
(二)植物病毒
植物病毒大部分属于 ssRNA病毒,其基本形态有杆状、
丝状和等轴对称的近球状二十面体,一般没有包膜。
植物患病毒病后,主要出现三类症状:
①因叶绿体被破坏或不能合成新的叶绿素,而引起花叶、
黄化或红化等症状;
②植株发生矮化、丛枝或畸形等;
③形成枯斑或坏死等症状。
(三)人类和脊椎动物病毒
? 在人类、哺乳动物、禽类、两栖类、爬行类和鱼类等各种脊椎
动物中,广泛存在着相应的病毒。
? 常见的如流行性感冒、麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、肝炎、疱
疹、流行性乙型脑炎、爱滋病以及狂犬病等。
? 此外,据估计,在人类的恶性肿瘤中,约有 15%是由于病毒的
感染而诱发的。
? 家畜和其他哺乳动物中的病毒病也极为普遍,如猪瘟、牛瘟、
口蹄疫、马传染性病毒病和兔的乳头状瘤等。家禽中则有鸡新
城疫、鸡瘟和鸡的劳斯氏肉瘤等。
(四)昆虫病毒
大多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成包涵体。由于昆虫病毒的包涵
体在显微镜下一般均呈多角状,因此称为 多角体 。
多角体一般具有这样几个特点:
①外形呈多角、多面体;
②大小一般在 0.5~ 10μm间,多数约 3μm;
③成分为碱溶性结晶蛋白;
④其内包裹着数目不等的病毒粒子;
⑤具有保护病毒粒子抵御不良环境的功能;
⑥可在细胞核或细胞质内形成。
可把昆虫病毒分成以下几类:
1.核型多角体病毒( NPV,nuclear polyhedrosis virus)
? 是一类在昆虫细胞核内增殖的、具有蛋白质包涵体的杆状病毒。
它的数量在昆虫病毒中占首位。
2.质型多角体病毒( CPV,cytoplasmic polyhedrosis virus)
? 指一类在昆虫细胞质内增殖的、具有蛋白质包涵体的一种球状
病毒。
3.颗粒体病毒( GV,granulosisvirus)
? 这是一类具有蛋白质包涵体、每个包涵体内一般仅含一个病毒
粒子的昆虫杆状病毒。