第十章 层析技术
（ Chromatography）
一, 概述
1,定义 ——也称色谱层析, 色谱, 色层；样品中各组成依据其
在固定相与流动相之间作用行为的差别进行多次分离的过程 。
2,特点 ——分离精度高, 适用范围广, 设备简单, 操作方便；
处理量小, 间歇操作等
3,发展史 ——1903年一位俄国植物学家首次提出。 1931年首
次应用于制备； 1938年适用范围扩展至无色物质； ……
石
油
醚
CaCO3颗粒
植物叶
石油醚
提取物
石
油
醚
CaCO3颗粒
1903年俄国植物学家 Tswett实验示意图
叶绿素
叶黄素
胡萝卜素
石
油
醚
二、层析法分类
1,分离机理
1) 吸附层析 ——物质吸附力差异
2) 分配层析 ——物质分配系数差异
3) 凝胶层析 ——物质分子量差异
吸附层析的种类
? 物理吸附层析
? 离子交换层析
? 亲和层析
? 疏水作用层析
? 金属螯合层析
? 有机染料层析
凝胶层析分离原理
2,固定相的形状
1) 柱层析
2) 纸层析
3) 薄板层析
3,流动相的物态
1) 气相层析
2) 液相层析
4,流动相压力
1) 低压
2) 中压
3) 高压
三、层析技术的原理和术语
1,平衡关系 ——分布系数
Cs
Kd= ———
Cm
Cs,溶质在固定相中的溶度
Cm,溶质在流动相中的溶度
溶质在固定相中的量
K’ (容量因子 )= ————————
溶质在固定相中的量
K’ = β Kd （ β为相比 ）
2,阻滞因数 （ Rf值 ）
溶质的移动速度 Am（ 流动相的平均截面积 ）Rf = ————————— = —————
流动相在色谱系统中的移动速度 Am + Kd ·As（ 固定相的平均截面积 ）
3,保留值 ——保留时间 tR,保留体积 vR
柱高 （ L）
t0（ 死时间 ） = ———— tR = t0（ 1 + k’）
线速度 （ ν）
4,分离度
tR2—tR1
R = ————
W1+ W2
5、塔板理论 ——塔板数、塔板高度
? 塔板数
tR
N = 5.54 { ————}2
W h/2
? 塔板高度
L
H = ———
N
四、柱层析系统
1,工艺流程图
2,层析柱 —径高比 （ 10,1—1,100）, 材质 （ 玻璃, 有机玻
璃, PVC,不锈钢等 ）, 耐压 （ 0.05－ 10MPa） 等
3,泵 —恒速, 压力 （ 蠕动泵, 柱塞泵等 ）
4,馏分收集仪 —手动, 自动
5,检测仪
1) 通用型 —示差折光, 介电常数, 电导等
2) 专用型 —紫外, 荧光, 放射性检测器等
6,记录仪
7,工作站 —色谱参数的选择和设定, 自动化操作, 色谱数据
的采集和存储, 并作实时处理, 数据后处理, 自动打印出一套
完整的色谱分析数据 ……
实验室用的层析柱 工业用的层析柱
自动馏分收集仪（国产） 自动馏分收集仪（进口）
蠕动泵
国产柱层析系统
伯乐公司 （ BIO-RAD） 柱层析系统
发玛西亚公司 （ Pharmacia） 柱层析系统
五、亲和层析 (Affinity Chromatography,AC)
1,定义 ——利用生物大分子与其相应互补体间特异
识别能力进行多次差别分离的过程
2,特点 ——选择性高, 操作条件温和；亲和层析剂制
备复杂, 种类少
3、常用的生物亲和关系
1) 酶 ——底物及其类似物, 抑制剂, 辅助因子
2) 抗体 ——抗原 （ 蛋白, 病毒, 细胞 ）
3) 激素 ——受体蛋白, 载体蛋白
4) 外源凝激素 ——糖蛋白, 多糖, 细胞表面受体蛋白
5) 核酸 ——互补碱基段, 核酸聚合酶, 核结合蛋白
4、亲和层析剂的制备
1) 载体 （ 骨架 ） 的选择
– 载体的要求
? 载体骨架高度亲水、惰性
? 具有大量可供活化的化学基团
? 具有较大孔径的网状结构
? 良好的化学、物理、生物稳定性
– 常用的载体
? 多糖类 （ 葡聚糖, 琼脂糖, 纤维素等 ）
? 有机聚合物 （ 聚乙烯醇, 聚丙烯酰胺等 ）
? 混合类 （ 改性硅胶, 多糖 +树脂等 ）
载体（骨架）
活化剂
配基
2）配基的选择
? 专一性配基 ——参照生物亲和关系
? 类别性配基 ——酶的辅酶 （ NAD+,NANP+,ATP等 ）, 外
源凝激素 （ 伴刀豆球蛋白 A等 ）
3）配基与载体的结合
? 载体的活化
– 溴化氰法
– 重氮化法
– 环氧氯丙烷法
– 高碘酸法
? 共价偶联反应
溴化氰法
重氮化法
高碘酸法
环氧氯丙烷法
4)亲和层析剂中“手臂”
? ―手臂”的由来
?,手臂”的种类
– 亲水性（肽链）
– 疏水性（碳链）
?,手臂”的结合方法
类似于配基的共价偶联反应
5、亲和层析分离过程
6、影响因素
? 离子强度
– 亲和力为静电力为主：离子强度 ↑,↓
– 亲和力为疏水力为主：离子强度 ↑,↑
? 抑制氢键形成的物质
? pH值
? 温度
六,免疫层析
1,定义 ——利用抗原 —抗体特异性识别能力进行差别分
离的过程。
2,抗体（配基）的制备
? 多克隆抗体 ——动物（小白兔、山羊等）整体免疫
? 单克隆抗体 ——杂交瘤技术
3,免疫层析剂制备 —类似于亲和层析剂的制备
杂交瘤技术
1,原理
B-淋巴细胞
+ → 杂交瘤细胞 → 单克隆抗体
骨髓瘤细胞
2,操作过程
? B-淋巴细胞、骨髓瘤细胞融合
? 杂交瘤细胞的规模培养
? 单克隆抗体的分离纯化
4,免疫层析应用
1) 生物药物（蛋白类药物 ——酶类、多肽类）分离
纯化
2) 药物制剂（靶向药物）
3) 临床诊断（免疫诊断试剂盒）
七、疏水作用层析
(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC )
1,定义 ——利用生物大分子疏水作用力进行多次差
别分离的过程 。
2,疏水作用层析剂及其制备
1) 功能基团 ——苯基, 醚基, 短链烷基
2) 制备方法 ——类似亲和层析剂的制备方法
3、疏水作用层析的影响因素
? 离子强度及种类
? 破坏水化作用的物质
? 表面活性剂
? 温度
4、特点
? 可直接分离盐析后的蛋白质
? 可通过调节疏水配基链长和密度改变吸附力
? 疏水性吸附剂种类多，选择余地大。
八, 有机染料亲和层析
1,定义 ——利用某些类似于 NAD+结构的有机染料
（蒽醌及偶氮化合物）作为配基制成亲和层析剂进
行差别分离过程。
2,特点 ——结合容量大；配基价廉、易得；层析
剂制备简便；化学稳定性好。
思考题
1,何谓色层分离法？ 可分为那几大类？
2,简述柱层析系统的工艺流程 。
3,何谓保留值, 分配容量 K,分离度？
4,何谓亲和色层分离法？ 亲和力的本质是什么？ 亲和色
层中常用的亲和关系有那几种？
5,何谓疏水作用层析？ 其最大的特点是什么？
6,柱层析法与固定床吸附法有何异同点？
（ Chromatography）
一, 概述
1,定义 ——也称色谱层析, 色谱, 色层；样品中各组成依据其
在固定相与流动相之间作用行为的差别进行多次分离的过程 。
2,特点 ——分离精度高, 适用范围广, 设备简单, 操作方便；
处理量小, 间歇操作等
3,发展史 ——1903年一位俄国植物学家首次提出。 1931年首
次应用于制备； 1938年适用范围扩展至无色物质； ……
石
油
醚
CaCO3颗粒
植物叶
石油醚
提取物
石
油
醚
CaCO3颗粒
1903年俄国植物学家 Tswett实验示意图
叶绿素
叶黄素
胡萝卜素
石
油
醚
二、层析法分类
1,分离机理
1) 吸附层析 ——物质吸附力差异
2) 分配层析 ——物质分配系数差异
3) 凝胶层析 ——物质分子量差异
吸附层析的种类
? 物理吸附层析
? 离子交换层析
? 亲和层析
? 疏水作用层析
? 金属螯合层析
? 有机染料层析
凝胶层析分离原理
2,固定相的形状
1) 柱层析
2) 纸层析
3) 薄板层析
3,流动相的物态
1) 气相层析
2) 液相层析
4,流动相压力
1) 低压
2) 中压
3) 高压
三、层析技术的原理和术语
1,平衡关系 ——分布系数
Cs
Kd= ———
Cm
Cs,溶质在固定相中的溶度
Cm,溶质在流动相中的溶度
溶质在固定相中的量
K’ (容量因子 )= ————————
溶质在固定相中的量
K’ = β Kd （ β为相比 ）
2,阻滞因数 （ Rf值 ）
溶质的移动速度 Am（ 流动相的平均截面积 ）Rf = ————————— = —————
流动相在色谱系统中的移动速度 Am + Kd ·As（ 固定相的平均截面积 ）
3,保留值 ——保留时间 tR,保留体积 vR
柱高 （ L）
t0（ 死时间 ） = ———— tR = t0（ 1 + k’）
线速度 （ ν）
4,分离度
tR2—tR1
R = ————
W1+ W2
5、塔板理论 ——塔板数、塔板高度
? 塔板数
tR
N = 5.54 { ————}2
W h/2
? 塔板高度
L
H = ———
N
四、柱层析系统
1,工艺流程图
2,层析柱 —径高比 （ 10,1—1,100）, 材质 （ 玻璃, 有机玻
璃, PVC,不锈钢等 ）, 耐压 （ 0.05－ 10MPa） 等
3,泵 —恒速, 压力 （ 蠕动泵, 柱塞泵等 ）
4,馏分收集仪 —手动, 自动
5,检测仪
1) 通用型 —示差折光, 介电常数, 电导等
2) 专用型 —紫外, 荧光, 放射性检测器等
6,记录仪
7,工作站 —色谱参数的选择和设定, 自动化操作, 色谱数据
的采集和存储, 并作实时处理, 数据后处理, 自动打印出一套
完整的色谱分析数据 ……
实验室用的层析柱 工业用的层析柱
自动馏分收集仪（国产） 自动馏分收集仪（进口）
蠕动泵
国产柱层析系统
伯乐公司 （ BIO-RAD） 柱层析系统
发玛西亚公司 （ Pharmacia） 柱层析系统
五、亲和层析 (Affinity Chromatography,AC)
1,定义 ——利用生物大分子与其相应互补体间特异
识别能力进行多次差别分离的过程
2,特点 ——选择性高, 操作条件温和；亲和层析剂制
备复杂, 种类少
3、常用的生物亲和关系
1) 酶 ——底物及其类似物, 抑制剂, 辅助因子
2) 抗体 ——抗原 （ 蛋白, 病毒, 细胞 ）
3) 激素 ——受体蛋白, 载体蛋白
4) 外源凝激素 ——糖蛋白, 多糖, 细胞表面受体蛋白
5) 核酸 ——互补碱基段, 核酸聚合酶, 核结合蛋白
4、亲和层析剂的制备
1) 载体 （ 骨架 ） 的选择
– 载体的要求
? 载体骨架高度亲水、惰性
? 具有大量可供活化的化学基团
? 具有较大孔径的网状结构
? 良好的化学、物理、生物稳定性
– 常用的载体
? 多糖类 （ 葡聚糖, 琼脂糖, 纤维素等 ）
? 有机聚合物 （ 聚乙烯醇, 聚丙烯酰胺等 ）
? 混合类 （ 改性硅胶, 多糖 +树脂等 ）
载体（骨架）
活化剂
配基
2）配基的选择
? 专一性配基 ——参照生物亲和关系
? 类别性配基 ——酶的辅酶 （ NAD+,NANP+,ATP等 ）, 外
源凝激素 （ 伴刀豆球蛋白 A等 ）
3）配基与载体的结合
? 载体的活化
– 溴化氰法
– 重氮化法
– 环氧氯丙烷法
– 高碘酸法
? 共价偶联反应
溴化氰法
重氮化法
高碘酸法
环氧氯丙烷法
4)亲和层析剂中“手臂”
? ―手臂”的由来
?,手臂”的种类
– 亲水性（肽链）
– 疏水性（碳链）
?,手臂”的结合方法
类似于配基的共价偶联反应
5、亲和层析分离过程
6、影响因素
? 离子强度
– 亲和力为静电力为主：离子强度 ↑,↓
– 亲和力为疏水力为主：离子强度 ↑,↑
? 抑制氢键形成的物质
? pH值
? 温度
六,免疫层析
1,定义 ——利用抗原 —抗体特异性识别能力进行差别分
离的过程。
2,抗体（配基）的制备
? 多克隆抗体 ——动物（小白兔、山羊等）整体免疫
? 单克隆抗体 ——杂交瘤技术
3,免疫层析剂制备 —类似于亲和层析剂的制备
杂交瘤技术
1,原理
B-淋巴细胞
+ → 杂交瘤细胞 → 单克隆抗体
骨髓瘤细胞
2,操作过程
? B-淋巴细胞、骨髓瘤细胞融合
? 杂交瘤细胞的规模培养
? 单克隆抗体的分离纯化
4,免疫层析应用
1) 生物药物（蛋白类药物 ——酶类、多肽类）分离
纯化
2) 药物制剂（靶向药物）
3) 临床诊断（免疫诊断试剂盒）
七、疏水作用层析
(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC )
1,定义 ——利用生物大分子疏水作用力进行多次差
别分离的过程 。
2,疏水作用层析剂及其制备
1) 功能基团 ——苯基, 醚基, 短链烷基
2) 制备方法 ——类似亲和层析剂的制备方法
3、疏水作用层析的影响因素
? 离子强度及种类
? 破坏水化作用的物质
? 表面活性剂
? 温度
4、特点
? 可直接分离盐析后的蛋白质
? 可通过调节疏水配基链长和密度改变吸附力
? 疏水性吸附剂种类多，选择余地大。
八, 有机染料亲和层析
1,定义 ——利用某些类似于 NAD+结构的有机染料
（蒽醌及偶氮化合物）作为配基制成亲和层析剂进
行差别分离过程。
2,特点 ——结合容量大；配基价廉、易得；层析
剂制备简便；化学稳定性好。
思考题
1,何谓色层分离法？ 可分为那几大类？
2,简述柱层析系统的工艺流程 。
3,何谓保留值, 分配容量 K,分离度？
4,何谓亲和色层分离法？ 亲和力的本质是什么？ 亲和色
层中常用的亲和关系有那几种？
5,何谓疏水作用层析？ 其最大的特点是什么？
6,柱层析法与固定床吸附法有何异同点？
