1
6.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
一, 灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数 (?)
A= ? b c ? =A/bc (L·mol-1·cm-1)
? 越大,灵敏度越高,
? 104～ 5× 104 为中等灵敏度 ;
? >105为高灵敏度 ; ? <104为低灵敏度,
2
例 1 邻二氮菲光度法测铁
?(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38
计算 ?和
解,c(Fe)=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5mol/L
1%
1cmE
?
? ×
4 - 1 - 1
-5
0,38= = 1,1 10 L m o l cm
2 1,8 10
?
3
c =1.0mg/L=1.0× 10-3 g /1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA= E
??1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
??1%1cm 53= 1 0 = 1, 1 1 0 / 5 5, 8 5 =o 1, 9 1 0r E / M?
4
二, 准确度 — 仪器测量误差
光度计的读数误
差一般为
0.2～ 2％ (ΔT),
由于 T与浓度 c
不是线性关系，
故不同浓度时
的 ΔT引起的误
差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
?c1 ?c2 ?c3
?T
?T
?T-透光率读数误差
c
?c1
c1
?c2
c2
?c3
c3> <
5
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er
r
0.43 4
lg
( 0.01 )
cTE
c T T
T
????
??
(36.8)
0.434
浓度测
量的相
对误差
与 T(或 A)
的关系
实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,
A在 0.15～ 1.0之间 (调 c,b,?)
6
6.4 显色反应与分析条件的选择
：：
：
：
助色团 － NH2，－ OH，－ X （孤对电子） ne
6.4.1 显色剂与显色反应
O
生色团, － N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （共轭双键） πe
无机显色剂, SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
7
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型, PAR
NH NH
N
S
NS型,
双硫腙
NN型,丁二
酮肟
邻二
氮菲
磺基水杨酸
8
显色反应的选择
*灵敏度高,一般 ε >104
*选择性好
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
对照性好,?λ max>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定 。
*显色条件易于控制,重现性好 。
9
6.4.2 显色条件的确定
c(R) c(R) c(R)
1,显色剂用量 （ c(M),pH一定）
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
10
2,显色反应酸度 （ c(M),c(R)一定）
pH1<pH<pH2
pH
11
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
?
?
??
??
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
? ? ?? ? ? ?
H＋H＋A柠檬酸
c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
12
3[F e R ]lg
[ F e ]?
pH3～ 8为适宜
的酸度范围
13
3,显色温度及显色时间
另外，还有介质条件、有机溶剂、
表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
14
6.4.3 干扰及消除
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+ Co(SCN)
2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+), (掩蔽法 )
1.化学法
15
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
测 Co2＋,(生成络合物性质不同 )
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，
则需采取分离法。
测 Fe3＋,(控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5 SS
16
2,物理法
— 选择适当的测定波长
515 655 415 500
钍 -偶氮砷 III 钴 -亚硝基红盐
A A
络合物
络合物
试剂
试剂
17
1,仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen— Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收, 被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3,显色剂或其他试剂也有吸收,空白溶液 作参比
例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂 。
4,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
1） 掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比,
2） 加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比,
-- 选择适当的参比溶液
18
6.5 吸光光度法的应用
1,单一组分测定
1) 金属离子, Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定, DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～ 9.5%,
可得核酸量,
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
19
3) 蛋白质测定 — 溴甲酚绿、考马司亮蓝等
4) 氨基酸测定 — 茚三酮 (紫色化合物 )
5) 水质检测, NH4+,NO2-,Mn2+,Fe2+、
SO42-,Hg2+----
6) 药物含量测定 — 比吸光系数定量；荷移
光谱法测定,
7) 紫外吸收 (UV),NO2-,NO3-,SO42-、
SO32-,CO32-,SCN-、酪氨酸、色氨酸、
苯丙氨酸、蛋白质等。
20
2,多组分的测定
?x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液
在 ?1,?2处分别测得
a) 在 ?1处测组分 x,在 ?2处测组分 y
b) 在 ?1处测组分 x; 在 ?2处测总吸
收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+ ?y?1bcy(在 ?1处测得 A1)
A2 =?x?2bcx+ ?y?2bcy(在 ?2处测得 A2)
21
3,络合物组成的测定
(1)摩尔比法, 固定 cM,改变 cR
1:1 3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
22
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R M R nn?
MR (c c c ）?? 常数
23
表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/c
M:R=1:1
A0
A
0
0
-= A A
A ?
c(M)=c(R)=c
)?
?? 2
[ M R ] ( 1 - 1 -= = =
[ M ] [ R ]
cK
cc c
??
?? ?
MmRn型?
24
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600 ?/nm
A曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一
对 pH,A，可求
得一个 Ka,取平
均值即可,
25
MO离解常数的测定
作图法 LHLap p H l g AAK AA??? ?
H L L2AAA ??
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA? ? 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA ????
?
?
??
3.34
26
6.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系, 吸收曲线 — 定
性分析的基础 。
定量分析的基础 — 朗伯 -比尔定律,A=?bc=-lgT 式中各参
数的物理意义, 定量计算 。
6.2 了解目视比色法, 分光光度法的特点, 分光光度计的
基本部件 。
6.3 灵敏度的表示 — 摩尔吸光系数的意义和计算 ；
准确度 — 适宜的测量范围, 偏离比尔定律的原因 。
6.4 显色反应及条件的确定, 显色剂用量, 酸度, 时间,
温度, 干扰及消除 。
6.5 应用, 单一组分测定示例, 多组分测定, 光度滴定,
络合物组成的测定, 酸碱离解常数的测定 。
第六章 小 结
27
28
6.3 吸光光度法的灵敏度与准确度
一, 灵敏度的表示方法,摩尔吸光系数 (?)
A= ? b c ? =A/bc (L·mol-1·cm-1)
? 越大,灵敏度越高,
? 104～ 5× 104 为中等灵敏度 ;
? >105为高灵敏度 ; ? <104为低灵敏度,
2
例 1 邻二氮菲光度法测铁
?(Fe)=1.0mg/L,b=2cm,A=0.38
计算 ?和
解,c(Fe)=1.0 mg/L=1.0× 10-3/55.85
=1.8× 10-5mol/L
1%
1cmE
?
? ×
4 - 1 - 1
-5
0,38= = 1,1 10 L m o l cm
2 1,8 10
?
3
c =1.0mg/L=1.0× 10-3 g /1000mL
= 1.0× 10-4g/100mL
bc1%1cmA= E
??1% m 431c -= 0,38 /2,0 10 = 1,9 10E
??1%1cm 53= 1 0 = 1, 1 1 0 / 5 5, 8 5 =o 1, 9 1 0r E / M?
4
二, 准确度 — 仪器测量误差
光度计的读数误
差一般为
0.2～ 2％ (ΔT),
由于 T与浓度 c
不是线性关系，
故不同浓度时
的 ΔT引起的误
差不同。
100
80
60
40
20
0
T%
?c1 ?c2 ?c3
?T
?T
?T-透光率读数误差
c
?c1
c1
?c2
c2
?c3
c3> <
5
10
8
6
4
2
0 20 40 60 800.7 0.4 0.2 0.1 AT%
Er
r
0.43 4
lg
( 0.01 )
cTE
c T T
T
????
??
(36.8)
0.434
浓度测
量的相
对误差
与 T(或 A)
的关系
实际工作中，应控制 T在 10～ 70％,
A在 0.15～ 1.0之间 (调 c,b,?)
6
6.4 显色反应与分析条件的选择
：：
：
：
助色团 － NH2，－ OH，－ X （孤对电子） ne
6.4.1 显色剂与显色反应
O
生色团, － N＝ N－，－ N＝ O，
OC=S,－ N （共轭双键） πe
无机显色剂, SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂,
7
有机显色剂
CH3－ C－ C－ CH3
HO－ N N－ OH
＝ ＝
NN
OH
COOH
SO3H
OO型：
N
N N OH
OH
ON型, PAR
NH NH
N
S
NS型,
双硫腙
NN型,丁二
酮肟
邻二
氮菲
磺基水杨酸
8
显色反应的选择
*灵敏度高,一般 ε >104
*选择性好
*显色剂在测定波长处无明显吸收。
对照性好,?λ max>60 nm,
*反应生成的有色化合物 组成恒定，稳定 。
*显色条件易于控制,重现性好 。
9
6.4.2 显色条件的确定
c(R) c(R) c(R)
1,显色剂用量 （ c(M),pH一定）
Mo(SCN)32+ 浅红
Mo(SCN)5 橙红
Mo(SCN)6- 浅红
Fe(SCN)n3-n
10
2,显色反应酸度 （ c(M),c(R)一定）
pH1<pH<pH2
pH
11
邻二氮菲－亚铁反应完全度与 pH的关系
Fe2++3R
R ( H )Fe ( A )
33
33
3
[ F e R ]
'
[ F e '] [ R ']
?
?
??
??
3
3 F e ( A ) R ( H )
[ F e R ]lg lg lg 3 lg 3 lg [ R ' ]
[ F e ']
? ? ?? ? ? ?
H＋H＋A柠檬酸
c(R)≈[R′]=10-4mol·L-1
β3＝ 1021.3β3 FeR3
12
3[F e R ]lg
[ F e ]?
pH3～ 8为适宜
的酸度范围
13
3,显色温度及显色时间
另外，还有介质条件、有机溶剂、
表面活性剂等
T1(℃ )
T2(℃ )
t(min)
A
14
6.4.3 干扰及消除
Co2＋,Fe3+ Co
2+
FeF63- Co(SCN)2 (蓝 )
⑴ NaF SCN－
Co2+
Fe2+,Sn4+
(2)Sn2+ Co(SCN)
2
SCN－
测 Co2＋ (含 Fe3+), (掩蔽法 )
1.化学法
15
Co2+,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
CoR,ZnR
NiR,FeR
CoR,Zn2+,
Ni2+,Fe2+
钴试剂 R H+
测 Co2＋,(生成络合物性质不同 )
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，
则需采取分离法。
测 Fe3＋,(控制 pH)
Fe3+,Cu2+ FeSS （紫红）Cu2+pH 2.5 SS
16
2,物理法
— 选择适当的测定波长
515 655 415 500
钍 -偶氮砷 III 钴 -亚硝基红盐
A A
络合物
络合物
试剂
试剂
17
1,仅络合物有吸收,溶剂 作参比。
如 phen— Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收, 被测液 作参比。
如 测汽水中的 Fe
3,显色剂或其他试剂也有吸收,空白溶液 作参比
例,邻二氮菲光度法测 Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含 Li2CO3样品的所有试剂 。
4,干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：
1） 掩蔽被测组分,再加入显色剂，作参比,
2） 加入等量干扰组分 到空白溶液中,作参比,
-- 选择适当的参比溶液
18
6.5 吸光光度法的应用
1,单一组分测定
1) 金属离子, Fe-phen,Ni-丁二酮肟,Co-钴试剂
2) 磷的测定, DNA中含 P～ 9.2%,RNA中含 P～ 9.5%,
可得核酸量,
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄 (?小 )
磷钼 (V)蓝 (?大 )
Sn2+
19
3) 蛋白质测定 — 溴甲酚绿、考马司亮蓝等
4) 氨基酸测定 — 茚三酮 (紫色化合物 )
5) 水质检测, NH4+,NO2-,Mn2+,Fe2+、
SO42-,Hg2+----
6) 药物含量测定 — 比吸光系数定量；荷移
光谱法测定,
7) 紫外吸收 (UV),NO2-,NO3-,SO42-、
SO32-,CO32-,SCN-、酪氨酸、色氨酸、
苯丙氨酸、蛋白质等。
20
2,多组分的测定
?x?1,?y?1,?x?2,?y?2由 x,y标液
在 ?1,?2处分别测得
a) 在 ?1处测组分 x,在 ?2处测组分 y
b) 在 ?1处测组分 x; 在 ?2处测总吸
收,扣除 x吸收,可求 y
c) x,y组分不能直接测定
A1=?x?1bcx+ ?y?1bcy(在 ?1处测得 A1)
A2 =?x?2bcx+ ?y?2bcy(在 ?2处测得 A2)
21
3,络合物组成的测定
(1)摩尔比法, 固定 cM,改变 cR
1:1 3:1
c(R)/c(M)
A
1.0 2.0 3,0
22
(2)等摩尔连续变化法,
M:R=1:1
0.5 0.33
cM/c cM/c
M:R=1:2
M R M R nn?
MR (c c c ）?? 常数
23
表观形成常数的测定 (设 M,R均无吸收 )
0.5
cM/c
M:R=1:1
A0
A
0
0
-= A A
A ?
c(M)=c(R)=c
)?
?? 2
[ M R ] ( 1 - 1 -= = =
[ M ] [ R ]
cK
cc c
??
?? ?
MmRn型?
24
MO吸收曲线
Aa(HL)
Ab
(L)
1
2
3
4
5
6A
b65
4
32
1A
a
350 400 450 500 550 600 ?/nm
A曲线 pH
1 1.10,1.38
2 2.65
3 3.06
4 3.48
5 3.98
6 5.53,6.80
由每份溶液的一
对 pH,A，可求
得一个 Ka,取平
均值即可,
25
MO离解常数的测定
作图法 LHLap p H l g AAK AA??? ?
H L L2AAA ??
AHL
3.32(pKa)
1 2 3 4 5 6
A
pH=pKa
pH
pHA 曲线
AL
L
HL
l g p HAAAA? ? 曲线
0.6
0.4
0.2
0
-0.2
-0.4
-0.6
3.0 4.0 pH
HL
L [ H L ]lg g [L ]l AAAA ????
?
?
??
3.34
26
6.1 了解分子对光的吸收与溶液颜色的关系, 吸收曲线 — 定
性分析的基础 。
定量分析的基础 — 朗伯 -比尔定律,A=?bc=-lgT 式中各参
数的物理意义, 定量计算 。
6.2 了解目视比色法, 分光光度法的特点, 分光光度计的
基本部件 。
6.3 灵敏度的表示 — 摩尔吸光系数的意义和计算 ；
准确度 — 适宜的测量范围, 偏离比尔定律的原因 。
6.4 显色反应及条件的确定, 显色剂用量, 酸度, 时间,
温度, 干扰及消除 。
6.5 应用, 单一组分测定示例, 多组分测定, 光度滴定,
络合物组成的测定, 酸碱离解常数的测定 。
第六章 小 结
27
28
