考试 6
? 1.X,γ 射线的杀菌机理是什么？
? 2.氧化剂的杀菌机理是什么？
? 3.福尔马林的主要成分是什么？
? 4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓
度是多少？
? 5.青霉素的抗菌机理是什么？
? 6.直接计数法的特点是什么？有哪些具
体方法？
4．比浊计数法
?浊 —— 细菌悬浮液的浊度
? 细菌不完全透光, 一定范围内 菌溶液的混浊度与
菌数量成 正比
（ 1）制标准曲线（ OD~No）
? （ 2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量
分光光度法测
浊度 1 2 3 4
其他细菌计数法
细菌数量 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 个 / mL
细菌数量
制标准曲线
菌液浊度
浊度仪
或 721
分光光
度仪
（二）间接计数法 (活菌计数法 )
? 提问,前述方法中计数的不都是活菌, 如何分辨菌死活？
?繁殖
? 提问,细菌繁殖的可见现象是什么？
? 产生菌落 （ 固体培养基培养 ）, 菌液混浊 （ 液体培养基培养 ）
? 计数原理, 一个 细菌 可繁殖成 一个 菌落 或 一群细菌,
? 缺点,慢
? 分 固体培养法和液体培养法
无菌水
?1,稀释平板计数法 — 固体培养法
第一步：菌样巧妙稀释
1 m L 混合 1m L 混合
9m L 10 m L
1, 10
-1
10
-1
, 10
-2
10
- 2
10
- 3
10
-4
10
-5
得到不同
稀释度
（ 10-x）
菌液
菌样被
无菌水
不同稀
释倍率
后 平板
培养图
10-2 10 -3 10-4 10 -5
各取 1ml,均匀 涂布 于
冷固体培养基平板上或
与温热液态固体培养基
混合 冷却 。
第三步：培养
稀 释 度
过低,
菌 落 密
集 无 法
计数
可以计数
,但数量
过多, 费
时费力
数量合
适，统
计计算，
作为结
果
数 量 太 少
,误 差 因
素 太 大,
不做计数
第二步：接种平板
每一个细菌会生成一个
菌落
? 一般计数平板的细菌生长菌落数以 30~300个为
宜 。
? 第四步, 计数
? 细菌数量 =？
? 细菌数量 =数出的菌落数 /稀释度
? 例如,10-5稀释度时菌落数为 125个
? 细菌数量 =125/10-5=1.25× 107个 /mL
? 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
? 如国标法水中 细菌总数 的测定 。
? 注意,作空白及取平行样 （ 2～ 3组 ） 均值减小
误差
平
均
2.稀释液体计数法
? 特点,液体培养, 统计学查表计数
? 又称 MPN法 （ 或最可能数法 ）
?Most Probable Number
? 例如 测定 SRB（ 硫酸盐还原菌, 厌氧 ） 的数量
? 提问,能用稀释平板法计数吗？ 为什么？
? 一般 不能, 厌氧菌暴露在空气中不能生长 （ 除非厌氧
培养箱 ）
?对这类菌可以利用它们生长时产生的 硫化亚铁黑色特征 进
行 深层隔氧液体培养,按 MPN法进行计数。
3 3 2 0
10 -4 10-5 10 -63 10-
10-2 10-3 10-4 10-5
（ 1）稀释
（ 2）稀释接种样品
在液体表面加一层无菌
液体石蜡隔绝氧气，
恒温 37℃ 培养 14天
记录变黑的试管情况
（ 3）培养
1ml
+
9ml
培
养
基
?提问,为什么有些试
管变黑有些没有？
?稀释程度、取样概率
(4)统计－查表－计算
? 根据 不同稀释度变黑试管
? ① 统计出 数量指标
? 三 位数及其中 最低稀释度
? （取 变黑的管数最多, 稀释度又最低 的 生长管
数,为 第一位 数字,后面两个稀释度的 生长管
数 后两位数）
? 提问,上例情况而言统计数量是几？
? ② 查表
? 表 —— MPN表
320 10-4
MPN三管法测数统计表
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
000 0,0 12 1 1,5 22 3 4,0 32 0 9,5
00 1 0,3 13 0 1,6 23 0 3,0 32 1 15, 0
01 0 0,3 20 0 0,9 23 1 3,5 32 2 20, 0
02 0 0,6 20 1 1,4 23 2 4,0 32 3 30, 0
10 0 0,6 20 2 2,0 30 0 2,5 33 0 25, 0
10 1 0,4 21 0 1,5 30 1 4,0 33 1 45, 0
1 1 0 0,7 21 1 2,0 30 2 6,5 33 2 1 10, 0
10 2 1,1 21 2 3,0 31 0 4,5 33 3 14 0,0
1 10 0,7 22 0 2,0 31 1 7,5
1 1 1 1,1 22 1 3,0 31 2 1 1,5
12 0 1,1 22 2 3,5 31 3 16, 0
水中大肠菌群, 铁细菌、硝化菌、亚硝化菌 也
用这种方法进行数量统计。
个菌 /毫升
?细菌最可能数 —— 通过其他精确的计数法，确定
的各种 数量指标 时 细菌数量的最可能值
上面例子中数量指标,320” 对应的细菌最可能数为 9.5个菌 /毫升,
最低稀释度为 10-4，
折算出样品中菌浓度为？ 个菌 /毫升。
3.薄膜计数法
? 薄膜 —— 微孔滤膜
（ φ0.45um）
（ 2）滤膜培养
膜有菌面冲上
? 原理 —— 膜抽滤 （细菌
浓缩） + 膜平板培养 +
计数
滤膜,细菌不能通过
支撑体,支撑滤膜
抽气
（ 1） 抽滤
（滤器及膜事先灭菌）
? （ 3） 统计计数
? 提问,假如 测出 250个菌落, 抽滤了 50ml自来水,
自来水中菌浓度是多少呢？
? 250÷ 50ml=5个 /ml自来水
? 样品中的细菌数量 =菌落数 ÷ 抽滤样品的体积数
? 要求 —— 样品洁净
? 如空气或饮用水 。
？
? 堵孔、菌太多难以分散
? 提问,如何用活菌计数法测定较脏的水样？
? 减少滤液体积, 无菌水稀释
(三 )重量法
? 提问：已知什么条件 通过测定细菌群体重量知道其数量？
? 已知 单个细菌的平均重量 除法计算
? 细菌的 湿 重量＝ 10-15~10-11g/个细胞
? 干重约为 湿重的 10％ ~20％ 。
? 1,干重法
? 方法,含菌水样在 105～ 110℃ 下进行干燥恒重 （ 本质测
水中悬浮物重量 MLSS或 MLVSS） 。
? 悬浮物＝无机物 +有机物 （ 包括细菌 ）
? 提问,如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？
? 高温 (550℃ )灼烧
? 无机物化学性质稳定, 高温下不会分解
? 提问,什么情况下可以直接用悬浮物的重量表
示细菌的重量？
?悬浮物中绝大多数是细菌 。
（ 1）悬浮物中绝大多数为细菌时
? 细胞数目 =MLSS÷ 个体细菌的平均干重量
离心沉淀
滤膜过滤
计算
105~110 ℃
下进行干燥
恒重称重
或
MLSS悬浮物
（ 2）除细菌外还有大量无机悬浮物时
? W
无
? MLVSS挥发性悬浮物 ＝ MLSS－ W无 =细菌群体的干重量
? 细胞数目 = MLVSS÷ 个体细菌的平均干重量
550 ℃
下灼烧
2h
称重105~110℃ 下进
行干燥恒重
称重
MLSS
（ 3）有大量 非细菌有机悬浮物 时
?提问,如何测定呢？
? 不能用重量法, 应改用其他方法 。
?总体来说 重量法 方法 误差较大,
一般只作为菌数粗略估算
?如 活性污泥测定 （ 以重量 MLSS、
MLVSS间接表示细菌数量 ）
2.细胞含 N量法
? 大多数生物包括细菌, 细胞内的 蛋白质氮含量
比较稳定, 一般为蛋白质干重 15％ ~16％, 平均
为 16％ 。
? ＊ 还需要 测定哪些条件 可以由以上比例确
定 菌样 中细菌浓度？ 如何试验操作 及 计算
呢？
3.DNA含量法
? 同种细菌的 DNA含量一致,可通过测定 DNA的含量
来表示细菌的生长量
? 少量纯细菌培养时
细菌数量的测定 。
? 精确性非常高,对
样品纯度以及仪器
和人员的要求较高，
? 总污染物 影响促反应的方程表达式 ——
? v——总污染物微生物利用速度；
?V— （ KX)— 最大速度；
?X— 微生物浓度
? Ks－ 饱和常数
mKS
VS
?
?? Ks
劳伦斯方程
忽略
KXKX
(四 )其它生理生化 指标 法
提问, v指什么？
COD降解 v O2消耗 v＆ ＆ 产物产生 v
？求
作试验！
? 提问,当你需要测定某水样中细菌数量时, 你
该如何选择方法？
视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取
?,生, 老, 病, 死,
? （ 根据投食方式 ） 分 间歇式培养 （ 分批培养 ）,
连续式培养 两种情况
? 1.间歇培养
? 提问,如何人工进行细菌间歇培养？
? 只有开始时的 一次性投料和接种细菌 （ 其余时间
细菌根据环境变化自行生灭 ）
二、细菌的生长特性
（“坐吃山空型”）
应用, 生理特性研究、生物发酵和生物治污
（ 1）活细菌重量变化曲线
曲线, 群体重量 W(mg/l)—— 时间 t
细菌 内源呼吸增长率 上
升 阶段 及细菌大量 死亡 阶段
mg/L 活
细
菌
重
量
t0 时间
曲线 t`点切线斜率值 =?
t`重量增长速率
t`
增长率 下
降 阶段
生长情况用活细菌生长曲线来描述
①增长速率上升阶段
? 提问,为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不
断增大？
? A.营养物丰富,细菌增殖； B.细菌在细胞内以糖原、油
滴等形式 储存营养物,细菌 个体重量增大
增长率 生
上升阶段
mg/mL
0 时间 t
活
细
胞
重
量
②增长速率下降阶段
? 提问,为什么增长速率 较前 下降了？
增长率 下
降 阶段
mg/mL
0 时间 t
活
细
胞
重
量
? 营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
? 这些限制性因素还不
是十分严重，细菌的代
谢速度变慢，没有停止
? 代谢产物积累 对细菌的某些酶产生抑制
③内源呼吸及死亡阶段
? ——— 内源呼吸 +毒物浓度更高
? （ 个体 ） 瘦 → 死
? （ 群体 ） 死亡率大于出生率
? 从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降 。
? 提问,此时细菌的出生率是否为零呢？ 为什么？
? 不是, 利用死亡细菌的残体营养 (“化做红泥更护花或人吃人” )
? 各种生物具有类似的规律
? 实验室通常采用细菌的 数量变化绘制生长曲线,虽然两种曲
线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途 。
? 1.X,γ 射线的杀菌机理是什么？
? 2.氧化剂的杀菌机理是什么？
? 3.福尔马林的主要成分是什么？
? 4.乙醇杀菌机理是什么？其最佳杀菌浓
度是多少？
? 5.青霉素的抗菌机理是什么？
? 6.直接计数法的特点是什么？有哪些具
体方法？
4．比浊计数法
?浊 —— 细菌悬浮液的浊度
? 细菌不完全透光, 一定范围内 菌溶液的混浊度与
菌数量成 正比
（ 1）制标准曲线（ OD~No）
? （ 2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量
分光光度法测
浊度 1 2 3 4
其他细菌计数法
细菌数量 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 个 / mL
细菌数量
制标准曲线
菌液浊度
浊度仪
或 721
分光光
度仪
（二）间接计数法 (活菌计数法 )
? 提问,前述方法中计数的不都是活菌, 如何分辨菌死活？
?繁殖
? 提问,细菌繁殖的可见现象是什么？
? 产生菌落 （ 固体培养基培养 ）, 菌液混浊 （ 液体培养基培养 ）
? 计数原理, 一个 细菌 可繁殖成 一个 菌落 或 一群细菌,
? 缺点,慢
? 分 固体培养法和液体培养法
无菌水
?1,稀释平板计数法 — 固体培养法
第一步：菌样巧妙稀释
1 m L 混合 1m L 混合
9m L 10 m L
1, 10
-1
10
-1
, 10
-2
10
- 2
10
- 3
10
-4
10
-5
得到不同
稀释度
（ 10-x）
菌液
菌样被
无菌水
不同稀
释倍率
后 平板
培养图
10-2 10 -3 10-4 10 -5
各取 1ml,均匀 涂布 于
冷固体培养基平板上或
与温热液态固体培养基
混合 冷却 。
第三步：培养
稀 释 度
过低,
菌 落 密
集 无 法
计数
可以计数
,但数量
过多, 费
时费力
数量合
适，统
计计算，
作为结
果
数 量 太 少
,误 差 因
素 太 大,
不做计数
第二步：接种平板
每一个细菌会生成一个
菌落
? 一般计数平板的细菌生长菌落数以 30~300个为
宜 。
? 第四步, 计数
? 细菌数量 =？
? 细菌数量 =数出的菌落数 /稀释度
? 例如,10-5稀释度时菌落数为 125个
? 细菌数量 =125/10-5=1.25× 107个 /mL
? 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法
? 如国标法水中 细菌总数 的测定 。
? 注意,作空白及取平行样 （ 2～ 3组 ） 均值减小
误差
平
均
2.稀释液体计数法
? 特点,液体培养, 统计学查表计数
? 又称 MPN法 （ 或最可能数法 ）
?Most Probable Number
? 例如 测定 SRB（ 硫酸盐还原菌, 厌氧 ） 的数量
? 提问,能用稀释平板法计数吗？ 为什么？
? 一般 不能, 厌氧菌暴露在空气中不能生长 （ 除非厌氧
培养箱 ）
?对这类菌可以利用它们生长时产生的 硫化亚铁黑色特征 进
行 深层隔氧液体培养,按 MPN法进行计数。
3 3 2 0
10 -4 10-5 10 -63 10-
10-2 10-3 10-4 10-5
（ 1）稀释
（ 2）稀释接种样品
在液体表面加一层无菌
液体石蜡隔绝氧气，
恒温 37℃ 培养 14天
记录变黑的试管情况
（ 3）培养
1ml
+
9ml
培
养
基
?提问,为什么有些试
管变黑有些没有？
?稀释程度、取样概率
(4)统计－查表－计算
? 根据 不同稀释度变黑试管
? ① 统计出 数量指标
? 三 位数及其中 最低稀释度
? （取 变黑的管数最多, 稀释度又最低 的 生长管
数,为 第一位 数字,后面两个稀释度的 生长管
数 后两位数）
? 提问,上例情况而言统计数量是几？
? ② 查表
? 表 —— MPN表
320 10-4
MPN三管法测数统计表
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
数量
指标
细菌最
可能数
000 0,0 12 1 1,5 22 3 4,0 32 0 9,5
00 1 0,3 13 0 1,6 23 0 3,0 32 1 15, 0
01 0 0,3 20 0 0,9 23 1 3,5 32 2 20, 0
02 0 0,6 20 1 1,4 23 2 4,0 32 3 30, 0
10 0 0,6 20 2 2,0 30 0 2,5 33 0 25, 0
10 1 0,4 21 0 1,5 30 1 4,0 33 1 45, 0
1 1 0 0,7 21 1 2,0 30 2 6,5 33 2 1 10, 0
10 2 1,1 21 2 3,0 31 0 4,5 33 3 14 0,0
1 10 0,7 22 0 2,0 31 1 7,5
1 1 1 1,1 22 1 3,0 31 2 1 1,5
12 0 1,1 22 2 3,5 31 3 16, 0
水中大肠菌群, 铁细菌、硝化菌、亚硝化菌 也
用这种方法进行数量统计。
个菌 /毫升
?细菌最可能数 —— 通过其他精确的计数法，确定
的各种 数量指标 时 细菌数量的最可能值
上面例子中数量指标,320” 对应的细菌最可能数为 9.5个菌 /毫升,
最低稀释度为 10-4，
折算出样品中菌浓度为？ 个菌 /毫升。
3.薄膜计数法
? 薄膜 —— 微孔滤膜
（ φ0.45um）
（ 2）滤膜培养
膜有菌面冲上
? 原理 —— 膜抽滤 （细菌
浓缩） + 膜平板培养 +
计数
滤膜,细菌不能通过
支撑体,支撑滤膜
抽气
（ 1） 抽滤
（滤器及膜事先灭菌）
? （ 3） 统计计数
? 提问,假如 测出 250个菌落, 抽滤了 50ml自来水,
自来水中菌浓度是多少呢？
? 250÷ 50ml=5个 /ml自来水
? 样品中的细菌数量 =菌落数 ÷ 抽滤样品的体积数
? 要求 —— 样品洁净
? 如空气或饮用水 。
？
? 堵孔、菌太多难以分散
? 提问,如何用活菌计数法测定较脏的水样？
? 减少滤液体积, 无菌水稀释
(三 )重量法
? 提问：已知什么条件 通过测定细菌群体重量知道其数量？
? 已知 单个细菌的平均重量 除法计算
? 细菌的 湿 重量＝ 10-15~10-11g/个细胞
? 干重约为 湿重的 10％ ~20％ 。
? 1,干重法
? 方法,含菌水样在 105～ 110℃ 下进行干燥恒重 （ 本质测
水中悬浮物重量 MLSS或 MLVSS） 。
? 悬浮物＝无机物 +有机物 （ 包括细菌 ）
? 提问,如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？
? 高温 (550℃ )灼烧
? 无机物化学性质稳定, 高温下不会分解
? 提问,什么情况下可以直接用悬浮物的重量表
示细菌的重量？
?悬浮物中绝大多数是细菌 。
（ 1）悬浮物中绝大多数为细菌时
? 细胞数目 =MLSS÷ 个体细菌的平均干重量
离心沉淀
滤膜过滤
计算
105~110 ℃
下进行干燥
恒重称重
或
MLSS悬浮物
（ 2）除细菌外还有大量无机悬浮物时
? W
无
? MLVSS挥发性悬浮物 ＝ MLSS－ W无 =细菌群体的干重量
? 细胞数目 = MLVSS÷ 个体细菌的平均干重量
550 ℃
下灼烧
2h
称重105~110℃ 下进
行干燥恒重
称重
MLSS
（ 3）有大量 非细菌有机悬浮物 时
?提问,如何测定呢？
? 不能用重量法, 应改用其他方法 。
?总体来说 重量法 方法 误差较大,
一般只作为菌数粗略估算
?如 活性污泥测定 （ 以重量 MLSS、
MLVSS间接表示细菌数量 ）
2.细胞含 N量法
? 大多数生物包括细菌, 细胞内的 蛋白质氮含量
比较稳定, 一般为蛋白质干重 15％ ~16％, 平均
为 16％ 。
? ＊ 还需要 测定哪些条件 可以由以上比例确
定 菌样 中细菌浓度？ 如何试验操作 及 计算
呢？
3.DNA含量法
? 同种细菌的 DNA含量一致,可通过测定 DNA的含量
来表示细菌的生长量
? 少量纯细菌培养时
细菌数量的测定 。
? 精确性非常高,对
样品纯度以及仪器
和人员的要求较高，
? 总污染物 影响促反应的方程表达式 ——
? v——总污染物微生物利用速度；
?V— （ KX)— 最大速度；
?X— 微生物浓度
? Ks－ 饱和常数
mKS
VS
?
?? Ks
劳伦斯方程
忽略
KXKX
(四 )其它生理生化 指标 法
提问, v指什么？
COD降解 v O2消耗 v＆ ＆ 产物产生 v
？求
作试验！
? 提问,当你需要测定某水样中细菌数量时, 你
该如何选择方法？
视要求、水样菌量、测试条件等等灵活选取
?,生, 老, 病, 死,
? （ 根据投食方式 ） 分 间歇式培养 （ 分批培养 ）,
连续式培养 两种情况
? 1.间歇培养
? 提问,如何人工进行细菌间歇培养？
? 只有开始时的 一次性投料和接种细菌 （ 其余时间
细菌根据环境变化自行生灭 ）
二、细菌的生长特性
（“坐吃山空型”）
应用, 生理特性研究、生物发酵和生物治污
（ 1）活细菌重量变化曲线
曲线, 群体重量 W(mg/l)—— 时间 t
细菌 内源呼吸增长率 上
升 阶段 及细菌大量 死亡 阶段
mg/L 活
细
菌
重
量
t0 时间
曲线 t`点切线斜率值 =?
t`重量增长速率
t`
增长率 下
降 阶段
生长情况用活细菌生长曲线来描述
①增长速率上升阶段
? 提问,为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不
断增大？
? A.营养物丰富,细菌增殖； B.细菌在细胞内以糖原、油
滴等形式 储存营养物,细菌 个体重量增大
增长率 生
上升阶段
mg/mL
0 时间 t
活
细
胞
重
量
②增长速率下降阶段
? 提问,为什么增长速率 较前 下降了？
增长率 下
降 阶段
mg/mL
0 时间 t
活
细
胞
重
量
? 营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降
? 这些限制性因素还不
是十分严重，细菌的代
谢速度变慢，没有停止
? 代谢产物积累 对细菌的某些酶产生抑制
③内源呼吸及死亡阶段
? ——— 内源呼吸 +毒物浓度更高
? （ 个体 ） 瘦 → 死
? （ 群体 ） 死亡率大于出生率
? 从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降 。
? 提问,此时细菌的出生率是否为零呢？ 为什么？
? 不是, 利用死亡细菌的残体营养 (“化做红泥更护花或人吃人” )
? 各种生物具有类似的规律
? 实验室通常采用细菌的 数量变化绘制生长曲线,虽然两种曲
线在本质上是相同的，但数量曲线也有它自身的特点和用途 。
